乳腺癌微環境中趨化因子CCL20作用的研究進展

劉欣欣 姚欣卉 孫躍峰 繆美琪 綜述 陳晶 審校

乳腺癌是當今女性最常見的癌癥類型，也是全球女性癌癥死亡的主要原因[1]。腫瘤的生長過程不僅受自身內部信號的調控，也受腫瘤微環境(Tumor microenvironment，TME)的影響[2]。趨化因子在腫瘤調控中扮演著重要角色。趨化因子是一類小分子生物活性肽，可招募多種細胞直接遷移至腫瘤組織中，并作為促炎癥介質調節TME，促進血管生成，誘導腫瘤遷移并加速腫瘤的發生發展、侵襲和轉移[3]。CCL20是趨化因子大家族中的一員，是多種疾病中極具潛力的生物標志物及治療靶點[4]。已有研究證實，CCL20與乳腺癌發展密切相關。CCL20與其受體CCR6結合后，誘導免疫細胞遷移、血管生成及上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，影響TME，從而促進乳腺癌的浸潤及轉移[5]。以往對腫瘤的治療多局限于腫瘤本身，探究TME的治療價值是近年來的熱門話題，而CCL20在TME中影響乳腺癌發生發展的機制尚未明確。因此，了解CCL20在乳腺癌發生發展中的作用，有助于探索乳腺癌的新診療靶點。本文就CCL20調控乳腺癌微環境的作用機制進行綜述，以期能更好、更加全面地了解趨化因子CCL20在乳腺癌發生發展過程中扮演的角色，為乳腺癌的治療提供新靶點。

1 乳腺癌微環境概述

乳腺癌的發生發展是一個復雜的過程，不僅取決于癌細胞本身，而且與其所處的TME中的某些細胞和胞外基質相關。乳腺癌TME中除了腫瘤細胞外，還有很多其他成分，包括腫瘤相關成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞、細胞外基質及信號分子等，這些成分構成了一個復雜的網絡體系，可以精確調節腫瘤的發生以及腫瘤細胞與其他成分的相互作用[6]。具體來說，在TME中腫瘤相關成纖維細胞，通過分泌多種因子和金屬蛋白酶等方式促進腫瘤的發生發展[7]。腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)通過分泌大量的細胞因子和生長因子激活促炎通路等途徑促進癌細胞增殖、遷移、侵襲等，并通過誘導癌細胞的耐藥性的產生及逃避免疫抑制而促進癌癥的發展[8]。TME中的血管內皮細胞則能通過建立微環境內的新生血管使腫瘤細胞免受缺氧損害，同時也能夠幫助構建淋巴管以利于腫瘤細胞的轉移[9]。

2 趨化因子CCL20及其受體CCR6的概述

2.1 趨化因子家族成員及功能

趨化因子是一類由多種細胞產生的分子生物活性肽，分子量約為8～14 kDa，根據N末端保守的半胱氨酸殘基的位置，分為CC、C、CXC和CX3C四類亞族[10]。在TME中，多種腫瘤細胞和基質細胞可以分泌趨化因子。趨化因子不僅能夠在腫瘤細胞中表達，也能夠在腫瘤細胞附近的宿主細胞和轉移灶中表達。趨化因子受體是典型的G蛋白偶聯蛋白，主要表達于內皮細胞、免疫細胞和部分腫瘤細胞中。最近的證據表明，趨化因子及其受體的定向結合能夠直接影響腫瘤細胞的增殖、遷移、血管生成、侵襲和轉移，調控白細胞浸潤進而影響抗腫瘤免疫活性，并介導腫瘤細胞與其微環境之間的相互作用[11]。在腫瘤生長及轉移過程中，趨化因子能夠提供化學趨化信號，促使細胞遷移至遠處器官。而血管新生的過程會受到許多血管生長因子及趨化因子家族成員調控。趨化因子的某些特定成員可以作為促血管生長因子，通過招募中性粒細胞合成和儲存促血管生成因子驅動血管生成。此外，趨化因子負責包括巨噬細胞在內的各種類型的白細胞的腫瘤浸潤。其中白細胞浸潤的數量及類型取決于TME中趨化因子的種類和浸潤細胞表達的受體[12]。文獻研究顯示，CC趨化因子的表達是巨噬細胞和淋巴細胞浸潤的重要因素[13]。因此，趨化因子及其受體是腫瘤細胞與TME通信的關鍵介質。

