LncRNA XIST靶向miR-132-3p影響人宮頸癌細胞株Hela增殖、侵襲和遷移*

鮑 慧 孫曉東 喬 健 賀 晶

宮頸癌是原發于子宮頸部的惡性腫瘤。全球范圍內，宮頸癌年齡標準化發病率為13.1/10萬，年齡標準化死亡率為6.9/10萬，嚴重影響婦女健康[1]。目前宮頸癌治療手段包含靶向藥物治療以及以手術為主并輔以放、化療的治療，雖然具有一定療效，但存在很大局限性以及毒副作用，而基因治療已成為當今腫瘤治療研究的熱點[2]。長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)和微小RNA(miRNA)在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。XIST是具有廣泛生物學作用的LncRNA，參與結直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程[3，4]； miR-132-3p在套細胞淋巴瘤等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程也發揮重要功能[5]；已有研究報道XIST可促進宮頸癌的發生和發展[6]。然而miR-132-3p在宮頸癌中發揮的功能未知。有研究發現XIST可靶向miR-132-3p調控結直腸癌發生發展[7]，但XIST能否通過靶向miR-132-3p調控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移尚未可知。有研究發現miR-132-3p可通過靶向性別決定因子同源盒4(SOX4)調控肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[8]；且已有報道指出SOX4可通過調控上皮-間質轉化(EMT)調節宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移[9]。LncRNA XIST能否通過靶向miR-132-3p調控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移未知。鑒于此，本研究選取人宮頸癌細胞株Hela進行體外細胞實驗，探究XIST對調控宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞和試劑：人宮頸癌細胞株Hela(購自歐洲標準細胞收藏中心，批號EC-0101)；脂質體(Lipofectamine 2000)轉染試劑盒(購自美國英杰生命技術有限公司，生產批號11668-019)；干擾-XIST(si-XIST，合成序列：5’-AAA GCU AAG AUA AAU GGA AGA-3’)質粒、干擾-對照(si-NC，合成序列：5’-UGC CCA GGA AGU UAC CUU AAG-3’)質粒、過表達-XIST(pcDNA3.1-XIST，合成序列：正義鏈5’-AAC CAA AUC AAA GAU GUC CGG-3’，反義鏈5’-CAA GUA AGG UUC CGG CAU UCU-3’)質粒、pcDNA3.1-XIST對照(pcDNA3.1-control，合成序列：正義鏈5’-AGC AGG UGC GGG UUA GAA GGU-3’，反義鏈5’-UAA ACC AAG CGU AUC UGU CCA-3’)質粒、野生型和突變型XIST報告基因質粒(野生型pGLO-XIST和突變型pGLO-XIST)、野生型和突變型SOX4報告基因質粒(野生型pGLO-SOX4和突變型pGLO-SOX4)(由百奧邁科生物技術有限公司合成)；甲基噻唑藍(MTT)溶液(購自北京索萊寶科技有限公司，生產批號M1025)；侵襲小室(Transwell，孔徑5μm)、基質膠(購自美國康寧公司，生產批號3422、354277)；結晶紫染色液(購自上海復申生物科技有限公司，生產批號FS0466)；總RNA提取試劑(購自北京雷根生物技術有限公司，生產批號NR0002)；XIST、miR-132-3p、SOX4、細胞增殖抗原標記物(Ki-67)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、U6、β-肌動蛋白(β-actin)聚合酶鏈反應(PCR)引物(由重慶威斯騰生物醫藥科技有限公司合成)；鼠抗人SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、β-actin單克隆抗體(一抗)，兔抗鼠SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2、β-actin辣根過氧化物酶標記多克隆抗體(二抗)(購自北京冬歌博業生物科技有限公司，生產批號H00006659-A01、NBP2-22112、2926P、ab228022、ab8978、12015-01、BM3501-01；PAB14638、BS1454、BS2436、C1817、3932S、BS1236、LS-C212187)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(購自上海李記生物科技有限公司，生產批號AC19L022)。

