果膠高載引起的黃顙魚綠肝癥和肝纖維化與腸道菌群失調的關聯

姚仕彬 任勝杰 蔡春芳 曹霞敏 吳 萍 葉元土 姜光明 丁惠明 張 鋮

(1. 蘇州大學基礎醫學與生物科學學院, 蘇州 215123; 2. 江蘇省水產動物營養重點實驗室, 蘇州 215123;3. 蘇州市吳中區農業農村局, 蘇州 215104; 4. 蘇州市陽澄湖國家現代農業示范區發展有限公司, 蘇州 215138)

植物性食物或飼料中含有豐富的不能被單胃動物消化吸收的碳水化合物, 即膳食纖維, 包括非淀粉多糖(纖維素、半纖維素、果膠、樹膠和β-葡聚糖等)、抗性淀粉、抗性低聚糖及木質素等[1]。膳食纖維雖然不能被單胃動物消化吸收, 但會影響腸道環境, 同時膳食纖維也是腸道細菌的能源, 能夠促進腸道細菌的增殖, 提高其活力[1—3]。

腸道細菌在維持宿主代謝穩態中起著關鍵作用[4,5], 其結構和功能的改變可能導致宿主代謝失調, 進而發展成各種疾病[3,6]。適度提高日糧膳食纖維含量可改善腸道菌群的結構和功能, 因此, 醫學領域正嘗試用某些種類膳食纖維操控腸道菌群結構與功能, 以達到改善健康的目的[7,8]。

植物性蛋白源中膳食纖維含量往往達30%以上, 例如, 豆粕中膳食纖維含量達36.7%[9], 豆渣中膳食纖維更是高達63%[10]。隨著低魚粉、無魚粉飼料的開發和應用, 養殖魚類往往處于膳食纖維高載狀態, 這可能會引起腸道菌群功能紊亂, 進而發展出各種疾病。Singh等[11]已發現, 膳食纖維高載可導致小鼠膽汁淤積, 并誘發肝癌。我們在前期研究中也注意到膳食纖維短期高載(7d)可導致黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)綠肝癥, 長期高載(56d)引起肝纖維化[12]。但腸道菌群是否參與了這一病理過程尚不清楚。本研究通過向黃顙魚飼料中添加甲硝唑來抑制腸道厭氧菌, 探討腸道菌群在膳食纖維高載致病過程中發揮的作用, 為進一步解析膳食纖維的生理效應提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料制備

所用果膠(食品級>99%, 酯化度75%, 黏度1200 mPa)購自鄭州明瑞化工有限公司, 用于抑制腸道厭菌群的甲硝唑(Metronidazole)購自國藥集團化學試劑蘇州有限公司(純度≥99%)。其他飼料原料均由鑫裕飼料蘇州有限公司提供。向飼料中分別添加30%的糊精和果膠, 命名為CON和PEC飼料。再向這兩種飼料中分別添加0.2%的甲硝唑, 配制成名為CONM和PECM的飼料。飼料配方見表 1。

表1 實驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (airdry basis)

1.2 實驗魚飼養

養殖實驗在蘇州市陽澄湖國家現代農業示范區發展有限公司研究生工作站進行。黃顙魚幼魚購自浙江省湖州市南潯某育苗場。在室內水泥池馴化后選取規格一致的黃顙魚隨機分到24個容積為400 L的PC養殖缸中, 每缸放魚20尾, 再用CON飼料馴養2周, 確保攝食狀態良好。2周后稱重[初始體質量(21.5±3.6) g], 并將各缸魚初重差異調至CV<3%。隨機分組, 分別投CON、PEC、CONM和PECM飼料, 每種飼料投喂6缸魚。日常管理和環境條件同Ren 等[16]。

1.3 采樣及樣品分析

于飼喂7d和56d后采樣, 采樣于禁食12h時進行。試驗魚先用200 mg/L的MS-222麻醉, 隨機選取6尾魚用于采血, 制備血清, 用于血清總膽汁酸(TBA)濃度測定(寧波美康生物科技股份有限公司生產的血清總膽汁酸測定試劑盒)。每箱3尾魚于無菌狀態下取腸道內容物(指腸道中未被吸收的消化物), 采用試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司, 中國)測定膽鹽水解酶(BSH)活性; PEC組和PECM組后腸內容物也用于腸道菌群結構分析, 以驗證飼料中甲硝唑的有效性。腸道菌群采用16S rRNA 法分析, 先用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(Omega, 美國)按其說明書抽提DNA,將提取的 DNA 樣品送往蘇州金維智生物科技股份有限公司進行建庫和擴增, V3+V4區高通量測序。飼養56d后的魚每箱取3尾, 解剖取其肝臟, 甲醛固定后制作石蠟切片, 用masson染色觀察肝臟纖維化程度。其余的魚解剖, 取肝組織液氮速凍后–80℃冰箱保存, 用于FXR、CYP7A1、CYP27A1、ABCB11和NTCP等參與膽汁酸調控、合成和轉運的相關基因的表達分析, 方法同Ren等[13]。所有的魚均用于綠肝率的統計, 方法同Cai等[12], 即由3名視覺正常的實驗者觀察后一致認為肝臟局部或全部有肉眼可見的膽汁樣綠色時, 將其記錄為綠肝魚, 綠肝率(%)=綠肝魚的數量/每缸魚數×100。

