mPEG?PLA嵌段共聚物及其膠束的降解行為研究

吳菁菁，張文明，周秦鵬，張新晴，陸 沖**

（1.華東理工大學材料科學與工程學院生態材料研究室，上海 200237；2.上海誼眾藥業股份有限公司，上海，201401）

0 前言

PLA由于其良好的物理和化學性能，作為1種生物可降解聚酯被廣泛應用于各種生物醫學領域［1］，如醫療器械、藥物輸送載體和再生工程支架等。PLA的降解性能對于其應用來說至關重要，其降解機理也一直都是被廣泛研究的主題。PLA的降解受到自身特性和外部環境的共同影響［2］，除了分子量及分布［3］、分子結構與組成［4］、結晶度［5?6］以外，環境中的 pH 值［7?8］和改性方法［9?11］都是十分重要的影響因素。

Jong等［7］通過對接枝PLA的降解實驗發現，PLA的水解與介質的pH值有關，并且PLA的末端羥基起到了關鍵作用［8］?！澳┒私到鈾C理”是當樣本在中性或堿性介質中時，PLA末端的羥基氧原子在介質離子的作用下親核能力增強，進而與鏈末端倒數第2個羰基形成穩定六元環中間體，降解時生成丙交酯，進而水解為二聚乳酸。當介質酸性增加，質子化作用使得羥基末端基與相鄰羰基間形成分子內氫橋，進而使得末端的羰基碳氧雙鍵斷裂生成乳酸單體。

PLA的改性方法對PLA的降解行為同樣影響很大。PLA改性方法主要有2種：1種是物理共混，主要通過添加增塑劑或其他共混材料來改變PLA的宏觀組成［12?14］；另一種是化學共聚，即通過分子結構設計，采用共接枝等化學方法來改變PLA的微觀分子結構［11，15?19］。PEG是1種具有良好的親水性的聚合物，也是1種重要的PLA改性材料［20］。Wang等［21］采用固溶法制備了一系列PLA/PEG共混物，通過降解實驗發現PEG的引入有利于PLA的熱降解，并且在一定程度上改變了PLA的熱降解機理。由于PEG的親水性，PEG/PLA共混物的水解性比純PLA更快。同樣，PEG也可以通過化學共聚的方式來改性PLA。PEG?PLA共聚物分子量較高，具有優良的力學性能［22］，在水解的過程中速度比PLA更快［23］，分子量呈雙峰分布［24］。與此同時，由于親水性的大大提高和良好的生物降解性［25?26］，PEG?PLA在生物醫學領域有著良好的應用前景［27］。臨床試驗表明［28］，相比于溶劑型紫杉醇制劑，以PEG?PLA共聚物為輔料制備的紫杉醇聚合物膠束制劑具有更優越的療效、更好的安全性及更低的致敏性。

采用聚乙二醇單甲醚與丙交酯共聚制備的mPEG?PLA作為1種兩親性共聚物，可以在水溶液中自組裝形成結構穩定的膠束，親水端PEG鏈段在水中伸展形成膠束的殼，疏水端PLA鏈段包裹難溶于水的紫杉醇形成膠束的核。本文研究的是mPEG?PLA共聚物作為藥物載體的降解行為與穩定性。

1 實驗部分

1.1 主要原料

mPEG2000、D，L?丙交酯、辛酸亞錫，純度>95%，美國Sigma?Aldrich公司；

紫杉醇、無水二氯甲烷、無水乙醇，分析純，上海泰坦科技有限公司；

1.2 主要設備及儀器

高壓液相色譜儀（HPLC），Agilent126，美國安捷倫科技有限公司；

凝膠滲透色譜儀（GPC），Waters 1515，美國Wa?ters公司；

差示掃描量熱儀（DSC），PE/DSC8500，德國珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 樣品制備

mPEG?PLA共聚物制備：mPEG?PLA通過mPEG和D，L?丙交酯在異辛酸亞錫的催化下聚合得到；將15 g mPEG（分子量為2×103，7.5 mmol）加入schlenk瓶中，通入氮氣排盡瓶內空氣，130℃真空攪拌2 h脫除其中水分；在手套箱中加入18 g丙交酯和0.9 mL辛酸亞錫的無水二氯甲烷溶液（0.02 g/mL），用氮氣吹掃，在高溫高真空環境中去除二氯甲烷2 h；然后將真空密封的反應瓶置于130℃的恒溫磁力攪拌器中反應15～24 h，用10倍劑量的無水乙醇回收沉淀物，用真空干燥箱干燥24 h，所得固體產物即mPEG?PLA共聚物，該嵌段聚合物的分子量為2 000～1 800。

