性別控制技術在家畜生產中的應用研究進展

謝曉剛，李 丹，薛增迪，張芮琪，史宏昭，薛 嘉，馬乃祥，權富生

（1.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學 動物醫學院/農業部動物生物技術重點實驗室，陜西楊凌 712100；3.陜西省動物疫病預防控制中心，陜西 西安 710000）

預計到21世紀中葉，世界總人口將達到96億，人類對畜產品的需求將增加70%以上[1]。為了解決全球畜產品需求量增加的問題，利用現代生物技術促進畜牧業的可持續發展顯得至關重要。哺乳動物性別控制（Sex control）技術是通過對動物正常生殖過程的人為干預，使雌性動物生產出符合人們期望性別后代的技術手段[2-6]。性別控制技術在畜牧生產中有著重要的意義。首先，通過控制后代的性別比例，可以充分發揮受性別限制的生產性狀（如泌乳、產麝性能等）和受性別影響的生產性狀（如生長速度、肉質等）的最大經濟效益；其次，控制后代的性別比例可增加家畜選種強度，有效加快育種進程；此外，通過控制后代的性別還可克服某些家畜中出現的異性孿生不育現象，排除伴性有害基因的危害，以及解決閹割等動物福利等問題。自古以來，為了提高家畜的養殖效益，人們一直在試圖對其后代性別進行控制。隨著畜牧業智能化的快速發展，人類對特定性別的家畜需求量顯著增加，因此，家畜性別控制技術具有重要的研究和應用價值。

1 性別控制理論研究

1923年，PAINTER等[7]研究發現，人類的X染色體和Y染色體，并且指出卵子與X精子結合時最終發育為雌性胎兒，與Y精子結合時最終發育為雄性胎兒。在發現X、Y精子可以決定動物性別之后，1925年，LUSH等[8]根據X精子和Y精子的密度差異，通過離心的方法將兔子的X精子和Y精子分離，但是并未生產出預想的后代性別比例，雖然實驗并不成功，但是此研究方法對現代家畜性別控制帶來了很大的影響，LUSH是通過X精子和Y精子分離進行動物性別控制的奠基者。目前，在動物生產中，通過X、Y精子分離進行后代性別控制仍然是主流方法。

1959年，WELSHONS等[9]提出了Y染色體決定雄性的理論。1989年，JOHNSON等[10]建立了早期的用于性別控制的流式細胞儀模型，并通過這種方法成功分離了兔子的X精子和Y精子，并采用分離后的精子進行人工授精產下了預期性別比例的后代，這標志著以分離X精子和Y精子為原理的性別控制技術取得了重大進展。

隨后幾年，哺乳動物的性別決定機制研究取得了很大的進展，科學工作者將性別決定基因定位在Y染色體上一個特定區域內，為家畜動物的性別控制開辟了新的研究思路，即通過對胚胎早期的性別鑒定來控制后代的性別。1990年，SINCLAIR等[11]首次在人體Y染色體上克隆到一個特異的性別決定基因，SRY基因。此后，SRY基因在很多動物中相繼被克隆出來。SRY基因的發現是哺乳動物性別決定理論的重大突破，為性別控制技術奠定了理論基礎。1991年，KOOPMAN等[12]將一段含有SRY基因的序列導入小鼠胚胎，發現在出生的小鼠中，部分染色體為XX型的雌性小鼠會出現性別反轉，證明SRY基因是哺乳動物性別決定的主效基因。SRY基因又稱為睪丸決定因子（Testis Determining Factor，TDF），是哺乳動物性別決定的總開關[13-14]。20世紀90年代，HERR等[15]利用SRY基因序列設計引物，通過PCR技術首次成功鑒定了牛、羊胚胎的性別，并從此開啟了利用SRY基因進行胚胎性別鑒定的技術先河。目前，將性別控制技術與人工授精和胚胎移植技術相結合，達到人為控制性別的目的，在科學研究和動物生產中已經非常普及。

2 家畜性別控制技術

隨著社會經濟的快速發展，消費者對肉、蛋、奶的需求量與日俱增，采用性別控制技術快速生產特定性別的后代可以更好地滿足社會對畜產品的需求。因此，性別控制在畜牧生產中的應用更加廣泛，出現了很多不同的性別控制方法，如X、Y精子分離、胚胎性別鑒定、調節母畜生殖道環境、特定溫度解凍凍精、分子生物學技術等。

