高速剪切協同熱處理對豌豆蛋白性質的影響

潘月影，許娜娜，蘇夢香，季慧*

（1.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；2.青島市糧油質量檢測和軍隊供應中心，山東 青島 266071）

豌豆又叫寒豆、雪豆，在我國中部及東北部地區有大量種植，其產量在豆類農作物中排名第四，食用性僅次于大豆。除了食用，國內對豌豆的深加工主要是從中提取淀粉，用于制作粉絲，加工過程中的副產物豌豆蛋白在豌豆中含量很高，約占豌豆干重的23.3%～31.7%[1]，其作為一種植物源蛋白具有低脂、低熱量、低致敏性和高營養價值[2]等特點。豌豆蛋白氨基酸組成比較平衡，是賴氨酸等必需氨基酸的良好來源，生物價為48%～64%，功效比為0.6～1.2，高于大豆蛋白[3]。豌豆蛋白因其突出的特點，近年來成為食品行業的焦點。然而豌豆蛋白的功能性質較差，加熱過程中易變性，溶解性降低[4]，限制了其在食品行業的應用，因此尋求一種安全可靠的方法來提高豌豆蛋白的溶解性，是增加其蛋白資源附加值和擴大豌豆產業鏈的關鍵。

為了提高蛋白的溶解性，國內外學者研究了一系列的蛋白改性方法，最常見的是物理方法、化學方法和酶法，包括超聲處理[5]、動態高壓微流化[6]、微粉化[7]、熱處理[8]、酶解[9]等。物理改性方法是價格低廉型、環境友好型、安全無毒型的蛋白質處理方法，在蛋白質加工中被廣泛應用?；瘜W改性可能會產生有毒的副產物；酶法改性作用條件溫和，專一性強，不會破壞蛋白質原有的功能性質，實用性強。

目前，對豌豆蛋白的研究主要集中于不同的熱處理[10]、高壓[11]、超聲和pH值[12]等對其功能性質的影響，然而運用高速剪切和熱處理相結合的方法來改善豌豆蛋白功能性質的研究較少。高速剪切和熱處理屬于物理改性的范疇，具有安全、無毒性、環保等特點，是一種綠色改性技術；并且與傳統的磁力攪拌處理相比，高速剪切的物理力更強，有利于蛋白溶解。本研究采用高速剪切和熱處理相結合的方法處理豌豆蛋白溶液，通過研究該處理方法對豌豆蛋白溶解性的影響，探究最佳處理條件，以期改善豌豆蛋白的功能特性，進而提高使用價值，拓寬應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白粉（≥99%）：山東塔林食品有限公司；血清白蛋白（≥98%）：合肥千盛生物科技有限公司；磷酸（≥85%）：天津市致遠化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250、石蠟油、十二烷基硫酸鈉、無水乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

數顯高速剪切分散乳化機（AD300S-H）：上海昂尼儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計（L6S）：上海儀電分析儀器有限公司；高速離心機（TG16G）：河南北弘實業有限公司；磁力攪拌加熱鍋（SY-DF3-2A）：上海尚儀儀器設備有限公司；真空冷凍干燥機（FD-1-50）：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別配制1%和14%的豌豆蛋白懸浮液于錐形瓶中，放入冰箱中過夜，充分水合備用。之后進行高速剪切和熱處理，取部分處理后的樣品真空冷凍干燥后測定性質。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 高速剪切轉速對豌豆蛋白溶解性的影響

水合過夜后，取出豌豆蛋白溶液，用磁力攪拌加熱鍋攪拌至溫度為25℃，分別進行轉速為0、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 r/min，時間為 2.5 min 的高速剪切處理，剪切結束后，測定溶解性。

1.3.2.2 高速剪切時間對豌豆蛋白溶解性的影響

方法同1.3.2.1，控制高速剪切過程中溫度為25℃，轉速為 7 000 r/min，時間分別為 0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min，測定溶解性。

