STRAP、Ki-67表達對乳腺癌新輔助化療后腫瘤殘余的評估價值

張偉強 王鳳琴 姚文娟 吳冬梅 仝志超 張婉琳 于 婧

乳腺癌是致癌因子作用于乳腺上皮細胞，使其發生增殖失控進而惡變的一種病理變化[1]。即使近年來我國乳腺癌篩查率不斷增加，但部分患者就診時即為局部晚期乳腺癌，極難通過手術切除治療[2]，大多采取新輔助化療。新輔助化療通過抑制腫瘤細胞增殖、清除腫瘤細胞，從而縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期、分級[3，4]。但新輔助化療前后乳腺癌殘余腫瘤組織的評估研究仍不明確，尋找有效的殘余腫瘤組織標志物作為新輔助化療療效及評判預后的指標十分重要。

增殖指數Ki-67被作為是評價腫瘤細胞增殖力和侵襲力的重要指標，絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關蛋白(STRAP)在腫瘤的發生、發展中具有多種作用[5]，最新的研究[6]提示Ki-67及STRAP在胃癌、肺癌等術后評估具有重要提示作用，但在乳腺癌臨床診斷和治療中的價值仍有待進一步研究。故而，本研究嘗試探討STRAP、增殖指數Ki-67表達在乳腺癌新輔助化療后殘余腫瘤組織中的評估價值，以期為乳腺癌臨床診斷和治療提供可靠的參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組

選取2020-01-2021-05在本院就診的乳腺癌患者100例(乳腺癌組)，4-8個周期新輔助化療后，根據Miller-Payne[7]病理評價系統，將乳腺癌組患者分為病理完全緩解組(qCR組)患者21例，非病理完全緩解組(qCR組)患者79例。納入標準：(1)女性患者；(2)符合TNM分期中的ⅡB-Ⅲ期[8]；(3)在本院接受新輔助化療，且化療后接受局部手術治療；(4)患者及家屬知情同意。排除標準：(1)合并有心、肝、腎等重要臟器疾??；(2)合并有其它系統惡性腫瘤；(3)非初治患者。

同時選取乳腺良性病變患者50例(乳腺良性病變組)，包括乳腺纖維腺瘤23例，乳腺囊性增生21例，導管囊性擴張6例，納入標準：(1)女性患者；(2)經病理學確診；(3)在本院接受手術治療；(4)患者及家屬知情同意。排除標準：合并有心、肝等重要臟器疾病。

乳腺癌和乳腺良性病變患者臨床一般資料比較見表1，組間各指標差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本次研究獲得醫院倫理委員會批準(審批號KYLL-2020-018)。

表1 乳腺癌和乳腺良性病變患者臨床一般資料比較

1.2 治療方法

所有乳腺通過前哨淋巴結活檢或穿刺確定有無腋窩淋巴結轉移?；煼桨妇走x蒽環類和(或)紫杉醇為主的新輔助化療，且至少完成4個周期。每2個化療周期后行MRI檢測評價治療效果，根據文獻標準確定是否化療成功[9]。若臨床評定為疾病進展(PD)或4個化療周期后評定為疾病穩定(SD)則更換化療方案。完成4-8周期化療后根據具體情況制定手術方案。根據術后病理結果及療效評價制定后續治療方案(根據乳腺癌診療規范(2011年版))[10]。

1.3 檢查方法

取化療前腫瘤組織，常規處理后保存，以備免疫組化檢測。

1.3.1 STRAP免疫組化法： 60℃的恒溫器中烘烤30min后使用不同梯度二甲苯、乙醇、H2O脫蠟水化，室溫下封閉10min；抗原修復，微波爐中加熱0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)直至沸騰，將組織切片放入檸檬酸鈉緩沖溶液20min，自然冷卻至室溫后放入蒸餾水中浸泡10min，山羊血清封閉lh后吸出血清，加入相應的STRAP一抗(兔抗人單抗，1∶100) 4℃孵育24h；使用Tris-HCl于TBST中洗滌3次，每次5min，然后加入STRAP二抗(鼠抗兔單抗)孵育1h，TBST洗滌3次，加入二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色，直到變為淺黃色，放入蒸餾水終止反應；用蘇木精染色，脫水并固定玻片，滴加30%中性樹膠，用蓋玻片固定玻片，根據染色結果判定陽性。STRAP以細胞胞漿呈現棕黃色為陽性細胞，根據染色強度(無染色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分)和陽性細胞比例(1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>76%為4分)之和，分數≥3分為陽性表達。

1.3.2 Ki-67免疫組化：采用PV-6000二步法，Ki-67核抗原及PV-6000試劑盒均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；4%甲醛溶液固定組織后石蠟包埋，4μm連續切片；組織切片脫蠟、水化；微波修復20min；3%H2O2孵育5min，PBS沖洗；滴加一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，2min×3次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育20min，PBS沖洗，2min×3次；DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。Ki-67以細胞核呈現棕黃色為陽性細胞，選取細胞密集區觀察計數500個細胞，計算陽性細胞的比例作為增殖指數。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 乳腺癌和乳腺良性病變組織Ki-67、STRAP表達比較

乳腺組織Ki-67和STRAP免疫組化染色陽性圖片見圖1。乳腺癌組組織Ki-67和STRAP陽性表達率明顯高于乳腺良性病變組組織(P<0.01)。見表2。

Ki-67陽性表達 STRAP陽性表達

表2 兩組患者病變組織Ki-67、STRAP表達比較

表3 Ki-67、STRAP表達與乳腺癌患者臨床病理特征比較

2.2 乳腺癌不同臨床病理特征患者Ki-67、STRAP表達比較

不同年齡、體質量指數、吸煙、病理類型、腫瘤直徑患者病變組織Ki-67比較差異無統計學意義(P>0.05)；不同年齡、體質量指數、吸煙、病理類型、分化程度患者病變組織STRAP比較差異無統計學意義(P>0.05)。

