TGF-β/Smads信號通路介導脯氨酸促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積

榮 華 李德強 馬敏偉 豆騰飛 史慶超 孔令富 畢保良 寧麗軍

(1. 華南農業大學海洋學院, 廣州 510642; 2. 云南農業大學動物科學技術學院, 昆明 650201; 3. 內江師范學院, 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室, 內江 641112)

氨基酸不僅是蛋白質合成的前體分子, 還可以作為信號分子介導一系列通路調控基因表達和蛋白質合成, 進而發揮生理功能, 如亮氨酸、精氨酸及谷氨酰胺等支鏈氨基酸可以作為信號分子激活mTOR、TGF-β和GCN2等通路[1,2]。脯氨酸(Pro)作為膠原蛋白合成的底物, 可以調控膠原蛋白代謝,促進損傷組織的修復[3]。有研究表明, 在復雜的細胞代謝調節機制中, Pro參與調控基因表達、轉錄因子活化、細胞信號轉導和氧化還原反應, 同時在鳥氨酸、精氨酸、多胺、谷氨酸代謝和膠原蛋白合成等方面發揮著重要作用, 且Pro的可用性決定了膠原蛋白生物合成的速率[4,5]。許多研究發現飼料中添加Pro能夠促進魚類膠原蛋白沉積[5—8], 然而關于Pro促進魚類膠原蛋白沉積的作用機制缺乏深入研究。有學者通過對人類Ⅰ型膠原蛋白α2(Col1α2)基因啟動子功能分析發現, 參與Col1α2啟動子內在活性上調的序列位于啟動子-353和-186 bp之間, 這個區域包含多個轉錄因子的結合位點, 包括Smads、Sp1?3和Ets家族等[9]。轉化生長因子(TGF-β)/Smads信號通路是調控膠原蛋白代謝的經典途徑之一, 主要參與細胞外基質膠原蛋白的沉積[10—12]。有學者在探討“脆肉鯇”形成機制時發現, 蠶豆通過上調Smad4基因的表達來激活TGF-β/Smads通路的活性,進而上調Col1α1和Col1α2基因的表達, 最終促進肌肉中膠原蛋白沉積, 改善肌肉品質[13]。Pro促進魚類膠原蛋白沉積是否也受TGF-β/Smads信號通路的調控呢? 目前研究發現許多TGF-β/Smads信號通路的干擾劑, 如積雪草皂苷(Asiaticoside)[14]、β-拉帕醌(β-Lapachone)[15]和氧化苦參堿(Oxymatrine)[16,17]等可以作用于TGF-β/Smads通路中特定配體, 使整個信號通路效應發生變化, 最終導致機體合成膠原蛋白的能力發生相應變化。Oxymatrine的分子式:C15H24N2O2, 是一種來自槐屬植物根部的生物堿,具有抗炎, 抗纖維化和抗腫瘤的作用, 能抑制iNOS表達和TGF-β/Smads信號通路, 已在醫學上被廣泛應用于癌癥藥物的開發[18]。

淺色黃姑魚(Nibea coibor)俗稱白奈, 隸屬鱸形目, 石首魚科, 黃姑魚屬, 該魚生長快、魚鰾大、營養價值高, 是我國東南沿海地區用于生產名貴魚膠(白花膠, 目前市場價格為10000—15000元/kg)的重要海水養殖品種[19]。魚膠(魚鰾的干制品)富含膠原蛋白, 營養價值極高, 與燕窩、魚翅齊名, 系“海洋八珍”之一, 又有“海洋人參”之譽[20]。然而, 目前關于魚鰾膠原蛋白的研究鮮有報道, 嚴重制約了魚膠產業的快速發展和規?；M程。筆者前期研究發現Pro對淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白沉積具有促進作用, 并推測TGF-β/Smads信號通路潛在參與Pro促進魚鰾膠原蛋白沉積的調控[6,7,21], 然而以上推測還需進一步證實。因此, 本研究在添加Pro后, 利用Oxymatrine干擾TGF-β/Smads信號通路, 分析Pro添加/干擾前后, 魚鰾膠原蛋白沉積的變化情況, 驗證TGF-β/Smads信號通路參與調控 Pro促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積。實驗結果可以豐富魚類膠原蛋白代謝研究的基礎理論, 為魚類膠原蛋白代謝的營養調控提供新思路和新方法, 對深度挖掘和高效利用海洋產膠魚類魚鰾資源具有重要的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 飼料配置

