葛根與茶多酚體內外協同輔助降血糖活性探究

袁傳勛，王津坤，金日生，王敏，李亮

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

糖尿病是世界上最常見的代謝紊亂疾病之一，其主要特征是胰島素分泌減少或胰島素抵抗引起的高血糖[1-2]，糖尿病已成為世界第五大死亡原因，國際糖尿病聯合會預測，到2035年，全世界將有5.92億人患糖尿病[3]，糖尿病在引起高血糖的同時還會引起糖尿病腎病、糖尿病相關心臟疾病、糖尿病神經病變和糖尿病足等多種并發癥[4]?，F如今糖尿病高血糖的控制方法主要為口服藥物，但長期服用口服降糖藥可能會產生副作用，如阿卡波糖會引起胃腸道疾病、格列本脲會引起粒細胞減少和低血糖癥、二甲雙胍會引起乳酸酸中毒。藥食同源的中藥除了具有保健效果外，還具有不良反應較少的優點[5]，在治療慢性病等領域具有廣泛的前景。

葛根既是食材又是藥材，產地廣泛，在古代就是治療糖尿?。ㄏ拾Y）的主要藥材之一[6]，其具有多種功效，如解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等[7]。葛根異黃酮是葛根的主要活性成分，研究表明葛根異黃酮在解酒、護肝、抗氧化、降血糖與降血脂等多方面都具有活性[8-9]。茶多酚是綠茶中的主要活性成分，其中大部分是兒茶素及其衍生物，研究表明其具有廣泛的藥理作用諸如減肥、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌、抗炎抑菌等[10-11]。韋芳媚等[12]對桑葉提取物與茶多酚的協同降血糖與協同抗氧化作用進行研究，結果表明桑葉提取物與茶多酚在對糖尿病關鍵酶的抑制作用優于兩種成分單獨作用，為植物提取物應用于功能性茶飲料提供了參考；趙磊等[13]將南瓜、山藥、葛根與桑葉復配研究對糖調節受損改善作用，結果表明配方可從改善糖代謝、脂代謝、氧化應激等多種途徑預防小鼠因高糖引起的糖調節受損。本文研究了葛根提取物與茶多酚在體外對α-葡萄糖苷酶協同抑制效果及體內對2型糖尿病小鼠協同治療的效果，為葛根提取物與茶多酚復配應用于輔助降血糖功能性食品的開發提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物

5周齡雄性昆明小鼠：SPF級，安徽醫科大學。

1.1.2 試劑

綠茶提取物：圣嘉德生物科技有限公司；葛根提取物：上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶：西格瑪-奧德里奇（上海）貿易有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷 （＞99%）（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）：上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖：中美華東制藥有限公司；鏈脲佐菌素（≥98.00%）：翌圣生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍：北京圣永制藥有限公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋（BSG-26）：上海一恒科學儀器有限公司；電子天平（ATY124）：力辰儀器有限公司；紫外-可見光分光光度計（UV-1800PC）：翱藝儀器有限公司；血糖儀（悅準Ⅱ型306）：江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；全波長酶標儀（Varioskan Flash）：賽默飛世爾科技；臺式高速離心機（TG16-WS）：湖南湘鑫儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根提取物與綠茶提取物中有效成分含量測定

1.3.1.1 葛根異黃酮含量測定

采用紫外-分光光度法對葛根提取物中葛根異黃酮的含量進行測定[14]。將4.0 mg葛根素標準品用70%乙醇溶液溶解于10 mL容量瓶中，配制成0.4 mg/mL的葛根素標準溶液作為母液。再分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL母液，用70%乙醇溶液定容于25 mL容量瓶中，配制成梯度濃度為 3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 μg/mL的系列工作液，以70%乙醇作為空白對照，在250 nm處測定吸光度，以葛根素濃度（μg/mL）為X，吸光度為Y，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.056 15X-0.015 05，R2=0.999 6。