1.3.2.3 熱處理溫度對豌豆蛋白溶解性的影響

方法同1.3.2.1，控制高速剪切轉速為7 000 r/min，時間為 2 min，熱處理溫度分別為 25、60、70、80、90、100℃，測定溶解性。

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗確定高速剪切轉速、時間、溫度各因素的最佳范圍，在此基礎上進行正交試驗，因素水平見表1（D為空白列，在方差分析中作為誤差列），每份樣品平行制備3份，計算平均溶解性，確定高速剪切協同熱處理最佳工藝并探究其對豌豆蛋白功能性質的影響。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.4 豌豆蛋白功能性質的測定方法

1.3.4.1 溶解性的測定

采用考馬斯亮藍法[13]測定豌豆蛋白的溶解性，以每升水溶液中溶解豌豆蛋白的毫克數來表示豌豆蛋白的溶解性。

1.3.4.2 持水性的測定

分別取各豌豆蛋白凍干粉1 g（W1）加入到已知質量的離心管（W2）中，再加入20 mL去離子水，攪動溶液，振蕩離心管，使其充分溶解，之后在30℃的恒溫水浴鍋中放置30 min，再在3 000 r/min的轉速下離心15 min，傾去上清液，稱量總質量（W3）。計算豌豆蛋白的持水性。

1.3.4.3 持油性的測定

分別取各豌豆蛋白凍干粉1g（W1）加入到已知質量的離心管（W2）中，再加入20mL石蠟油，攪動溶液，振蕩離心管，使其充分溶解，之后在30℃恒溫水浴鍋中放置30min，最后在3000r/min的轉速下離心15min，傾去多余的油液，稱量總質量（W3）。計算豌豆蛋白的持油性。

1.3.4.4 乳化性的測定

根據Guo等[14]的方法稍作調整，經熱處理后的豌豆蛋白溶液，在4 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液15 mL，加入5 mL石蠟油，用高速剪切機處理混合溶液1 min，設定高速剪切的轉速為10 000 r/min，制得乳液，在液體均勻時，立刻從底部吸取0.05 mL的乳液，加到5 mL質量分數為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中混合攪拌均勻，在波長為500 nm處測定該液體的吸光度，記為A0。之后按照下式計算豌豆蛋白的乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI），用來描述蛋白的乳化性能。

式中：N為稀釋倍數；θ為油體積分數，%；C為溶液濃度，g/mL；A0為起始吸光度。

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，采用SPSS統計分析軟件（Version 25.0）進行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05認為有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 高速剪切轉速對豌豆蛋白溶解性的影響結果

高速剪切轉速對豌豆蛋白溶解性的影響見圖1。

如圖1所示，固定處理溫度25℃，高速剪切時間2.5 min，隨著高速剪切轉速的逐漸增大，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當轉速為6 000 r/min時，溶解性最大，為76.59 mg/L，與未處理相比增加了22.11%?？赡苁且驗榧羟辛ζ茐牧说鞍组g的氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用，使蛋白質聚集體的尺寸減小，表面積增加，從而使蛋白與水的作用面積增大，溶解性增加[15]。并且剪切轉速越大，對蛋白的破壞程度越大，蛋白尺寸越小，故在一定的范圍內，隨著轉速的增大，溶解性增加。但當轉速增大到一定程度時，溶解性呈現下降趨勢，可能是因為高強度的機械能轉化成了熱能，從而使蛋白質發生部分變性，變性后聚集[16]。因此，在正交試驗中，剪切轉速選用5 000、6 000 r/min和7 000 r/min。

2.1.2 高速剪切時間對豌豆蛋白溶解性的影響結果

高速剪切時間對豌豆蛋白溶解性的影響見圖2。

由圖2所示，固定高速剪切轉速7 000 r/min，處理溫度25℃，隨著剪切時間的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當剪切時間為2.0 min時，溶解性最大，為80.63 mg/L，與未處理相比增加了28.56%。溶解性增加可能是因為剪切力使蛋白質的表面結構打開[17]，蛋白比表面積增大，活性位點增加[18]，蛋白與水相互作用的概率增加。隨后，溶解性呈下降趨勢，可能是因為長時間的剪切作用使機械能轉化成了熱能，從而使蛋白質發生部分變性，變性后聚集[19]。因此，在正交試驗中，剪切時間選用1.5、2.0 min和2.5 min。