1.2 實驗魚及飼養管理

養殖實驗在廣東省汕頭市南澳縣汕頭大學海洋生物臨海實驗站中進行。淺色黃姑魚購自當地的一個苗種孵化場。在幼魚購回后, 暫養在一個大的浮動網箱(3 m×3 m×2 m, 長×寬×深)2周, 期間投喂商業飼料(粗蛋白40.0%, 粗脂肪10.0%, 揭陽通威,中國)。實驗前, 魚先禁食24h, 同時用40 mg/L丁香酚溶液(阿拉丁試劑有限公司, 中國)麻醉, 稱重并分組。225條實驗魚(11.621±0.154) g被隨機分入9個網箱(1 m×1 m×1.5 m, 長×寬×深), 25尾魚/網箱。

2組等氮等脂的實驗飼料配制參考前期研究[6],以魚粉、混合氨基酸和結晶氨基酸為主要蛋白來源, 魚油為主要脂質來源。Blank組無額外添加Pro;Pro組添加15 g/kg Pro, 用丙氨酸來平衡各實驗飼料中的氮, 參考美國國家科學研究委員會(NRC, 2011)中大黃魚的營養需求設計其他營養成分的含量。實驗飼料原料組成和營養成分如表 1所示, 飼料氨基酸組成如表 2所示。飼料原料過60目篩, 經充分徹底混合, 用2.5 mm直徑的膨化機制粒, 在自然通風環境中風干。干顆粒飼料被密封在塑料袋里存儲在?20℃, 直到使用。3個網箱一組被隨機分配到3個處理組(Blank、Pro和Oxymatrine), Blank為空白組, 飼喂Pro零添加飼料, Pro和Oxymatrine實驗組飼喂Pro添加飼料。開展為期8周的養殖實驗, 在第4周后開始干擾實驗。Oxymatrine實驗組采用腹腔注射氧化苦參堿(Oxymatrine)。Oxymatrine試劑購買于MedChem-Express(MCE)公司(中國, 上海), 粉末狀的Oxymatrine在使用前用含DMSO的溶劑溶解, 然后用生理鹽水按1﹕20比例稀釋成注射液。一定濃度的DMSO對魚體有毒副作用, 結合預實驗結果: 實驗魚腹腔注射液體100 μL/次無死亡, 首先確定了Oxymatrine的稀釋及注射方案如下: 在超聲輔助下100 mg Oxymatrine溶于1 mL DMSO(100 mg/mL),并按照上述方案稀釋成注射液(終濃度5 mg/mL)。參考文獻確定給藥量為10 mg/kg[16,17], 當時魚重約50 g, 所以按照100 μL/尾給藥。為了消除注射應激和溶劑對魚體基礎代謝的影響, 減少實驗系統誤差,Blank和Pro實驗組等量注射Oxymatrine的溶劑。在8周的飼養期內, 每天人工飽食投餌兩次(07:00和16:30), 觀察記錄魚的健康狀況及環境變化等, 在實驗過程中, 光照時間13—14h, 溫度23—30℃, pH 7.8—8.1, 氨氮低于0.05 mg/L, 鹽度31—33 g/L, 溶解氧5.2—6 mg/L。

表1 實驗飼料配方及近似成分Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets

表2 實驗飼料的氨基酸組成Tab. 2 Amino acid contents of experimental diets (μmol/g dry matter)

1.3 樣品采集

養殖實驗結束后, 停食24h, 采用丁香酚(100 mg/L,上海試劑, 中國)麻醉, 稱重并計數, 計算魚的生長和飼料利用率。每個網箱隨機選取6尾實驗魚, 測量個體體重和體長, 計算肥滿度和特定生長率等指標; 屠宰取魚鰾稱重, 計算鰾體比, 將魚鰾置于–20℃用于后續膠原蛋白含量的測定。采集肝臟用于組織切片觀察, 取出的肝臟(右側)分成小塊(1 cm×1 cm)固定于Bouin’s 液中。此外, 另取4尾/網, 用于采集魚鰾組織, 將樣本分成兩份, 一份置于–20℃用于后續氨基酸分析, 另一份快速收集好后立即浸入液氮, 隨后儲存在–80℃用于RNA的提取和基因表達分析。