mPEG?PLA紫杉醇載藥膠束制備：mPEG?PLA紫杉醇載藥膠束采用固體分散?薄膜水化法制備；將30 mg紫杉醇和150 mg mPEG?PLA置于圓底燒瓶中，加入5 mL無水乙醇溶解，然后45℃旋蒸去除有機溶劑，留下均勻混合的mPEG?PLA和紫杉醇薄膜；取下燒瓶，加入5 mL預熱的PBS緩沖液，充分水化至薄膜完全溶解，得到DMs溶液；使用聚偏氯乙烯過濾器（0.22 μm）過濾形成的膠束溶液，此類制劑通常含有約16.7%的紫杉醇和83.3%的mPEG?PLA；在凍干機中凍干后，得到了膠束凍干粉，膠束的平均粒徑在20 nm以內。

1.4 性能測試與結構表征

降解實驗：將樣品分組密封后，分別置于不同溫度恒溫恒濕箱中，在設定的時間點采集樣品，采用GPC測定樣品的重均分子量（Mw）和分子量分散指數（PDI）、采用HPLC測定主要降解產物（包括丙交酯和乳酸）和水分的變化，不同溫度下的降解實驗如表1所示；

表1 降解實驗參數Tab.1 Data for degradation experiments

凝膠滲透色譜分析：稱取樣品約20 mg置于10 mL容量瓶中，用四氫呋喃定容作為供試品溶液，用GPC檢測，實驗溫度25℃，溶液流速1.0 mL/min，用GPC軟件計算供試品的Mw、數均分子量（Mn）及分子量分布；

丙交酯含量測定：取樣品約0.15 g置于10 mL容量瓶中，加入乙腈使其溶解作為供試品溶液；精密稱定丙交酯標準品20 mg，用乙腈溶解制成400 μg/mL的丙交酯儲備液，分別稀釋10、20、40、80倍作為對照品；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以水溶液和乙腈為流動相，檢測波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，洗脫時間30 min；取供試品溶液和對照溶液各10 μL，分別注入HPLC，記錄色譜圖，根據標準曲線法以峰面積計算丙交酯含量；

乳酸含量測定：取樣品約0.15 g置于10 mL容量瓶中，加水8.0 mL使其溶解，置于60℃水浴中1 h，冷卻到室溫后，定容至10 mL，104r/min離心15 min后，上清液作為供試品；精密稱定乳散標準品22 mg，加水溶解制成 400 μg/mL 儲備液，分別稀釋 10、20、50、100倍作為對照品；采用ZORBAX SB?Aq柱（4.6 nm×250 mm×5 μm），以1%（質量分數，下同）H3PO4水溶液和乙腈為流動相，檢測波長210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，洗脫時間25 min；取供試品溶液和各對照溶液各10 μL，分別注入HPLC，記錄色譜圖，根據標準曲線法以峰面積計算乳酸含量；

水分測定：依照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法，取適量樣品精密稱定，再迅速轉移至滴定杯中直接測定；

熔點測定：取mPEG?PLA 5～10 mg于鋁制樣品皿中，采用DSC以10℃/min升溫至100℃，保溫3 min后，以10℃/min降溫至-30℃，在-30℃保溫3 min后以10℃/min速率二次升溫至100℃，記錄測定值。