2.1.3 熱處理溫度對豌豆蛋白溶解性的影響結果

熱處理溫度對豌豆蛋白溶解性的影響見圖3。

由圖3可知，固定高速剪切轉速7 000 r/min，時間2.0 min，隨著熱處理溫度的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當熱處理溫度為80℃時，溶解性最大，為88.98 mg/L，與未經熱處理（25℃）相比增加了10.36%。當熱處理溫度低于80℃時，隨著溫度的升高，溶解性增加，可能是因為維持蛋白質高級結構的作用力疏水相互作用是吸熱反應，升高溫度會增強疏水相互作用，從而使疏水基團之間能更好地締合，藏于溶質分子內部，極性基團暴露于溶質表面[20]；也可能是因為巰基轉化成二硫鍵[21]，二硫鍵的生成迫使肽鏈不同地方的氨基酸殘基聚集在一起，迅速折疊形成穩定的空間結構，其中疏水性氨基酸殘基會分布在二硫鍵附近[22]，從而更多的疏水基團被鎖定在分子內部。

但隨著處理溫度再升高，豌豆蛋白獲得更高的能量，使其能夠破壞維持蛋白質高級結構的氫鍵、范德華力、靜電力和疏水相互作用等，改變蛋白質的構象，使蛋白質變性。一般在55℃蛋白質開始變性[23]，但蛋白質的變性不一定導致溶解性下降[24]。當處理溫度高于80℃時，蛋白質變性嚴重，結構展開，從而使包埋于蛋白質分子內部的疏水基團暴露，故溶解性下降[15]。此外，溶解性下降還可能是因為，溫度升高會加劇蛋白質分子的熱運動，促使蛋白質顆粒發生相互碰撞的概率增大，從而導致蛋白質聚集[10]。因此，在正交試驗中，熱處理溫度選用70、80℃和90℃。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果

正交試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表2極差分析結果可知，影響豌豆蛋白溶解性大小的因素順序為A（剪切轉速）＞B（剪切時間）＞C（熱處理溫度）。由表3可知，因素A（剪切轉速）和B（剪切時間）對豌豆蛋白溶解性的影響具有顯著性（P＜0.05），是影響豌豆蛋白溶解性的主要因素，因素C（熱處理溫度）對豌豆蛋白溶解性的影響較小。由以上結果分析得出最佳剪切工藝條件為A3B2C2，即剪切轉速7 000 r/min，剪切時間2.0 min，熱處理溫度80℃。

2.2.2 驗證試驗

高速剪切協同熱處理對豌豆蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性的影響見圖4。

由圖4可知，剪切轉速為7 000 r/min，剪切時間為2.0 min，熱處理溫度為80℃時，豌豆蛋白的溶解性為88.98 mg/L，其比正交試驗中的任何一次實驗的溶解性都大，表明該處理條件可作為豌豆蛋白的最佳改性條件。并且與未處理的豌豆蛋白相比，經過該處理后的蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性分別增加了41.87%、56.82%、12.50%和13.17%。豌豆蛋白持水性增加可能是因為溫度升高，分子的布朗運動增加，水分子在蛋白中分布更均勻，蛋白更易吸水。持油性和乳化性增加可能是因為高速剪切使蛋白結構展開，原來藏在分子內部的疏水性基團暴露，蛋白更易包裹油滴。

3 結論

高速剪切和不同熱處理對豌豆蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性均有一定的影響，綜合分析得出最佳處理條件：高速剪切轉速7 000 r/min，時間2.0 min，熱處理溫度80℃，此條件下，豌豆蛋白的溶解性達到最大，持水性、持油性和乳化性也有一定程度的增加。綜上，通過對豌豆蛋白進行高速剪切和熱處理，其功能性質得到改善，這為豌豆蛋白在食品中的應用提供了參考，可以推動豌豆蛋白的進一步開發和利用，提高蛋白資源的利用率。