2.2 CCL20及其受體CCR6的結構及生物學功能

CCL20屬于CC亞家族的趨化因子，又被稱為巨噬細胞炎癥蛋白3α、肝臟活化調節趨化因子和Exodus-1，在肝臟中首次發現，能夠與受體結合吸引淋巴細胞[14]。Nelson等[15]研究發現MIP3α/CCL20基因定位于2號染色體2q35～q36區域上，包含4個外顯子和3個內含子，同時觀察到CCL20的受體CCR6在抗原特異性激活T淋巴細胞時表達水平顯著增加。CCL20包含96個氨基酸的開放閱讀框，含有一個經典的N端信號肽序列，該基因包含如NF-κB轉錄因子的結合位點。CCL20主要表達在肝臟、肺及外周血細胞等部位，其專屬受體為CCR6。CCR6 屬 G 蛋白偶聯的 7次跨膜的孤兒受體超家族，主要表達于未成熟樹突狀細胞、B細胞、T細胞及多種腫瘤細胞，參與細胞信號轉導[16]。CCL20生理條件下表達較低的基礎水平，經促炎信號誘導其表達升高。CCL20可趨化CCR6+細胞向抗原出現的組織部位定向遷移。另外，CCL20通過與其受體特異性結合，可能參與炎癥及免疫反應過程，即一方面刺激機體發生適當的免疫反應，抵御微生物入侵，另一方面介導病理學組織損傷，從而構成了一個與細胞間信息傳遞、細胞遷移有密切關系的生物學軸[17]。此外，CCL20與CCR6結合后可引起細胞內骨架蛋白的聚合與分布，調節腫瘤細胞運動與遷移，阻斷CCR6/CCL20通路可能會降低惡性腫瘤轉移的發生，這正是CCL20在抗腫瘤上發揮重要作用的主要原因[18]。

3 CCL20在乳腺癌微環境中的作用

3.1 逃避免疫監視

癌細胞逃避宿主免疫反應的能力是癌癥進展的標志。CCL20能夠招募促腫瘤免疫抑制細胞如調節性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)到TAMs中，以利于腫瘤逃避免疫監視，促進腫瘤發展。CCL20與其受體結合，能夠招募樹突狀細胞到上皮組織中，這往往和腫瘤的預后差相關；進一步研究發現，這些浸潤的樹突狀細胞能夠重新編程，使Toll樣受體7功能受到抑制，導致腫瘤組織中細胞因子譜的變化以及腫瘤的免疫逃逸，從而證實了CCL20在調節局部免疫中的巨大作用[19]。已有學者研究發現，CCL20與FOXP3在乳腺癌中共同表達與其預后不良密切相關。FOXP3是一種特異性的生物標志物，主要用于識別炎癥浸潤中的Tregs，在Tregs的發育和功能中發揮重要作用[20]。Zhao等[21]研究發現，隨著腫瘤中浸潤的FOXP3和Tregs數量增加，能夠減少腫瘤細胞的免疫應答能力，促進乳腺癌的發展。另外，CCL20與CCR6協同抑制CD8+T細胞分泌的干擾素-γ的表達，增強乳腺癌的免疫抑制能力[22]。相關研究顯示，CCL20的過表達與未成熟樹突狀細胞向乳腺癌組織浸潤增加有關，CCL20能招募未成熟樹突狀細胞到腫瘤組織中，與Toll樣受體7結合，誘導腫瘤細胞因子特征的改變，以損害免疫反應并進一步誘導免疫耐受[23]。