1.4 肝臟組織形態學檢測

肝臟組織形態學檢測在武漢賽維爾生物科技有限公司協助下完成, 實驗步驟簡單介紹如下: 將新鮮的組織樣品通過4%多聚甲醛固定24h; 用75%酒精-無水乙醇按梯度脫水6h; 使用二甲苯透明2次, 每次10min, 浸蠟3次, 每次1h; 包埋, 冷卻; 切片, 切片厚度控制在5—6 μm; 烤干, HE染色, 脫水封片, 染色結果: 細胞核藍色, 細胞質紅色; 最后進行顯微鏡鏡檢, 利用Case Viewer軟件進行圖像采集分析。

1.5 氨基酸測定

飼料和魚體組織氨基酸組成采用液相色譜-質譜聯用儀TSQ-Endura(Thermo Scientific Dionex,USA), 根據國家標準方法(GB/T 18246-2000)進行測定, 用液相色譜質譜聯用儀測的每種氨基酸的單一峰, 根據出峰時間和峰高計算出峰面積, 根據標準品氨基酸測得的標準曲線(濃度為橫軸, 峰面積為縱軸), 計算出單一氨基酸在樣品中的絕對濃度,根據樣品處理過程中的稀釋倍數, 計算出干物質中氨基酸的含量, 由于色氨酸在酸水解后不能被檢測到, 因此, 沒有測定出色氨酸的數值。

1.6 膠原蛋白含量測定

Hyp含量測定采用試劑盒(Art. No. A030-2; 南京建成生物工程研究所, 南京, 中國)對樣品進行處理。操作方法參考制造商的說明書, 使用Infinite?Pro 200酶標儀(Tecan, 瑞士)分析樣品, 用酶標儀在550 nm波長下測定吸光度, Hyp濃度由標準品根據公式計算得到。膠原蛋白的含量由Hyp的含量乘以8估算得到(AOAC, 2002)。因為Hyp幾乎只存在于膠原蛋白中, 而且因膠原蛋白結構的特殊性, Hyp含量在膠原蛋白中相對固定為12.5%。因此, 常用Hyp的含量來計算組織中膠原蛋白的含量。

1.7 基因表達分析

魚鰾組織中總RNA提取根據TRIzol (Invitrogen?)試劑說明書使用氯仿-異丙醇法萃取, 利用DNase Ⅰ消化去除污染基因組DNA (TaKaRa), 通過1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠分析確定其完整性和質量,利用Nanodrop?ND-2000分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop, USA)測定260/280 nm處的吸光度, 從而確定RNA的最終濃度。RNA反向轉錄成cDNA使用TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit (Trans Gen生物技術, 北京)。簡單介紹如下: 2 μg總RNA與1 μL Oligo(dT)18, 10 μL 2×TS反應混合液, 1 μL TransScript?RT/RI混合酶, 1 μL gDNA去除劑混合后補DEPC水至20 μL。在42℃下孵育15min, 然后加熱到85℃,5s滅活gDNA去除劑和TransScript?RT/RI酶。cDNA存儲在–20°C, 直至使用。

利用Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft International, Palo Alto, USA)根據大黃魚Larimichthys crocea、鱖Siniperca chuatsi和鱸Micropterus salmoides等的相關基因核心序列保守區設計該基因的特異性引物(表3), 引物均由華大基因(北京基因組研究所, 深圳)合成。采用應用生物系統VeritiTM熱循環儀(Thermo Fisher Scientific, USA)進行聚合酶鏈式反應(PCR), 擴增目的基因DNA片段。PCR片段在1.2% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測, 確認產物大小與預期相符后, 將PCR產物送華大基因(北京基因組研究所、深圳)測序, 序列在NCBI上進行比對確認。

表3 膠原蛋白代謝相關基因的RT-PCR引物序列Tab. 3 Sequences of real-time PCR primers for gene of collagen metabolism