1.1.2 儀器：AE31型熒光顯微鏡(購自麥克奧迪實業集團有限公司)；Gemini EM型酶標儀[購自美谷分子儀器(上海)有限公司]；IX83型倒置顯微鏡(購自日本奧林巴斯)；M402118型核酸蛋白檢測儀(購自北京海富達科技有限公司)；7500型PCR儀(購自美國ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將人宮頸癌細胞株Hela接種至含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的杜氏培養液(DMEM)中，于37℃、5%CO2條件下培養。

1.2.2 轉染和分組：待細胞生長至對數期時接種至24孔板培養，當細胞融合度達到85%時，參照Lipofectamine 2000說明書分別將si-XIST、si-NC、pcDNA3.1-XIST、pcDNA3.1-control質粒轉染至人宮頸癌細胞株Hela，分別記為XIST下調組、下調對照組、XIST上調組、上調對照組，轉染成功細胞呈綠色熒光。XIST下調組、下調對照組、XIST上調組、上調對照組轉染效率分別為(89.64±16.92)%、(84.07±15.14)%、(80.14±14.08)%、(83.79±15.78)%。見圖1。另取未處理人宮頸癌細胞株Hela，記為空白組。每組設6個復孔。

圖1 各組細胞轉染效率(熒光顯微鏡，×100，刻度尺：100μm)

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖活性：轉染48h后，收集各組細胞，調整細胞密度為5×103個/ml，接種至96孔板(100μl/孔)，37℃、5%CO2培養48h，加入MTT溶液(20μl/孔)，混勻避光孵育4h，棄上清，加二甲基亞砜(150μl/孔)，混勻后置于酶標儀檢測波長490nm處光密度值。各組細胞增殖抑制率=(空白組光密度值-實驗組光密度值)/空白組光密度值×100.00%。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力：轉染48h后收集各組細胞，胰酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌，調整細胞密度為1×105個/ml，向預先用基質膠包被的Transwell小室上室加150μl細胞懸液，下室加含血清培養基，常規培養24h；磷酸鹽緩沖液淋洗，小心擦去微孔膜內層細胞，乙醇固定5min，結晶紫染色，倒置顯微鏡計數穿膜細胞數，每組隨機選取5個視野，取平均值。檢測細胞遷移能力時，小室上室無需基質膠包被基底膜，其余步驟與細胞侵襲能力檢測方法相同。

1.2.5 實時逆轉錄PCR(RT-qPCR)檢測細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達：轉染48h后，參照總RNA提取試劑說明提取各組細胞總RNA，核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，稀釋RNA濃度為40μg/ml。逆轉錄為互補脫氧核糖核酸后用PCR儀進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃變性5min，95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，40個循環。引物序列見表1。采用2-△△Ct法[10]計算待測基因相對表達量。其中選取U6為miR-132-3p內參基因，β-actin為其余基因的內參基因。

表1 PCR引物序列

1.2.6 免疫印跡法(WB)檢測細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達：轉染48h后，收集各組細胞，加入細胞裂解液，獲取各組細胞蛋白質。BCA法定量蛋白，蛋白樣品以4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，電泳，轉膜，封閉，加入一抗(稀釋倍數1∶1 000)4℃孵育，次日加入辣根過氧化物酶標記二抗(稀釋倍數為1∶5 000)，室溫孵育1h，顯色反應，分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參照，目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值即為該蛋白相對表達量。

1.2.7 LncRNA XIST靶向調控miR-132-3p驗證：應用生物信息學軟件StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測LncRNA XIST的miRNA結合位點。分別將野生型XIST、突變型XIST與miR-132-3p mimic、miR-NC共轉染至人宮頸癌細胞株Hela，嚴格按照試劑盒說明書應用雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-132-3p mimic組和miR-NC組中XIST相對熒光強度，相對熒光強度=螢火蟲熒光素酶熒光強度/海腎熒光素酶熒光強度。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較