1.4 數據分析

數據以平均值mean±SD表示。各處理間差異經方差齊性檢驗后進行Duncan多重比較, 統計軟件為SPSS 19.0, 顯著水平設為P<0.05。

2 結果

2.1 甲硝唑有效性驗證

對PEC組和PECM組黃顙魚腸道內容物行16S rRNA V3+V4區高通量測序分析, 在黃顙魚腸道中共發現20個門的細菌(圖1)。PEC組在飼養7d后豐度較高的為變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes), 分別約占32%、42%和17%, 而PECM組變形菌門豐度最高,約占87%。飼養56d后, PEC組梭桿菌門占比升至85%, PECM組仍以變形菌門為第一優勢菌門, 豐度約占92%。上述結果表明飼料中添加的甲硝唑使腸道菌群結構發生了明顯的改變, 厭氧菌大幅度減少。

圖1 甲硝唑對腸道菌群結構的影響Fig. 1 Metronidazole on the composition of intestinal flora of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco

2.2 綠肝率

由圖 2可知, CON組黃顙魚在7d和56d均無綠肝出現。飼喂7d時CONM組綠肝率達12%, 顯著高于CON組(P<0.05)。PEC組和PECM組均出現綠肝癥狀, 但后者的綠肝率(88%)約為前者(27%)的3倍。飼喂56d后綠肝率均較低, 且各組間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同日糧飼喂黃顙魚7d和56d后綠肝率Fig. 2 The incidence rate of green liver in yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d and 56d respectively同一系列柱上的小寫字母不同表示組間具有統計學差異(P<0.05,n=3); 下同Different letters above the bars of the same series mean significantly different (P<0.05, n=3). The same applies below

2.3 肝組織學

飼養56d后, 肝組織切片masson染色結果顯示,CON組纖維化(藍色信號)不明顯而PEC組纖維化明顯?？傮w上, 纖維化程度由高到低依次為PECM組>PEC組>CONM組> CON組(圖3)。

圖3 攝食不同飼料56d后黃顙魚肝組織masson染色切片照Fig. 3 Masson stained sections of liver tissue of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 56d

2.4 膽鹽水解酶活性和血清總膽汁酸濃度

由圖 4可知, 7d時, CONM和PEC組腸道內容物BSH活性均顯著低于CON組(P<0.05); PECM組顯著低于PEC組(P<0.05)。56d時, CONM組和PEC組BSH活性均顯著低于CON組(P<0.05), PECM組低于PEC組但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同日糧飼喂黃顙魚7d和56d后腸道內容物中膽鹽水解酶活性和血清總膽汁酸濃度Fig. 4 The digesta bile salt hydrolase (BSH) activity and serum total bile acid concentration of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d and 56d respectively

7d時PEC組血清TBA濃度顯著高于CON組(P<0.05), 而CONM和PECM組顯著低于CON組(P<0.05)。56d時, CONM組、PEC組和PECM組血清TBA濃度顯著高于CON組(P<0.05), 且各組間差異顯著, 由高到低為CONM組>PEC組>PECM組>CON組(P<0.05)。

2.5 肝臟膽汁酸合成、轉運及調控基因表達

由圖 5可見, 同CON組相比, PEC組7d后肝臟中fxr、cyp7a1和ntcp基因表達顯著升高(P<0.05),cyp27a1和abcb11基因表達顯著降低(P<0.05)。CONM組fxr、cyp7a1、cyp27a1、abcb11和ntcp基因表達均顯著高于CON組(P<0.05)。同PEC組相比, PECM組fxr基因表達顯著降低(P<0.05),cyp27a1和ntcp基因表達顯著升高(P<0.05)。56d時PEC組fxr、cyp7a1、cyp27a1和abcb11基因表達顯著低于CON組(P<0.05),ntcp無顯著變化。CONM組fxr和cyp27a1表達也顯著低于CON組(P<0.05),cyp7a1、abcb11和ntcp表達則顯著高于CON組(P<0.05)。同PEC組相比, PECM組fxr和ntcp表達無顯著差異(P>0.05),cyp7a1、cyp27a1和abcb11基因表達顯著升高(P<0.05)。

圖5 不同日糧飼喂黃顙魚7d (A)和56d (B)后肝臟膽汁酸合成、轉運及調控相關基因mRNA相對表達Fig. 5 Relative mRNA expression of genes related to liver bile acid synthesis, transport and regulation in the liver of yellow catfish,Pelteobagrus fulvidraco, fed the diets for 7d (A) and 56d (B)

