彌漫大B細胞淋巴瘤的DNA甲基化改變及治療進展

鄭艷麗 綜述 賀建霞 審校

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)類型，約占NHL的30%，50歲以上更為常見[1]。DLBCL是一組異質性很強的疾病，約60%的患者可用標準一線環磷酰胺、阿霉素、長春新堿、強的松聯合利妥昔單抗(R-CHOP)方案治愈，但仍有30%～40%的患者一線治療后失敗，發展為復發或難治性DLBCL(rrDLBCL)，且預后很差[2]。在R-CHOP治療后存活下來的耐藥亞克隆在復發時會變得更加豐富。早期識別rrDLBCL對于改善整體疾病的預后至關重要。

隨著對DLBCL的深入研究，表觀遺傳對其發生發展的影響日益受到重視?；驒z測技術的發展使識別具有表觀遺傳改變的特定基因的能力迅速增長，相關藥物的研發及臨床試驗的開展也在不斷推進。靶向DNA甲基化的藥物能夠通過重新編碼基因表達過程，影響細胞發育、激活機體免疫反應，為DLBCL挽救治療提供可能。本文將DLBCL中有重要意義的DNA甲基化改變及其靶向治療的研究進行綜述。

1 DNA甲基化對DLBCL的影響

1.1 DNA甲基化的平衡調控

表觀遺傳修飾是指未涉及基因DNA序列變化而導致基因表達發生改變的遺傳模式。DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳修飾之一，由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)和DNA去甲基化酶共同調控[3]。調控平衡的破壞參與了DLBCL的發生，DNMTs及其調控基因突變或過表達導致啟動子甲基化修飾，高甲基化的啟動子區島通過招募轉錄抑制因子阻斷轉錄，進而導致附近基因(如抑癌基因)表達失控或沉默，而DNA其他區域則呈現低甲基化狀態促進原癌基因的表達，進一步影響細胞增殖和凋亡等過程。這體現了人類癌癥呈現整體低甲基化及特異區域高甲基化的特征，常提示疾病預后不良。Wedge等[4]將67例原發DLBCL活檢組織的整體甲基化水平以及74例患者血漿樣本中的循環游離DNA整體甲基化水平與基線臨床特征和總生存期相關聯，證實無論是哪種樣本基因組整體低甲基化與DLBCL患者生存不良均密切相關，是獨立不良預后因素，且整體低甲基化與其他基因高甲基化常同時發生。

1.2 DNMTs

DNMTs催化完成DNA甲基化，包括DNMT1和DNMT3兩個家族。DNMT1主要負責維持復制過程中或新生甲基化的活性；而DNMT3催化未甲基化DNA使其從頭甲基化，在甲基化位點的建立中起關鍵作用。DNMT3包括兩個從頭甲基轉移酶DNMT3a、DNMT3b和一個調節蛋白DNMT3L。既往研究表明，人類癌癥中DNMTs的過表達與不良預后之間存在顯著相關性。Amara等[5]應用免疫組織化學方法分析81例DLBCL患者DNMTs表達與臨床病理參數的相關性。分析顯示DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的過表達率分別為48%、13%和45%，DNMT1和DNMT3b的同時過表達與晚期臨床分期和耐藥顯著相關，生存分析顯示DNMT3b過表達與較短的總生存期和無進展生存期顯著相關，且是獨立的預后因素。以DNMTs為靶點的甲基化抑制劑根據其化學結構可分為核苷和非核苷兩大類。核苷類抑制劑是一類以胞嘧啶核苷為原型的衍生物，其作用機制是在體內代謝形成三磷酸脫氧核苷以代替在DNA復制過程中的胞嘧啶，因與DNMTs具有很強的結合力，可競爭性抑制DNMTs活性，阻斷甲基化反應。此類藥物主要有阿扎胞苷和地西他濱等。非核苷類藥物不含胞嘧啶核苷結構，其去甲基化作用在藥物臨床試驗中被發現，作用機制尚不明確。近期多項體外研究顯示使用地西他濱處理DLBCL細胞株有明顯的上調抑癌基因、抑制細胞增殖、抑制存活率作用[6-7]。Clozel等[8]在臨床試驗中觀察到DLBCL的化療耐藥性與異常的DNA甲基化程序有關，長期暴露于低劑量DNMTs抑制劑可使耐藥細胞在體內對阿霉素敏感。更重要的是，12例高危初治的老年DLBCL患者在R-CHOP之后連續使用阿扎胞苷產生了91.7%的臨床完全緩解率，這一數據令人鼓舞，但仍需要大樣本數據和長期隨訪進一步驗證。綜上所述，這些觀察結果提示DNMTs，尤其是DNMT1和DNMT3b過表達可能與DLBCL患者的較短生存期和化療耐藥有關，去甲基化治療或成為改善復發難治患者預后的途徑之一。