各組細胞增殖抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。與空白組、下調對照組和上調對照組比較，XIST下調組細胞增殖抑制率上升(t均>13.21，P<0.01)，XIST上調組細胞增殖抑制率下降(t均>13.21，P<0.01)；與XIST下調組比較，XIST上調組細胞增殖抑制率下降(t=18.96，P<0.01)，空白組、下調對照組、上調對照組間細胞增殖抑制率差異無統計學意義(t均=0，P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較

2.2 各組細胞侵襲、遷移能力比較

各組細胞侵襲數目和遷移數目差異均有統計學意義(P<0.01)。與空白組、下調對照組和上調對照組比較，XIST下調組細胞侵襲和遷移數目均減少(t均>3.24，P<0.01)，XIST上調組細胞侵襲和遷移數目增多(t均>3.07，P<0.05或P<0.01)；與XIST下調組比較，XIST上調組細胞侵襲和遷移數目增多(t均>9.24，P<0.01)，空白組、下調對照組、上調對照組間細胞侵襲數目和遷移數目差異無統計學意義(t均<0.86，P>0.05)。見圖2、3和表3。

圖2 各組細胞侵襲能力變化(結晶紫染色，×200，刻度尺：30μm)

圖3 各組細胞遷移能力變化(結晶紫染色，×200，刻度尺：30μm)

表3 各組細胞侵襲、遷移數目(個，

2.3 各組細胞XIST、miR-132-3p水平及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達比較

各組細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達差異均有統計學意義(P<0.01)。與空白組、下調對照組和上調對照組比較，XIST下調組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達下降、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達升高，差異有統計學意義(t均>2.32，P<0.05或P<0.01)，XIST上調組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達升高、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達下降，差異有統計學意義(t均>2.02，P<0.05或P<0.01)；與XIST下調組比較，XIST上調組細胞XIST表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2 mRNA表達上升、miR-132-3p表達和E-cadherin mRNA表達下降，差異有統計學意義(t均>2.08，P<0.05或P<0.01)?？瞻捉M、下調對照組和上調對照組間各指標差異無統計學意義(t均<0.71，P>0.05)。見表4。

2.4 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達比較

各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達差異均有統計學意義(P<0.01)。與空白組、下調對照組和上調對照組比較，XIST下調組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達下降、E-cadherin蛋白表達上升，差異有統計學意義(t均>5.46，P<0.01)，XIST上調組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達上升、E-cadherin蛋白表達下降，差異有統計學意義(t均>7.64，P<0.01)；與XIST下調組比較，XIST上調組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2蛋白表達上升、E-cadherin蛋白表達下降，差異有統計學意義(t均>10.20，P<0.01)?？瞻捉M、下調對照組和上調對照組各蛋白表達差異無統計學意義(t均<0.01，P>0.05)。見圖4、表5。

表4 各組細胞XIST、miR-132-3p表達及SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA表達

表5 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達

圖4 各組細胞SOX4、Ki-67、CyclinD1、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白表達(WB)

2.5 LncRNA XIST靶向調控miR-132-3p

生物信息學軟件StarBase預測XIST與miR-132-3p存在相似結合位點，見圖5。在轉染野生型XIST細胞中，miR-132-3p mimic組細胞相對熒光強度低于miR-NC組細胞(t=4.58，P<0.05)；在轉染突變型XIST細胞中，miR-132-3p mimic組細胞相對熒光強度與miR-NC組細胞差異無統計學意義(t=0.31，P>0.05)，見圖6。

圖5 XIST與miR-132-3p潛在結合位點

注：與野生型XISTmiR-NC組比較，*P<0.05

3 討 論

本研究結果顯示，與空白組、下調對照組和上調對照組比較，XIST下調組細胞增殖抑制率上升、細胞侵襲和遷移數目減少，XIST上調組細胞增殖抑制率下降、細胞侵襲和遷移數目增多。以上結果顯示，XIST在宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移過程發揮促進作用，miR-132-3p在宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移過程發揮抑制作用。