3 討論

3.1 甲硝唑的抑菌作用

由PEC組和PECM組腸道菌群結構分析結果可見, 添加甲硝唑后變形菌門豐度提高, 而厚壁菌門和梭桿菌門的豐度下降。這一結果與甲硝唑對斑馬魚腸道菌群結構的影響一致[14], 表明本研究中添加的甲硝唑沒有在飼料制備過程中被完全破壞, 發揮了抑制腸道厭氧菌的作用。

3.2 腸道菌群結構與綠肝癥和肝纖維化的關聯性

本研究結果顯示, 7d時CON組沒有綠肝癥出現, 但CONM組有12%的魚出現了綠肝癥, PECM組綠肝率則是PEC組的3倍。上述結果暗示腸道菌群失調可能是綠肝癥的重要原因。綠肝癥是肝汁淤積的表現[12,15]。秦艷等[16]和李紅等[17]分析了肝內膽汁淤積癥患兒腸道菌群, 發現患兒腸道菌群紊亂,與本實驗結果一致。

7d 時PECM組變形菌門豐度達到了87%, 遠高于PEC組(圖1)。導致這一結果的原因應該與果膠自身對腸道菌群的影響有關: 研究表明高果膠飲食也會提高腸道變形菌門的相對豐度[18], 從而與甲硝唑的作用相疊加, 最終導致PECM組變形菌門成為絕對優勢菌(圖1)。PECM組綠肝率較PEC組高3倍,這是否與變形菌門豐度提高有關值得關注。飼養56d時各組魚綠肝率均較低(圖2), 這一結果與我們的前期研究一致[12], 可能與體內膽固醇[12]、?；撬醄19,20]等膽汁成分及其合成原料的下降有關。

長期膽汁淤積可損傷肝細胞, 繼而發展為肝纖維化[15]。我們在前期研究中發現, 與CON組相比,PEC組黃顙魚的肝組織發生了明顯的纖維化[12], 這一現象在本實驗中得到重現(圖4)。結合各組綠肝率的差異, 表明黃顙魚肝纖維化也與膽汁淤積有關,而纖維化后肝臟功能障礙則可能是56d時綠肝率反而較低的另一原因。

3.3 腸道菌群引起綠肝癥和肝纖維化的潛在分子機制

腸道菌群在膽汁酸代謝中發揮著重要作用, 它借助BSH和類固醇脫氫酶等通過脫氫、脫羥基和脫硫等作用改變膽汁酸池的組成[21—23], 本研究結果顯示, 添加甲硝唑后BSH活性顯著下降, PEC組BSH活性顯著低于CON組, 表明其膽汁酸的生物轉化效能下降。膽汁酸是法尼醇X受體(FXR)的配體,不同膽汁酸對FXR的激活作用不同甚至相反[24],FXR又影響著膽汁酸的合成與轉運[25]。膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成經典途徑的限速酶, 甾醇27α-羥化酶(CYP27A1)則是替代途徑的限速酶。由本研究結果可見, 7d時CONM組、PEC組和PECM組的fxr和CYP7A1表達均高于CON組, 此外, CONM組和PECM組的cyp27a1也顯著高于CON組(P<0.05, 圖 5), 表明fxr高表達未能有效抑制膽汁酸合成。Na+/?；悄懰釁f同轉運體 (NTCP) 是一種表達于肝細胞基側膜的轉運蛋白, 將肝門靜脈內的?；悄懰徂D運至肝細胞內。NTCP缺陷病的共同臨床特點是高膽汁酸血癥[26]。本研究中7d 時PEC組血清TBA濃度較高, 56d時CONM組TBA含量較高, 然而, 其對應的ntcp表達也均較高, 因此不能用它解釋血清TBA的變化。abcb11編碼膽鹽輸出泵(BSEP), BSEP是肝臟從血液中清除膽汁酸鹽的限速步驟[27]。當BSEP蛋白功能異?；虮磉_減少時, 阻礙膽汁酸外排至膽管, 從而造成肝內膽汁淤積[28]。從本研究結果看, CONM組在56d時abcb11表達量最高(圖5), 但其血清TBA含量也最高(圖4)。上述結果表明與CON組相比, CONM、PEC和PECM組的魚均存在膽汁酸代謝紊亂的情況。大量研究表明腸道菌群失調會引起膽汁酸代謝紊亂[21,22],與本實驗結果相支持。腸道內的膽汁酸除了乳化脂肪促進其吸收外, 還具有信號傳導功能, 通過FXR、G蛋白偶聯膽汁酸受體等調節膽汁酸的合成、轉運及炎性反應[29,30], 腸道菌群失調后膽汁酸代謝紊亂, 這可能是果膠高載引起綠肝癥和肝組織纖維化的重要途徑。

4 結論

本研究再次證明果膠短期高載可致綠肝癥, 長期高載則會引起肝組織纖維化。飼料中添加甲硝唑提高了綠肝率和肝臟纖維化程度, 提示腸道菌群紊亂可能是綠肝癥和肝纖維化的重要原因, 這一病理過程可能由膽汁酸介導。