2 結果與討論

2.1 外觀形態變化

mPEG?PLA聚合物和DMs在不同溫度下的形態變化如表2所示。在初始狀態下，mPEG?PLA為淡黃色固體，而DMs則為白色凍干塊。在60℃的高溫降解實驗中，mPEG?PLA和DMs的形態在短時間（5 d）內就發生了顯著改變，mPEG?PLA變成無色半透明黏稠狀物，DMs變成透明的微黃色熔融物。在4℃、長達24個月的穩定性降解實驗中，mPEG?PLA和DMs都能保持形態的穩定性，無明顯變化。在2組長達6個月的加速降解實驗中，mPEG?PLA和DMs在25℃的環境下都能保持形態的穩定性，而在40℃下mPEG?PLA和DMs的形態都在1個月內發生改變，mPEG?PLA變成微黃色半透明半凝固物，DMs變成半透明熔融物。通過DCS表征和分析，得出mPEG?PLA的熔點均值約為40℃，由此可以得出mPEG?PLA和DMs在較低溫度（4℃和25℃）下可以維持較穩定的性狀，當溫度超過40℃時，mPEG?PLA和DMs都會開始熔融，物理性狀上會發生明顯變化，溫度越高變化越明顯，并且由于膠束的粒徑小，DMs的熔點應當略低于聚合物，因此DMs在40℃下的熔融程度高于mPEG?PLA。當環境溫度為60℃時，mPEG?PLA和DMs都能完全熔融。

表2 樣品在不同溫度下的形態變化Tab.2 Morphological changes of samples at different temperature

2.2 長期穩定性實驗

圖1是mPEG?PLA聚合物和DMs在長期（24個月）低溫（4℃）環境中各項數據變化情況。mPEG?PLA的Mw和多分散性（PDI）的變化情況如圖1（a）所示，mPEG?PLA的Mw在前6個月略有下降，在接下來的18個月Mw變化趨勢逐漸平緩；與此同時mPEG?PLA的PDI一直都低于1.1，數值保持在1.05到1.06之間，這表明mPEG?PLA在低溫環境下具有較高的穩定性，即使在較長時間段內，也可以保持長鏈的高分子結構。圖1（b）和圖1（c）分別展示了4 ℃下mPEG?PLA和DMs中的丙交酯、乳酸和水的含量變化情況。作為聚合物分子鏈末端降解的2種可能產物，丙交酯和乳酸在mPEG?PLA和載藥膠中的含量都無明顯變化。與此同時，水作為聚合物降解的最終產物，含量在2種樣品中也幾乎保持恒定不變。由此可推測出DMs和mPEG?PLA的降解反應在低溫下活性很低。

圖1 mPEG?PLA和DMs在4℃下的降解Fig.1 Degradation of mPEG?PLA and DMs at 4℃

2.3 加速降解實驗

圖2（a）展示了mPEG?PLA在25℃和40℃下的Mw變化情況，可以觀察到：在前3個月，mPEG?PLA的Mw相比于4℃有了明顯的下降，并且40℃的折線圖更陡峭。通過數據分析，可以得出：mPEG?PLA在40℃下的分子量損失約為20%，在25℃下則約為10%。在圖2（b）中，mPEG?PLA的PDI在40℃下由1.05逐漸增加至1.14，在25℃下由1.05增加至1.07。由此可以證明：mPEG?PLA分子量下降的速率與溫度的升高呈正關，mPEG?PLA的降解反應活性會隨著溫度的升高而增加。圖2（c）展示了mPEG?PLA中的丙交酯和乳酸含量分別在25℃和40℃下的變化情況。在6個月內，mPEG?PLA中的丙交酯含量一直都很低（0.05%以內），不僅都沒有增加，反而減少至零（未檢測出）。由此可以證明：丙交酯化學性質很不穩定，極易轉化成二聚乳酸進而解聚生成乳酸。與此同時，mPEG?PLA中的乳酸含量在兩種溫度環境下都有所增加，通過百分比數值的分析，可以得出：乳酸含量在40℃環境中增加了近0.8%，在25℃下增加了約0.2%。由此可以推斷：mPEG?PLA在高溫下更容易發生降解，此降解反應會伴隨著乳酸的生成。