1.3 TET雙加氧酶

在體細胞中，TET雙加氧酶家族是催化DNA去甲基化的重要家族，包括TET1、TET2和TET3。TET酶將部分5-甲基胞嘧啶(5-mC)催化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-mC和5-hmC在TET酶的作用下氧化為5-羧基胞嘧啶(5-caC)，5-caC被胸腺嘧啶DNA糖基化酶特異性地識別，進行堿基剪切修復，起到主動去甲基化作用。TET基因突變致酶活性降低，導致其催化功能喪失[9]。TET1是一種CpG-DNA結合蛋白，能夠啟動DNA去甲基化程序，是調節5-hmC正常含量、防止DNA超甲基化所必需的。Cimmino等[10]發現TET1的缺失在體內增強了干細胞的自我更新，并與BCL-2過表達協同驅動小鼠B淋巴細胞增多，首次為TET1作為造血系統惡性腫瘤，尤其是B細胞淋巴瘤的腫瘤抑制因子提供了體內證據。TET2基因位于4q24.1區域，其突變存在于多種血液系統腫瘤中，以慢性粒單核細胞白血病、骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病最為常見，僅在2%的B細胞淋巴瘤中觀察到其突變[11]。TET2和TET3基因調節DLBCL的去甲基化，其甲基化缺失與激活誘導脫氨酶介導的B細胞受體信號通路突變以及G-四聯體和R-環的聚集減少有關，導致生發中心來源的B細胞淋巴瘤的自發發展[12]。目前尚無大規模臨床數據表明TET突變和缺失與DLBCL的更高發生風險以及更短的無進展生存期有關。但在López-Moyado等[13]的研究中將TET缺陷的不同類型細胞如前體B細胞、T細胞和造血干細胞等與癌癥基因組的DNA甲基化模式相比，證明前者同樣有局部高甲基化和廣泛低甲基化的表觀遺傳模式。進一步探索TET酶的作用對拓展DNA去甲基化的認識及尋找淋巴瘤治療新靶點具有潛在意義。

1.4 PCDH10甲基化

PCDH10基因位于4q28.3，其編碼的PCDH10蛋白屬于非聚集原鈣黏蛋白家族δ2型，是一種鈣黏蛋白相關的跨膜蛋白，廣泛表達于成人和胎兒組織中，在細胞連接、細胞遷移和軸向引導等方面發揮重要作用。PCDH10在腫瘤發生發展中發揮抑癌基因作用，可以通過調控PCDH10-DEPDC1-Caspase軸激活Caspase凋亡信號通路促進腫瘤細胞凋亡。在多種類型NHL中發現高頻PCDH10基因啟動子高甲基化事件，且其高甲基化會導致NHL細胞對阿霉素耐藥性增強[14]。Ying等[15]在80%的DLBCL標本中發現PCDH10啟動子高甲基化導致的基因沉默或表達降低，而在正常淋巴結中未發現，提示PCDH10的表觀遺傳變異在DLBCL的發生中起重要作用。對TP53通路的研究顯示，PCDH10是TP53基因的新型轉錄靶點。p53蛋白通過結合PCDH10啟動子區域的共同結合位點來激活PCDH10的表達，進而調節腫瘤細胞的遷移。野生型TP53可以誘導PCDH10的表達，而突變型TP53不能誘導PCDH10的表達[16]。為進一步證實PCDH10甲基化在DLBCL中的意義，Huang等[17]提取了107例DLBCL患者基因組DNA進行檢測。其中檢測到高達54.2%(58/107)的PCDH10啟動子甲基化比率。生存分析顯示甲基化患者總生存期和無進展生存期均較未甲基化患者縮短。近期國內一項DLBCL組織與炎性增生組織PCDH10甲基化情況對比研究顯示，DLBCL組織甲基化比率(40/55)明顯高于炎性增生組織(6/23)，且高甲基化水平與患者高IPI評分、Ann Arbor分期晚有明顯相關性(P<0.05)，其細胞實驗證實地西他濱能逆轉PCDH10的高甲基化、促進DLBCL細胞的凋亡，說明PCDH10甲基化狀態可以作為一個有價值的預后指標，有望成為表觀遺傳治療藥物的潛在靶點[18]。