按如下體系配置20 μL的qRT-PCR反應混合液:2 μL cDNA、7 μL DEPC水、10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ (Takara)和1 μL引物(管家基因或目標基因), 20 μL反應混合液在實時熒光定量PCR儀上運行(Roche Light Cycler? 480 System, 瑞士)。使用ΔΔCt相對量化計算方法, 先使用管家基因(βactin)進行歸一化處理, 3個樣本, 每個樣本一式3份被用來計算平均Ct, ΔCt=目標基因Ct–管家基因Ct。ΔΔCt=每個樣本處理組ΔCt/控制組ΔCt(實驗參考)。相對量化的表達式2–ΔΔCt表示為目標基因處理組與控制組的相對表達量?；虮磉_繪圖使用倍數變化(Fold change)法, 主要用了一個if函數,Fold change=IF(值>1; 值, –1/值), 將相對表達量換算成倍數變化。

1.8 計算與統計分析

特定生長率(Specific growth rate, %/d)=[Ln終末體重(g)?Ln初始體重(g)]/天數×100

餌料系數(Feed coefficient,FC)=采食量(g)/[終末體重(g)–初始體重(g)]

魚鰾器官指數(Swim bladder somatic index,SB-SI)=100×魚鰾重(g)/魚體重(g)

存活率(Survival rate,SR, %)=100×終末魚數/初始魚數

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×魚體重(g)/體長(cm)3

所有數據均采用SPSS 20.0程序(SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA)進行單因素方差分析(One-way ANOVA, LSD), 并采用Tukey進行組間顯著性檢驗。數據以“平均值±標準誤”(mean±SE)呈現,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 添加Pro及注射Oxymatrine對淺色黃姑魚生長性能的影響

如表 4所示, 特定生長率(SGR)、餌料系數(FC)、肥滿度(CF)、鰾體比(SBSI)及存活率(SR)各項指標在Blank組、Pro組和Oxymatrine組間均無顯著差異(P>0.05)。且各組存活率均≥90%, 由此可以看出實驗魚能很好的適應實驗條件, 且干擾劑注射沒有對魚體健康造成重大影響。

表4 飼料中添加Pro并用Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚生長性能比較分析Tab. 4 The effect of inhibitors on growth performance of N.coibor fed diets with Pro of optimal level

2.2 添加Pro及注射Oxymatrine對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的影響

如圖 1所示, Pro組顯著高于Blank組和Oxymatrine組(P<0.05), 說明飼料中添加Pro促進了魚鰾中膠原蛋白的沉積, 而腹腔注射干擾劑可以抑制膠原蛋白的沉積。

圖1 飼料中添加Pro及Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量(g/kg濕重)的影響Fig. 1 The effect of adding Pro in feed and Oxymatrine interference on the collagen content (g/kg wet matter) in swim bladder of N. coibor上標中不同字母表示處理組間存在顯著差異(P<0.05; n=3)The absence of identical letters in the superscript indicate significant differences among the groups (P<0.05; n=3)

2.3 添加Pro及注射Oxymatrine對淺色黃姑魚魚鰾中氨基酸組成的影響

如表5所示, 在魚鰾中, 有11種氨基酸(Pro、Glu、Gly、Ala、Thr、Tyr、Met、Leu、Ser、Lys和Asp)受影響(P<0.05), 剩余氨基酸水平相對穩定。通過多重比較分析Pro添加或注射干擾劑Oxymatrine對氨基酸代謝的影響, 如Pro和Oxymatrine組與Blank組比較發現, 添加Pro導致淺色黃姑魚魚鰾中一些氨基酸含量升高, 如Pro、Glu、Asp、Met和Ser; 同時也會導致Tyr、Ala和Thr含量降低。通過Oxymatrine組與Pro組比較發現, 注射干擾劑Oxymatrine會導致Glu和Ala含量升高, 同時導致Leu、Lys和Gly含量降低。

表5 飼料中添加Pro并用Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚魚鰾氨基酸組成的影響Tab. 5 The effect of inhibitors on collagen in swim bladder of N.coibor fed diets with Pro of optimal level (10 μmol/g dry matter)

2.4 Oxymatrine腹腔注射對淺色黃姑魚肝臟組織結構的影響

干擾劑Oxymatrine的溶劑中含有DMSO等有害成分, 可能會對魚體健康造成危害, 實驗中需要分析這種潛在危害程度。因此, 我們進行了肝臟組織切片分析, 通過形態學觀察發現各實驗組肝臟組織結構完整, 細胞排列緊密, 胞質界限分明且細胞數量較多, 無病理性現象(圖2)。