圖2 mPEG?PLA在25℃和40℃下的降解Fig.2 Degradation of mPEG?PLA at 4℃ and 25℃，respectively

圖3表示了mPEG?PLA和DMs中的水、丙交酯、乳酸分別在25℃和40℃環境中的變化情況。如圖3（a）所示，無論是在25℃還是40℃下，在mPEG?PLA和DMs樣本中，水的含量都無明顯變化，通過與4℃下的數據進行比較，也沒有發現較明顯的差異?？梢缘贸?，雖然mPEG?PLA在更高溫度環境下分子量降低幅度更大，但最終生成的水含量幾乎無差別。因此，mPEG?PLA在25℃和40℃下的降解主要是以嵌段聚合物分子鏈的隨機斷裂為主，并不會產生大量的水分。圖3（b）和圖3（c）分別為在25℃和40℃下mPEG?PLA和DMs樣本中的丙交酯和乳酸含量的變化情況?？梢杂^察到無論在25℃還是40℃下，mPEG?PLA和DMs中的丙交酯含量在6個月內變化都很小，折線走勢平坦。與此同時，在mPEG?PLA中，乳酸含量在0、1、3、6個月時間點的數據分別為0.005%、0.033%、0.088%、0.233%（25℃）和0.005%、0.062%、0.256%、0.781%（40℃）。在DMs中，乳酸含量在0、1、3、6個月時間點的數據分別為0.055%、0.083%、0.061%、0.060%（25℃）和 0.055%、0.118%、0.961%、4.2%（4℃）。通過數值分析可以得出，在25℃下，DMs的乳酸含量變化不大，mPEG?PLA的乳酸含量變化更為顯著。然而在40℃下，DMs的乳酸含量顯著增加，增長量為4.145%，遠超過相同溫度下mPEG?PLA的情況。由此推測，當溫度在40℃時，mPEG?PLA會出現部分熔融，而DMs由于熔點略低會全部熔融，導致膠束原有的規則結構出現坍塌，膠束內部的磷酸鹽會對降解產生催化作用。根據“末端降解機理”，在中性或堿性條件下，嵌段聚合物PLA末端的羥基氧原子與鏈末端倒數第2個羰基形成穩定六元環中間體，降解時生成丙交酯，進而水解為二聚乳酸，最終造成乳酸含量顯著增加。

圖3 mPEG?PLA和DMs降解產物對比Fig.3 Comparison of degradation products between mPEG?PLA and DMs

2.4 高溫降解實驗

為了更好了解mPEG?PLA聚合物和DMs的降解情況，本文在60℃下進行了高溫降解實驗，各項數據如表3所示，展示了mPEG?PLA的Mw和PDI的變化情況及60℃下丙交酯和乳酸含量分別在mPEG?PLA和DMs的變化情況。在60℃下，mPEG?PLA的分子量顯著降低，PDI顯著升高。通過數據分析，分子量在10 d內損失超過30%，PDI也從大約1.05增加到大約1.36，可以得出mPEG?PLA在此溫度下發生了劇烈的降解反應，進一步證明了mPEG?PLA降解反應活性隨溫度的升高而增強。mPEG?PLA中的乳酸含量由0.005%變化為零（未檢測出），丙交酯含量由0.05%變化為零（未檢測出），都無明顯變化，由此可以推斷mPEG?PLA分子量的顯著降低主要是因為分子鏈上酯鍵的無規則斷裂，產物以多聚體居多，不遵循“末端降解機理”。而在DMs中，丙交酯和乳酸的含量都有明顯的增加，在僅10 d的時間里，DMs中的乳酸含量就增長了將近4倍，由此可以推測60℃環境中，mPEG?PLA和DMs都發生了全部熔融，高溫會加速mPEG?PLA和DMs的降解，但兩者降解機理有所不同。mPEG?PLA分子量的顯著降低主要是因為分子鏈上酯鍵的無規則斷裂，不遵循“末端降解機理”，產物以多聚體居多，丙交酯的乳酸生成量很少。膠束由于磷酸鹽的催化，遵循“末端降解機理”，發生了嵌段共聚物PLA端分子鏈末端的解聚，產生較多的丙交酯和乳酸。

表3 mPEG?PLA和DMs在60℃下的降解Tab.3 Degradation of mPEG?PLA and DMs at 60℃

3 結論

（1）在較低溫度（4℃）下，mPEG?PLA和DMs都能在長時間段（24個月）內保持結構的穩定，不發生降解；

（2）隨著溫度的升高，mPEG?PLA和DMs的降解反應都越來越強烈，但降解機理有所不同；

（3）在較高溫度（40℃與60℃）下，mPEG?PLA的降解以鏈段內部的無規則斷裂為主，主要產物為乳酸多聚體，DMs則更多遵循了“末端降解機理”，主要產物為丙交酯和乳酸；造成這種差異的原因是，膠束在高溫下物理性狀突變為熔融態，同時內部的磷酸鹽起到了催化的作用。