取10.0mg樣品溶于50mL70%乙醇中，吸取1.0mL，再溶于50 mL 70%乙醇中，在250 nm處測定吸光度，并通過以上標準曲線計算樣品中葛根異黃酮含量。

1.3.1.2 茶多酚含量測定

采用酒石酸亞鐵法對樣品中茶多酚含量進行測定[15]。配制梯度濃度的茶多酚標準品溶液，并取1 mL茶多酚溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亞鐵溶液與4 mL去離子水，再用pH6.9的磷酸緩沖液定容至25 mL，在540 nm處對吸光度進行測定，以茶多酚濃度（mg/mL）為X，吸光度為Y，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.331 8X+0.003 3，R2=0.999 8。

取200 mg樣品，用去離子水定容至100 mL作為樣品溶液，取1 mL樣品溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亞鐵溶液與4 mL去離子水，并用pH6.9磷酸緩沖液定容至25 mL，在540 nm處測定吸光度，并根據標準曲線計算出樣品中茶多酚的含量。

1.3.2 體外降血糖協同效果的探究

1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的抑制

參考文獻[16]的方法并略作修改。加入100 μL不同濃度的樣品溶液及100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃預熱 20 min后，加入 100 μL p-NPG，在 37℃下反應30 min，加入500 μL Na2CO3溶液終止反應，加入500 μL pH6.8磷酸緩沖液后，在405 nm下測定吸光度，記為A樣品。以緩沖液代替樣品溶液，作為對照組，測量吸光度記為A對照；以緩沖液代替酶溶液，作為背景組，測量吸光度記為A背景；以緩沖溶液替代酶溶液和樣品溶液，作為空白組；以阿卡波糖溶液替代樣品溶液，作為陽性對照組。抑制率的計算公式如下。

1.3.2.2 葛根提取物與茶多酚半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）

配制梯度濃度的葛根提取物溶液與茶多酚溶液，按1.3.2.1方法進行不同濃度樣品α-葡萄糖苷酶抑制率的測定。葛根提取物與茶多酚的濃度與其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均具有劑量-效應關系，符合中效原理，參照Chou與Talary公式[17]，其中樣品濃度記為D，抑制率為50%時的樣品濃度記為Dm，D濃度時的抑制率記為fa，m為劑量-效應曲線的系數，其對數形式如下。計算出抑制率為50%時的濃度，即IC50。

1.3.2.3 最佳協同抑制質量比

將茶多酚與葛根提取物分別按質量比 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 進行復配，并參照 1.3.2.1 方法對 α-葡萄糖苷酶活性的抑制率進行測定。

1.3.2.4 聯合指數的測定

聯合指數（combination index，CI）是評價藥物協同效果的一個指標[18]，兩種藥物分別記作藥物1與藥物2，其中藥物1單獨作用時抑制率為50%的濃度為（D）1，藥物2單獨作用時抑制率為50%的濃度為（D）2，藥物1與藥物2聯合作用時抑制率為50%的各自的濃度分別為（D）x1與（D）x2，CI的計算方法如下。當CI值＞1.1時，兩種物質呈拮抗效果；CI值介于0.9與1.1之間時，兩種物質呈現相加效果；CI值＜0.9時，兩種物質呈協同效果。

按1.3.2.3中最佳質量比配制梯度濃度溶液，并計算兩種物質復配時各自的IC50，并代入上述式中計算，得到葛根提取物與茶多酚的CI，并根據CI值判定葛根提取物與茶多酚對α-葡萄糖苷酶體外抑制是否具有協同作用。