圖2 Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚肝臟組織結構的影響Fig. 2 Effect of Oxymatrine interference on the liver tissue structure of N. coiborH1、H2和H4分別為Blank組、Pro組和Oxymatrine組的淺色黃姑魚肝臟組織結構圖H1, H2 and H4 have shown the liver organization structure of N. coibor in the Blank group, Pro group and Oxymatrine group, respectively

2.5 Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關基因表達的影響

如圖 3所示,Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)、TGFβ和Smad2基因相對表達量在Pro組中均顯著高于Blank組(P<0.05), 說明飼料中添加Pro, 上調了這些基因的表達。同時, Oxymatrine組與Pro組比較發現, 這些基因也存在顯著差異, 說明Oxymatrine干擾導致這些基因顯著下調。除此以外, 淺色黃姑魚魚鰾中P4Ha(Ⅱ)、P4Ha(Ⅲ)、TGF-βRT、Smad3、Smad4和Smad7基因的表達相對穩定, 均不受干擾和Pro添加的影響(P>0.05)。

圖3 與空白對照組相比, Pro添加組和Oxymatrine干擾組膠原蛋白代謝相關基因表達的變化情況Fig. 3 Compared with the blank control group, ratio changes of collagen metabolism related genes expression in Pro added and Oxymatrine interference groups以對照組為基線, X軸上的數值大于0表示與對照組相比表達上調, 具體數值代表上調的倍數。相反小于0表示表達下調, 具體數值的絕對值代表下調的倍數; “*”個數不同代表了相應處理組間具有顯著差異(P<0.05; n=3)Taking the control group as the baseline, a value greater than 0 on the X-axis indicates that the expression is up-regulated compared with the control group, and the specific value represents the fold of the up-regulation. On the contrary, less than 0 means downregulation, and the absolute value of the specific value represents the fold of down-regulation; The different number of “*”represents a significant difference between the corresponding treatment groups (P<0.05; n=3)

3 討論

鑒于Pro作為膠原蛋白合成的必需底物, 許多研究發現飼料中添加Pro對膠原蛋白沉積具有一定影響[3—8], 然而, 至今關于Pro促進膠原蛋白代謝的作用機制研究鮮有報道。作者前期開展了一系列相關研究, 發現飼料中添加Pro顯著增加了黃姑魚魚鰾中膠原蛋白含量[6]。深入研究發現, Pro添加上調了魚鰾細胞中膠原蛋白基因(Col1α1和Col1α2)的表達, 同時被上調的還有TGF-βRT和Smad2等基因[7]。TGFβ/Smads信號通路是調控基質膠原蛋白代謝的經典途徑[22—25]。進一步對TGF-β/Smads通路中相關基因及Col1α1和Col1α2基因表達、魚鰾中膠原蛋白含量與Pro的添加水平展開聚類和相關分析, 發現Pro促進雙棘黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積潛在受到TGFβ/Smads信號通路的調控[7]; 為了進一步驗證TGFβ/Smads信號通路在調控Pro促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的重要作用, 本研究在飼料中添加Pro和注射TGF-β/Smads通路抑制劑Oxymatrine, 分析添加或干擾前后, 淺色黃姑魚生長、魚鰾中氨基酸及膠原蛋白含量的變化。Pro的添加和抑制劑干擾對淺色黃姑魚的生長沒有顯著影響, 但能導致魚鰾部分氨基酸及膠原蛋白含量發生顯著變化。其中Pro、Glu、Gly、Ala、Thr、Tyr、Met、Leu、Ser、Lys和Asp受到Pro添加或干擾的顯著影響。Li等[26]報道了機體氨基酸組成受到飼料AA組成的影響, 可能因為這些氨基酸的代謝與Pro的代謝途徑有共通之處。例如, Pro在一些哺乳動物的小腸合成Glu,Pro、Hyp、Arg和鳥氨酸影響彼此的新陳代謝[4]。AA之間存在著非常復雜的相互關系, 本研究也僅為復雜的AA代謝及其相互作用提供簡單依據。另外,魚鰾中Pro含量與飼料中Pro添加水平一致, 而魚鰾中膠原蛋白含量與之恰好相反, 受Oxymatrine干擾的顯著影響, 說明Pro雖然是膠原蛋白合成的重要底物, 但Pro并不是膠原蛋白含量的有效“指示劑”。這也符合Li 等[4]的研究報道, 自然界中不存在(或存在極少)游離的Hyp, Hyp只存在于膠原蛋白中, 所以常用Hyp, 而不是Pro含量來計算膠原蛋白蛋白含量。Oxymatrine干擾還引起了魚鰾中一些非必需氨基酸AA含量的變化, 主要有Gly、Glu及Ala, 間接反映了Oxymatrine干擾沒有導致生長受影響, 因為均衡的必需氨基酸組成是動物生長和維持機體氮平衡的重要反饋。分析肝臟組織形態是了解機體健康情況的一個重要手段。機體對藥物的耐受力有限, 過度的給藥會導致機體肝腎代謝負擔過重, 長期給藥會導致組織受損, 危及動物健康。本研究通過肝臟形態學檢測, 觀察注射干擾劑對淺色黃姑魚健康的影響。結果顯示各實驗組中的肝臟切片細胞界限較為明顯, 細胞核清晰可見, 無細胞核朝質膜移位等肝臟病變現象。結合實驗中生長數據及死亡率分析, 說明我們給藥量和頻率是實驗魚可承受的, 實驗結果可為其他魚類相關實驗提供科學借鑒。