3.2 促進血管生成

CCL20在血管生成中發揮重要作用，血管生成是影響腫瘤新生血管形成的關鍵因素。腫瘤的生長需要新血管的生成以保證足夠的供氧及營養物質，一旦缺氧可上調一系列促血管生成因子的表達，誘導腫瘤血管的新生。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)與血管內皮細胞的增殖密切相關，是新血管生成的關鍵因素。CCL20通過招募內皮細胞，刺激VEGF促進血管生成。研究表明，在缺氧微環境中，乳腺癌細胞通過上調缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)，刺激VEGF產生，誘導新生血管形成，使其適應缺氧環境，促進乳腺癌轉移[24]。此外，研究發現乳腺癌中TAMs的調控與CCL20的表達相關，巨噬細胞浸潤可分泌包括VEGF在內的多種促血管生成因子，促進血管生成[25]。

3.3 促進乳腺癌細胞侵襲轉移

EMT是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟，該過程發生在腫瘤的前期階段，腫瘤細胞通常會失去原有的上皮細胞的特性，轉化為間充質樣細胞，從而提高腫瘤的侵襲轉移能力[26]。在EMT過程中上皮細胞標志蛋白E-鈣黏蛋白表達下降，N-鈣黏蛋白、波形蛋白等間質標志物表達上升[27]。此外，EMT能夠增加基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達。通常情況下，MMPs能夠降解細胞外基質和基底膜，促進腫瘤轉移[28]。MMPs特別是MMP-2、MMP-9活性的增強是乳腺癌侵襲的重要步驟，二者的過表達與乳腺癌患者生存率降低相關[29]。Muscella等[30]研究發現CCL20可通過蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)、Src及下游Akt、JNK和NF-κB信號途徑誘導EMT相關分子表達，促進乳腺癌細胞遷移，并發現較高濃度的CCL20能夠活化PKC和ERK1/2MAPK通路促進細胞增殖。Marsigliante等[31-32]發現CCL20能夠誘導乳腺上皮細胞的遷移和增殖，并通過體外實驗研究發現，阻斷CCL20可降低波形蛋白、N-鈣黏蛋白和Snail的表達，而Snail可下調E-鈣黏蛋白的表達。此外，研究表明CCL20參與EMT過程，主要通過抑制NF-κB、PKC和雷帕霉素的哺乳動物靶點(mTOR)，下調CCL20誘導的波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達，說明CCL20不僅能夠增加Snail蛋白的表達水平，而且在EMT的調控中對E-鈣黏蛋白具有抑制作用，并發現Snail蛋白的表達與腫瘤分化程度呈負相關，且與乳腺癌預后不良有關。TGF-β是一種免疫抑制細胞因子，對不同的免疫應答有抑制作用。TGF-β信號通路是介導調控EMT過程的信號通路，該通路在EMT的調控中能夠促進乳腺癌的轉移，TGF-β與其表面受體結合后激活Smad2和Smad3蛋白，進而上調Snail/Slug、ZEB1/2和Twist等EMT轉錄因子[33]。據報道，CCL20能夠增強三陰性乳腺癌細胞系中基質蛋白酶MMP2和MMP9的表達，從而提高腫瘤遷移過程中所需的降解底層基底膜能力[34]。