1.3.3 體內輔助降血糖協同效果的探究

1.3.3.1 2型糖尿病小鼠模型的建立及分組給藥

56只小鼠以每組8只分為7組，分別為空白組、模型組、陽性對照組、葛根提取物組、茶多酚組、低劑量協同組、高劑量協同組。適應性喂養1周后，除空白組外，其余各組改用高脂飼料（膽固醇1%、豬油8%、蛋黃粉5%、蔗糖10%、基礎飼料76%）喂養，喂養期間自由飲水進食。在高脂飼料喂養4周后用1%鏈脲佐菌素溶液按40 mg/kg劑量腹腔注射進行2型糖尿病建模（空白組注射生理鹽水作為對照），連續注射4 d后進行空腹血糖測定，空腹血糖值大于11.1 mmol/L[19]即為造模成功。各小組成功造模后進行灌胃給藥?？瞻捉M與模型組使用蒸餾水灌胃、陽性對照組使用150 mg/kg鹽酸二甲雙胍灌胃進行給藥、葛根提取物組灌胃400 mg/kg葛根提取物、茶多酚組灌胃200 mg/kg茶多酚、協同低劑量組灌胃200 mg/kg葛根提取物與100 mg/kg茶多酚、協同高劑量組灌胃400 mg/kg葛根提取物與200 mg/kg茶多酚。連續灌胃給藥4周后，乙醚麻醉，摘除眼球取血后斷頸處死。

1.3.3.2 小鼠體質量及空腹血糖測定

在飼養過程中，每周進行體質量與空腹血糖的測量，測量均在斷食不斷水12 h后進行，空腹血糖采用尾端取血方法進行測定。

1.3.3.3 小鼠糖耐量指標

處死前斷食12 h后對各組小鼠的空腹血糖進行測定，然后對各組小鼠灌胃2 g/kg bw葡萄糖溶液，于灌胃后0.5、1.0、2.0 h測定小鼠血糖，采用梯形面積法[20]計算糖耐量曲線下面積（area under curve of glucose，AUC）并比較各組小鼠間AUC的差異。

式中：a為0 h血糖值，mmol/L；b為0.5 h血糖值，mmol/L；c為 1h血糖值，mmol/L；d為2h血糖值，mmol/L。

1.3.3.4 對小鼠血清胰島素含量的影響

小鼠眼球血在4 000 r/min下離心5 min，得到小鼠血清。使用小鼠胰島素ELISA試劑盒對小鼠血清中胰島素（insulin，INS）含量進行測定，操作方法參照試劑盒說明書。

1.3.3.5 對小鼠穩態模型胰島素抵抗指數與穩態模型胰島素分泌指數的影響

除了INS值外，對小鼠糖尿病情況的判斷還需要結合空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）值通過以下兩個公式進行計算分析。

其中，穩態模型胰島素抵抗指數[21]（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）的計算公式如下。

穩態模型胰島素分泌指數[22]（homeostasis model assessment-β，HOMA-β）的計算公式如下。

根據1.3.3.2方法與1.3.3.4方法中得到的FBG與INS進行計算，得到小鼠HOMA-IR與HOMA-β值。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 26.0進行顯著性分析。使用Excel 2017與Origin 2018對數據處理及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 原料中主要成分含量的測定

2.1.1 葛根異黃酮含量的測定

通過標準曲線計算得出葛根提取物樣品中葛根異黃酮的含量為（51.60±0.45）%。

2.1.2 茶多酚含量的測定

通過標準曲線計算得出綠茶提取物樣品中茶多酚的含量為（81.33±0.12）%。

2.2 葛根提取物與茶多酚體外輔助降血糖效果的驗證

2.2.1 葛根提取物與茶多酚IC50結果

茶多酚、葛根提取物與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制效果的劑量-效應曲線分別如圖1～圖3所示。

由圖1和圖2可知，茶多酚與葛根提取物對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其抑制效果均隨樣品濃度的增大而逐漸增加，直到接近完全抑制。根據計算，茶多酚對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.1159μg/mL，而葛根提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50為1.000 μg/mL。同時對陽性對照物阿卡波糖進行測定，結果測得阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50為61.781 μg/mL，說明單獨使用時，葛根提取物與茶多酚均具有良好的體外降血糖活性。