值得注意的是, Pro對淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積具有顯著的促進作用, 而Oxymatrine干擾對淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白沉積表現出顯著的抑制效果。許多研究都發現了Oxymatrine具有抑制膠原蛋白合成的作用[16—18], 特別是Oxymatrine可以通過抑制TGF-β/Smads途徑, 減輕不同組織損傷修復過程中的纖維化[18]。本研究隨后對TGF-β/Smads通路中相關基因進行表達量分析, 發現Pro顯著上調了Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)和TGF-β基因的表達, 說明Pro促進膠原蛋白沉積, 可能是通過調控這些基因的轉錄來實現的, 特別是Ⅰ型膠原蛋白基因Col1α1和Col1α2顯著受到Pro的影響。另一方面,通過Oxymatrine干擾, 顯著降低了Pro介導的淺色黃姑魚魚鰾中Col1α1、Col1α2、TGF-β和Smad2基因的表達, 膠原蛋白的沉積也隨著顯著下調。有研究表明TGF-β在促膠原發生過程中是關鍵的信號啟動并通過TGF-βRT受體(TGF-βRTI、TGF-βRTII和TGF-βRTIII)將信號傳遞給Smads, 激活通路促進蛋白的合成[27,28], 其中, 一類正調控的Smads蛋白(RSmads), 即Smad2和Smad3, 在激活目標基因Col1α2的表達上尤為重要[29]。Wu等[30]的研究結果也發現, Oxymatrine能有效抑制TGF-β1、Smad3和CBP基因的表達, 同時促進肝臟中Smad7的表達。綜上所述, Pro可能通過激活TGF-β信號, 將信號傳遞給胞質中Smad2/3, 進而激活了Col1α2基因的瞬時過表達, 最后導致魚鰾中膠原蛋白的沉積增加。通過Oxymatrine干擾, 特異性抑制了Smad2/3, 使得Smad3和Smad2結合下降, 導致傳遞到細胞核內的信號減弱, 下調了Col1α2基因的轉錄, 最后抑制了淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白合成。

綜上所述, 飼料中添加Pro和注射抑制劑Oxymatrine對淺色黃姑魚的生長的影響不顯著, 但能顯著影響魚鰾中膠原蛋白的沉積。具體表現為Pro顯著上調了Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)和TGF-β基因的表達, 同時促進了魚鰾中膠原蛋白沉積; 而Oxymatrine干擾顯著抑制了TGF-β/Smads通路中Col1α1、Col1α2、Smad2和TGF-β基因的表達, 且魚鰾中膠原蛋白含量也隨之降低。因此, 可以證實Pro促進淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積受到TGFβ/Smads信號通路的調控, 且Col1α1、Col1α2、TGFβ和Smad2基因在其中起著重要作用。

致謝:

感謝汕頭大學理學院海洋生物研究所為本實驗提供實驗場所, 溫小波教授和林帆博士對文稿所提的寶貴意見。