TNM分期Ⅲ期、中低分化乳腺癌組織Ki-67明顯高于ⅡB期、高分化組織(P<0.05或P<0.01)；腫瘤直徑≥5cm、TNM分期Ⅲ期乳腺癌組織STRAP陽性表達率明顯高于腫瘤直徑<5cm、ⅡB期組織(P<0.01)。見表3。

2.3 qCR組和非qCR組乳腺癌患者病變組織Ki-67、STRAP表達比較

qCR組患者Ki-67和STRAP陽性表達率明顯低于非qCR組患者(P<0.01)，見表4。

表4 兩組乳腺癌患者病變組織Ki-67、STRAP表達比較

2.4 Ki-67聯合STRAP對非qCR的預測價值

Ki-67聯合STRAP預測非qCR的ROC曲線下面積為0.819，明顯高于Ki-67、STRAP單獨預測的0.711和0.632(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為84.50%和87.00%，見圖2和表5。

圖2 Ki-67、STRAP對非qCR預測價值的ROC曲線分析

表5 Ki-67、STRAP對非qCR的預測價值分析

3 討 論

Ki-67抗原是目前公認的一種與細胞增殖密切相關的蛋白，其表達與細胞周期密切相關，Ki-67說明乳腺癌細胞增殖敏感性，Ki-67陽性表達率反映了腫瘤細胞快速增殖、高侵襲、轉移率，其陽性表達率越高，腫瘤細胞增殖越快[11，12]。有研究發現[13]，Ki-67不表達于DNA修復狀態的細胞，能更好地顯示與腫瘤增殖之間的關系。本研究結果顯示，乳腺癌組織Ki-67陽性表達率明顯高于乳腺良性病變組織，與以往觀點相符。其機制可能是Ki-67促進微血管形成，導致乳腺癌腫瘤快速增長，考慮降低其表達會抑制腫瘤增殖，因此可將Ki-67表達降低作為化療后病理緩解程度的指標。

既往研究指出STRAP在癌細胞中高表達，促進癌細胞的增殖并抑制其凋亡，其表達水平與癌細胞的分化水平相關， STRAP的異常表達導致惡性腫瘤的產生[14]。本研究結果顯示，乳腺癌組織STRAP陽性表達率明顯高于乳腺良性病變組織，佐證了上述觀點,可能與該蛋白普遍存在于癌細胞的細胞質與細胞核中，在細胞核中發揮其生物學特性有關。

本研究顯示腫瘤直徑≥5cm、TNM分期Ⅲ期乳腺癌組織STRAP陽性表達率明顯高于腫瘤直徑<5cm、ⅡB期組織(P<0.05)。提示sTRAP可作乳腺癌分化程度的標志物，其表達水平對于惡性腫瘤的發生和發展十分重要[15]。本研究創新性提出以STRAP作為評價指標，為乳腺癌的臨床診斷提供可靠的理論依據。Ki-67與腫瘤細胞快速增殖有關, 本研究發現TNM分期Ⅲ期、中低分化乳腺癌組織Ki-67明顯高于ⅡB期，高分化組織(P<0.05)；Ki-67增殖指數是乳腺癌分子分型的標志物，故檢測殘留Ki-67水平在患者后續治療計劃及預后評估中顯得十分重要[16]。

既往研究發現新輔助化療后Ki-67水平與癌細胞數量減少有關[17，18]。本研究顯示，qCR患者Ki-67陽性表達率明顯低于非qCR患者，提示新輔助化療效果好的患者Ki-67陽性表達率較低，其呈低表達抑制了腫瘤細胞的增殖。STRAP促進癌細胞的增殖與分化，在多種癌變組織中高表達[19]，本研究發現qCR患者STRAP陽性表達率明顯低于非qCR患者(P<0.05)，說明STRAP水平與新輔助化療效果有關。有資料顯示[20]Ki-67不同程度的表達是影響乳腺癌預后最主要因素，臨床上乳腺癌化療期間可將Ki-67作為判斷其治療效果和預后的重要標志物。同時在新輔助化療領域，涉及Ki-67的研究也層出不窮，其對治療效果的預測作用逐漸上升為研究重點領域。

本研究在以往研究基礎上聯合檢測了STRAP水平，旨探討新輔助化療后腫瘤殘余的預測價值，結果顯示Ki-67聯合STRAP預測非qCR的ROC曲線下面積明顯高于Ki-67、STRAP單獨預測，說明二者均能夠反映腫瘤細胞的增殖活性。 Ki-67一般出現在細胞分裂周期的G1、S、G2和M期，如若在病理報告中Ki-67指標表達較高，也就意味腫瘤細胞處于增殖較快階段，能準確反映細胞增殖狀態； STRAP能夠調節多條信號通路的轉導，是一種較為理想的細胞增殖標志物,在判斷腫瘤細胞增殖活性、指導臨床治療及判斷化療療效中十分重要。

綜上所述，乳腺癌患者STRAP、Ki-67表達明顯增強，與TNM分期、腫瘤直徑、分化程度有一定關系；STRAP聯合Ki-67預測新輔助化療后腫瘤殘余方面有一定應用價值。本研究樣本量不足，下一步應擴大樣本量進行更深入、全面的研究。

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本文第一作者簡介：

張偉強(1980-)，男，漢族，主管技師，研究方向：免疫組織化學病理診斷