2.2.2 葛根提取物與茶多酚最佳復配質量比的確定

葛根提取物與茶多酚不同質量比復配下對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率如圖4所示。

由圖4可知，當葛根提取物與茶多酚的質量比為2∶1時，對α-葡萄糖苷酶抑制率最高，可達到（88.65±1.91）%。因此將2∶1作為后續試驗中葛根提取物與茶多酚復配時的質量比。

2.2.3 葛根提取物與茶多酚CI值的測定

在保持葛根提取物與茶多酚的質量比為2∶1條件下，配制梯度濃度溶液進行抑制α-葡萄糖苷酶試驗，得到的劑量-效應曲線如圖5所示（以茶多酚濃度計）。

由圖5可知，葛根提取物與茶多酚在進行復配時的 IC50分別為 0.133 1 μg/mL 與 0.066 55 μg/mL，并計算出CI為0.707 3，小于0.9，說明葛根提取物與茶多酚在α-葡萄糖苷酶活性的抑制上具有良好的協同效果。葛根異黃酮與茶多酚均屬于多酚類物質，其代表性結構為苯環與雜環六元吡喃或吡喃酮縮合，并在吡喃環或吡喃酮上有苯環作為取代基。多酚可以通過與酶結合，占據底物結合位點或結合后改變酶的構象，使底物無法與酶結合，達到對酶活性的抑制。茶多酚與葛根異黃酮中苯環上具有多處酚羥基取代，可以通過范德華力或疏水鍵等與α-葡萄糖苷酶上不同的位點相結合，進而達到對酶活性的協同抑制作用[23]。

2.3 葛根提取物與茶多酚協同體內輔助降血糖效果的驗證

2.3.1 小鼠體質量與空腹血糖變化

2.3.1.1 小鼠體質量變化

實驗期間，小鼠體質量變化情況如圖6所示。

由圖6可知，在適應性喂養與高脂飼料喂養期間，各組小鼠的體質量逐漸增長，空白組由于使用普通飼料進行喂食，其體質量低于其他喂食高脂飼料的各組。經過造模與灌胃給藥后，空白組的體質量持續升高，其他各組小鼠的體質量均有明顯下降，以模型組小鼠的體質量下降最為顯著，各給藥組相對與模型組消瘦情況均有一定的改善，茶多酚對糖尿病小鼠的消瘦情況改善效果最弱，而經過與葛根提取物復配后，對糖尿病小鼠消瘦改善效果增強。

2.3.1.2 小鼠空腹血糖變化

實驗期間，小鼠空腹血糖變化情況如圖7所示。

各組小鼠在適應性喂養與高脂飼料喂養期間的空腹血糖保持在穩定狀態。由圖7可知，建模后，除空白組外，各組小鼠的空腹血糖均超過了11.1 mmol/L，表明建模成功。在灌胃給藥過程中，空白組小鼠空腹血糖小于11.1 mmol/L，處于正常范圍內，模型組小鼠空腹血糖大于11.1 mmol/L，無下降趨勢，而陽性對照組、葛根提取物組、茶多酚組、協同低劑量組與協同高劑量組小鼠空腹血糖在灌胃給藥4周過程中均呈下降趨勢，說明葛根提取物與茶多酚對小鼠血糖均具有輔助下調效果。相對于使用單組分進行灌胃給藥，協同高劑量組小鼠空腹血糖的下降趨勢更加明顯，當灌胃4周后其空腹血糖平均值小于11.1 mmol/L，恢復到正常水平，說明茶多酚與葛根提取物對糖尿病小鼠具有協同治療效果。