本研究結果表明XIST過表達可增強人宮頸癌細胞株的增殖、侵襲與遷移能力，而低表達可降低其增殖、侵襲與遷移能力，表明調控LncRNA XIST可影響人宮頸癌細胞株的惡性生物學行為。EMT與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移過程密切相關，有報道表明XIST可通過靶向miR-133a調控SOX4調節EMT過程從而調控膠質瘤細胞增殖和轉移[11]。有研究指出miR-132-3p可直接靶向SOX4促進骨肉瘤細胞增殖[12]。LncRNA XIST參與惡性腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲的作用途徑包括影響細胞周期、調控MMP-2和MMP表達等。另有研究顯示[13]，LncRNA XIST表達與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、肌層浸潤等均有關，且其高表達能夠增加復發率、縮短無進展生存期和總生存期。由此可知LncRNA XIST可參與宮頸癌的發生與發展。據此推測，XIST和miR-132-3p可能通過靶向SOX4調控EMT過程從而調節宮頸癌的發生發展。本研究還顯示，XIST過表達可促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin和miR-132-3p表達；miR-132-3p沉默表達可促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin表達。以往研究顯示XIST在不同腫瘤中發揮不同調節功能，袁甫軍等[14]指出XIST可抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移能力，發揮抑癌作用；周明龍等[15]發現抑制XIST 可抑制CyclinD1，抑制肝癌細胞增殖；徐倩等[16]研究發現抑制XIST表達，可抑制MMP-2表達，抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力，發揮促癌作用。

本研究還發現，雙熒光素酶實驗結果顯示miR-132-3p mimic可抑制野生型XIST質粒轉染細胞相對熒光強度，但對突變型XIST質粒轉染細胞無影響，證明XIST可直接靶向調控miR-132-3p。miR-132-3p在不同腫瘤中也發揮不同調節功能，Wang 等[17]指出miR-132-3p在非小細胞肺癌中處于高表達狀態，過表達miR-132-3p可促進非小細胞肺癌細胞增殖，發揮促癌作用；牛文惠等[18]指出miR-132-3p可通過靶向SOX4抑制EMT發生過程，調控E-cadherin和Vimentin表達，調節耐藥細胞的增殖、侵襲和遷移能力；Zhao等[19]指出SOX4可調控 Ki-67、Cyclin D1、MMP-2表達，調節黑色素瘤的增殖與侵襲；He等[20]指出SOX4通過調控Ki-67、CyclinD1表達，提高急性髓性白血病細胞的增殖能力；Meng等[21]指出SOX4可調控E-cadherin和Vimentin表達，調節宮頸癌的腫瘤生長和轉移。本研究結果與上述肝癌、黑色素瘤、急性髓性白血病研究結果相同，與乳腺癌、非小細胞肺研究結果相反，可能與XIST和miR-132-3p功能具有多向性，在不同腫瘤環境發揮不同功能相關。有研究發現XIST可直接靶向miR-132-3p加重急性肺損傷[22]，同時也有研究指出了miR-132-3p對SOX4的靶向作用[23]，本研究與兩者研究結果一致，證實了XIST對miR-132-3p的直接靶向作用。

綜上所述，XIST可能通過靶向調控miR-132-3p表達，促進SOX4、Ki-67、CyclinD1、Vimentin、MMP-2表達，抑制E-cadherin表達，發揮促癌作用。本研究首次發現在宮頸癌中miR-132-3p發揮抑癌功能以及XIST對miR-132-3p直接靶向作用，提示XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點，有助于指導宮頸癌靶向治療研究，具有創新性和重要意義，同時也有望減輕宮頸癌患者的痛苦、延長其生存期。

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本文第一作者簡介：

鮑 慧(1982-)，女，漢族，副主任醫師，研究方向：婦科腫瘤