2.1 X、Y精子分離技術

根據X精子和Y精子性別決定的基本理論，可以將精子分離為X精子和Y精子，根據對后代的性別需求，分別用X精子或Y精子進行人工授精，進行性別控制。由于X精子攜帶X染色體，Y精子攜帶Y染色體，而Y染色體要比X染色體小很多，根據2種精子的性狀差異，可以使用一些特殊的方法將它們分離開[16-19]。目前，哺乳動物X、Y精子的分離方法主要有流式細胞儀分離法和免疫學分離法。

2.1.1 流式細胞儀分離法 流式細胞儀分離法是目前最常用也是最成熟的XY精子分離方法。該方法的主要理論依據是X精子和Y精子頭部DNA含量存在差異。在家畜中，X精子的DNA含量要比Y精子高出3%~4%[20]，根據這一差異，采用DNA特異性染料對精子進行染色，染料的著色量與DNA的含量成正比[21]，當X精子通過流式細胞儀時會放射出更強的熒光信號，從而得以分離。目前，通過流式細胞儀分離動物精子的準確率已達95%以上，生產的商業化性控精子已廣泛應用于畜牧業中，尤其是在奶牛、奶山羊的生產中應用較多。

2006年，覃能斌等[22]分別使用經過流式細胞儀分選的鮮精與凍精對荷斯坦青年母牛（14~17月齡，體質量為350~450 kg）和成年母牛（3～5周歲，頭胎或經產）進行人工輸精，發現后代雌性犢牛所占比例均達到90%以上。2009年，高慶華等[23]使用經流式細胞儀分選的西農薩能奶山羊Y精子進行人工授精結果發現，出生的羔羊均為雄性。2012年，曾有權等[24]通過流式細胞儀分離豬精子，并進行人工授精，發現母豬妊娠率和產仔率不受影響，輸X精子母豬產生后代為雌性的比例可達91.67%，輸Y精子母豬產生后代為雄性的比例可達100%。2021年，何琪富等[25]建立了一種可以定量計算奶山羊精液中X、Y精子數量的雙重TaqMan熒光定量PCR方法，可檢測經過分離的奶山羊精液X和Y精子的數量和比例。

目前，存在的問題是使用性控精子的受孕率仍然普遍低于鮮精。此外，流式細胞儀運行成本高，使得該技術在生產中的應用受到了一定的限制[26-27]。

2.1.2 免疫學分離法 免疫學分離法是利用HY抗體檢測Y精子質膜上存在的H－Y型抗原，根據抗原抗體反應來分離家畜的X精子和Y精子[28]。20世紀八九十年代，ZAVOS[29]和JONES等[30]使用該方法分別分離出較高純度的Y精子。然而，HENDRIKSEN[31]研究表明，X和Y精子會共享抗原，它們都能夠結合抗H－Y的抗體。此外，此種方法雖然可以獲得純度較高的X精子和Y精子，但是處理時間較長，會顯著降低精子活力，導致受胎率降低，使得該方法在生產中很難推廣應用[32]。

2.2 胚胎性別鑒定技術

在胚胎移植前，通過對胚胎進行性別鑒定，可以人為選擇所需性別的胚胎進行移植。對胚胎的性別進行鑒定有多種方法，如SRY-PCR法、免疫學法、核型分析法等。目前，最常用的是SRYPCR法，近年來，隨著PCR技術的快速發展和普及，使得快速、準確地對早期胚胎性別進行鑒定成為可能[33]。2004年，MARA等[34]通過雙重PCR技術擴增SRY基因，對綿羊的早期胚胎進行性別鑒定，準確率高達87.5%。2007年，劉俊平等[35]采用PCR技術對牛體內胚胎（分別采用普通精液和性控精液超數排卵后人工授精處理發情的奶牛）和體外胚胎（分別采用普通精液和性控精液對成熟的卵丘卵母細胞復合體進行體外受精）的性別進行鑒定，結果顯示，2種胚胎移植受體母牛后妊娠率無顯著影響，后代犢牛性別與鑒定結果符合率達100%。PCR鑒定胚胎性別的方法雖然操作簡便，但仍需從胚胎中分離部分細胞，可能會對胚胎后期發育造成損傷。此外，由于該方法主要是用胚胎作為樣品，導致起始樣品量少，擴增量較大，容易污染造成假陽性的結果，影響試驗結果的準確性[36]。