2.3.2 對小鼠AUC的影響

各組小鼠AUC計算結果如圖8所示。

由圖8可知，對小鼠的糖耐量實驗中，各灌胃給藥組小鼠的AUC均大于空白組，但均小于模型組，與空白組、模型組比較均具有極顯著性差異（p＜0.01），在各給藥組中，協同高劑量組小鼠的AUC值最低。AUC反映了小鼠對葡萄糖的耐受情況，是糖尿病考察的重要指標。結果表明茶多酚與葛根提取物對糖尿病小鼠糖代謝紊亂具有改善效果，茶多酚與葛根提取物復配后對糖尿病小鼠糖代謝紊亂具有協同改善效果。糖耐量除受到腸道內α-葡萄糖苷酶等雙糖酶活性的影響外，還受到體內INS分泌量、機體胰島素抵抗等多方面因素影響，因此需要結合INS分泌量進行進一步分析[24]。

2.3.3 對小鼠血清胰島素含量的影響

對小鼠的INS測定結果如圖9所示。

由圖9可知，空白組的INS分泌含量最低，建模后，各組小鼠的INS均增加，給藥后各組的INS分泌量進一步上升，而協同高劑量組的INS含量最高，與模型組具有顯著差異（p＜0.05），其次為茶多酚組，其余各組INS含量相差不大。INS分泌量受到胰島β細胞損傷情況與胰島素抵抗等多種因素影響，因此需要引入HOMA-IR與HOMA-β等穩態模型對小鼠糖尿病情況進一步分析。

2.3.4 對小鼠HOMA-IR與HOMA-β的影響

小鼠HOMA-IR計算結果如圖10所示。

由圖10可知，小鼠在建模后出現胰島素耐受情況。在灌胃給藥后，茶多酚組HOMA-IR與模型組無顯著性差異，說明單獨使用茶多酚改善模型小鼠的胰島素耐受不明顯（p＞0.05）。其余各給藥組HOMA-IR均小于模型組且具有顯著差異（p＜0.05），在各給藥組中，協同高劑量組小鼠HOMA-IR值最低，說明除茶多酚組外，其他各給藥組小鼠的胰島素抵抗情況均有明顯改善，而葛根提取物與茶多酚的高劑量協同對糖尿病小鼠的胰島素抵抗情況改善效果最佳。同時，可通過HOMA-β分析糖尿病小鼠胰島β細胞損傷是否得到修復。

小鼠HOMA-β結果如圖11所示。

由圖11可知，模型組HOMA-β極顯著低于空白組（p＜0.01），說明建模后小鼠胰島β細胞功能受到了損傷。經過灌胃投藥后，各投藥組小鼠HOMA-β相較于模型組均有一定增加，但只有協同高劑量組具有極顯著增長（p＜0.01），同時，協同高劑量組小鼠HOMA-β與空白組間無顯著性差異，說明協同高劑量組小鼠胰島β細胞所受損傷得到較好修復。葛根提取物與茶多酚在修復胰島β細胞所受損傷具有良好的協同作用。

3 結論

本文探究了葛根提取物與茶多酚體內外的協同降血糖活性。體外輔助降血糖活性通過對α-葡萄糖苷酶活性的抑制進行測定，當葛根提取物與茶多酚質量比為2∶1時，具有最佳的協同效果，通過中效原理與聯合指數計算得出兩者CI<0.9，具有良好的體外協同降血糖效果。使用葛根提取物與茶多酚單獨或復配后對2型糖尿病模型小鼠進行灌胃給藥，進一步驗證體內協同降血糖效果，在協同高劑量下給藥4周后可使小鼠的血糖下降至11.1 mmol/L以下，恢復至正常值，而其他各給藥組對比協同高劑量組效果略差，說明葛根提取物與茶多酚在體內同樣具有良好的協同降血糖效果。同時，高劑量協同給藥能夠增加模型小鼠胰島素靶器官敏感性，刺激小鼠胰島β細胞分泌胰島素，這可能是葛根提取物與茶多酚進行協同降血糖的主要途徑。

綜上所述，葛根提取物與茶多酚在體內外均具有良好的協同輔助降血糖效果，可以將其活性成分進一步開發為輔助降血糖功能性食品或飲品，但其具體的作用途徑與協同機制還需要進一步深入研究。