3.4 化療耐藥

化療耐藥一直是三陰性乳腺癌臨床治療過程中亟待解決的重大問題。研究表明，乳腺癌干細胞與化療耐藥有關[35]。乳腺癌干細胞有較強的藥物抵抗能力，通過分泌特定的細胞因子招募骨髓來源的抑制細胞、巨噬細胞等，以利于自我生存和自我更新。Chen等[36]通過體內外實驗發現，紫杉烷類藥物能夠顯著誘導CCL20的產生，CCL20的過表達促進了三陰性乳腺癌細胞的增殖和侵襲性，并加速了異種移植模型中腫瘤的生長，進一步促進乳腺癌干細胞的自我更新和干性特征，導致腫瘤干細胞群體的擴增，增強其對紫杉烷類藥物的抵抗能力，從而導致三陰性乳腺癌的化療耐藥。此外，研究發現，PKC和p38 MAPK以平行的方式傳遞CCL20信號，并共同促進下游的絲裂原激活蛋白激酶激活NF-κB，從而提高乳腺癌干細胞的自我更新能力和群體比例，促進三陰性乳腺癌腫瘤細胞的化學耐藥。深入研究發現，CCL20及NF-κB之間存在正反饋調節，CCL20激活NF-κB后，能夠刺激ABCB1的轉錄，增加其表達水平，使紫杉烷類藥物流出細胞，從而增強癌細胞的耐藥性[37]。

綜上所述，CCL20能夠增強乳腺癌細胞的化療抵抗力，靶向CCL20的下游通路(如NF-κB)可以顯著提高乳腺癌患者尤其是三陰性乳腺癌的治療效果。因此，針對CCL20的方向采取干預措施可以提高乳腺癌的化療效果。

3.5 與其他細胞因子在乳腺癌微環境中的協同作用

研究顯示，CCL20的表達與RNA結合蛋白HuR(Human antigen R，HuR)、Cbp/p300結合轉化激活因子含Glu/Asp豐富羧基末端域2(CBP/P300-interacting transactivator，with GLU/ASP-rich c-terminal domain-2，CITED2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)呈正相關。相關研究顯示，CITED2與CCL20協同作用于乳腺癌的TME，促進腫瘤的發生發展。Jayaraman等[38]通過沉默CITED2發現，乳腺癌MDA-MB-231細胞中CCL20 mRNA的蛋白表達顯著降低，同時可減少MDA-MB-231的浸潤，說明CCL20與CITED2協同調節巨噬細胞的招募，從而影響腫瘤生長。乳腺癌常發生的骨轉移以溶骨性轉移為主。研究顯示，趨化因子能夠極大地促進骨細胞和破骨細胞之間的相互作用，破壞骨組織，加速骨溶解，使腫瘤細胞不斷增殖[39]。據報道[40]，HuR下調可抑制乳腺癌骨轉移的發生。而Lee等[41]研究發現，CCL20顯著促進基底樣三陰性乳腺癌細胞的細胞侵襲和MMP-2/9分泌，證實了CCL20在乳腺癌骨轉移中的作用，且通過上調HuR基因，能夠使CCL20高表達，從而促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲及荷瘤小鼠的溶骨性骨轉移。此外，在三陰性乳腺癌細胞系中沉默CCL20或HuR均可顯著降低腫瘤的生長且對腫瘤的調控具有協同作用。另一項研究顯示，腫瘤壞死因子TNF-α能夠強有力地刺激CCL20的表達。Kim等[42]研究發現，脂肪細胞分泌的未知蛋白誘導TNF-α的產生，導致乳腺癌細胞MDA-MB-231中CCL20的過表達，進而增加乳腺癌細胞MDA-MB-231的轉移，說明脂肪細胞與CCL20共同參與了乳腺癌細胞的轉移。

4 小結與展望

CCL20在乳腺癌微環境中發揮重要作用，通過與其受體相互作用激活MAPK、ERK、PI3K/Akt或者NF-κB等炎癥信號通路，促進下游VEGF等轉錄因子活化，促進腫瘤發生。另一方面，CCL20通過調節淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞逃逸或者分泌細胞因子共同影響乳腺癌微環境，促進腫瘤的發生發展。目前CCL20及其受體在炎癥、組織損傷等病理生理過程中的作用已有深入的研究，但在乳腺癌方面仍處于基礎研究階段，探究CCL20在乳腺癌微環境中的具體調控機制有助于更深入了解乳腺癌的發生發展過程。阻斷CCL20的過程可能為乳腺癌治療提供新的治療策略，這將成為未來很好的研究方向。