2 DNA甲基化的靶向治療

DLBCL對標準免疫化療的耐藥性是一個尚未解決的難題。去甲基化不僅通過各種途徑影響腫瘤DNA，也可起到化療和免疫療法增敏的作用[19-20]。目前臨床上已開始嘗試利用靶向異常DNA甲基化來治療某些腫瘤。針對活化B細胞型DLBCL患者，在R-CHOP的基礎上追加新的靶向藥物已經經歷了非常多的嘗試，其中三項較大的全球多中心臨床試驗(PHOENIX、REMoDL-B、ROBUST)研究均宣告失敗，提示活化B細胞型DLBCL患者仍然具有很高的異質性。Wright教授團隊從分子機制的角度將DLBCL分成了7類(MCD、BN2、N1、EZB-MYC+、EZB-MYC-、ST2、A53)，進一步揭示了DLBCL的異質性，提示制定個體化靶向治療方案的重要性[21]。相關研究顯示，突變型TP53與EZH2相互作用會增強其與染色質的關聯，增加調節細胞自我更新和分化基因的H3K27三甲基化水平，藥物抑制EZH2會降低TP53突變DLBCL細胞的再生潛力[22]。趙維蒞教授團隊在第16屆國際淋巴瘤大會上公布了其基于分子分型的DLBCL R-CHOP+X臨床對照研究(Guidance-01)的初步成果。其研究納入128例初發的中/高危DLBCL患者，基于分子分型的結果給予不同的靶向聯合治療方案。結果顯示TP53突變/缺失亞型患者聯合使用地西他濱的完全緩解率顯著高于R-CHOP組(82%vs.60%)，而副作用沒有顯著增加。目前地西他濱單藥治療rrDLBCL的Ⅳ期臨床試驗也正在進行(NCT03579082)。上述研究均顯示出去甲基化藥物的治療潛力，有望推動DLBCL進入精準分子治療時代。

3 小結與展望

更好地理解淋巴瘤的表觀遺傳改變提高了對淋巴瘤發病機制和疾病進展的認識。DNA甲基化是高度可變的過程，主要通過沉默腫瘤抑制基因起作用，多種靶向藥物可以逆轉異常的表觀遺傳修飾進而改善疾病預后。去甲基化藥物在治療骨髓異常增生綜合征及髓系白血病等血液系統疾病方面取得了較好的療效，大量臨床前數據表明地西他濱對淋巴系統惡性腫瘤也有明顯的抑制作用，臨床研究同樣顯示地西他濱對rrDLBCL可能具有較好的應用潛力和治療活性，這為臨床醫生提供了新的治療思路。同時，不同類型表觀修飾抑制劑聯合用于腫瘤治療的方法也逐漸發展起來，例如5-氮雜胞苷與組蛋白脫乙酰酶伏立諾他聯合用于治療淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗也在進行(NCT00538876和NCT01120834)。開發新型合理聯合治療手段為DLBCL治療描繪出更光明的治療前景。