2.3 調節母畜生殖道環境技術

1984年，李方來等[37]研究發現，牛陰道的酸堿環境可能與后代性別比例有關，堿性環境有助于Y精子的受精，而酸性環境有助于X精子的受精。當陰道液的pH值大于7.6時，后代中公犢占比為66.7%；當陰道液的p H值小于6.8時，后代中公犢占比僅為37.5%。1985年，烏蘭少布[38]報道了用20%的食醋沖洗母牛陰道，可以改變陰道的酸堿環境，當pH值降到6.7以下時，后代中母犢可達63.5%。2015年，于濤等[39]檢測了奶牛宮頸分泌物的pH值，結果發現，pH值越高，后代中雄性占比越高，反之，雄性占比越低；在p H值小于6.7的母牛中，后代多為雌性，而當p H值大于7.6時，后代多為雄性；pH值在6.8~7.5時，雌雄后代數目較為平均。2017年，熊前等[40]以羅威納發情母犬為試驗對象，使用自配的堿性沖洗液對母犬陰道進行沖洗，結果顯示，試驗組比對照組公犬比例提高了4.8%，但差異不顯著。這種方法雖在家畜性別控制上具有一定的效果，但是目前用于改變母畜生殖環境的液體并沒有一個統一標準，也無商品化的試劑用于調節母畜生殖道環境，所以很難大范圍推廣應用。

2.4 不同溫度解凍凍精技術

2015年，李來平等[41]將凍精在3種不同溫度區間內解凍，分別為40~45、45~55、55~60℃。前2個溫度區間對后代的性別比例無明顯影響，而55~60℃對后代性別有很大影響，后代中雌性比例為59%。2004年，姜忠玲等[42]研究也發現，在適當提高解凍溫度可提高后代的雌性比例。2016年，馬正文[43]發現，在41℃下解凍凍精，同時采用食醋沖洗母牛陰道，出生后代中雌性比例可達67.9%。這種方法簡單實用，但凍精解凍所需時間及溫度的控制對一線操作人員要求較高，使得該技術的推廣受到了一定的限制。

2.5 分子生物學技術

近些年來，隨著分子生物學技術的快速發展，科學工作者對基因功能的研究取得了很大的突破。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術和基因編輯技術作為非常重要的靶向基因沉默工具，被廣泛應用于哺乳動物基因改造[44-48]。這2種技術可以使動物體內某些特定基因快速失去功能，目前，有些研究團隊就已經將其應用于動物的性別控制上。

石河子大學研究表明，通過RNAi降低動物體內Zfy（Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Y染色體相關鋅指蛋白轉錄因子）基因或者Zfx（X chromosome linked zincfinger protein transcriptional factor，X染色體相關鋅指蛋白轉錄因子）基因mRNA的表達量，可導致動物體內X精子或Y精子的發育受到破壞，引起后代性別比例的改變。2019年，該研究團隊將針對奶牛Zfy基因的干擾載體注射到成年公牛睪丸中，采集精液進行人工授精，后代犢牛中雌性占比達到72.0%[49]。此外，該研究團隊還利用同樣的方法在綿羊[50-51]、馬鹿[52]、豬[53-54]、小鼠[55-56]等動物上取得了一定的性別控制效果。

在模式動物中，2012年，WU等[57]設計了針對小鼠性別決定基因——SRY基因的干擾載體，對懷孕母鼠的受精卵進行注射后發現，SRY基因的沉默使得其下游的在兩性性腺分化過程中起重要作用的WT 1基因表達量顯著升高，最終影響了后代小鼠性腺和睪丸發育。2013年，KATO等[58]利用TALEN技術結合原核注射技術生產出敲除SRY基因的小鼠，發現SRY基因敲除影響了小鼠性腺的發育，雄性小鼠出現了像雌鼠一樣的內生殖器，但這些小鼠不育，與正常小鼠交配不能產生后代。2017年，SONG等[59]研究發現，Sp1基因可以作為SRY轉錄的主要調控因子，Sp1基因突變會導兔性別發生反轉。2021年，DOUGLAS等[60]在以小鼠為模型，開發了一種合成的致死性雙組分CRISPR-Cas9策略，以100%的效率生產出均是雄性或雌性的小鼠后代，該研究為之后CRISPRCas9技術應用于其他哺乳動物進行性別控制奠定了基礎。

3 小結與展望

家畜性別控制在畜牧業中意義重大，隨著現代分子生物學和細胞生物學技術的快速發展，將徹底改變動物的生產方式。然而，無論是對哺乳動物的性別決定基因還是性別決定機制，人類的認識仍然非常有限。由于不同的性別控制技術有著各自的優點和缺點，具體選擇哪一種技術取決于臨床中的應用環境，而不是單一地選擇某一種方法?？偟膩碚f，性別決定是一個復雜的生物學過程，受到各種內部和外部因素的影響。隨著生命科學的快速發展，在不久的將來人們一定能夠進一步闡明哺乳動物性別決定機制，研制出更加高效、快速、準確、經濟的性別控制方法，并將它們應用于生產實踐，結合體外受精、胚胎分割、胚胎移植、體細胞核移植等生物學技術，促進現代畜牧產業快速高質量發展。