微生物誘導碳酸鹽巖沉淀過程及作用機理

高旭波，潘振東，龔培俐，江 玉，李成城，李鴻煜

（中國地質大學(武漢)環境學院, 湖北 武漢 430074）

0 引 言

當前，全球生態環境、地質環境形勢十分嚴峻，發展基于生物過程的地質環境修復技術是我國生態環境保護和綠色可持續發展的迫切需求。對于環境重金屬修復，傳統的物理和化學修復方法，如化學沉淀法、氧化還原法和理化吸附法等得到了廣泛的應用。但傳統的治理方法存在成本較高、能耗大、使用大量化學藥品等缺點。生物法作為一種仿生工程，具有綠色環保的特點。其原理是微生物通過自身的新陳代謝活動固定或降解環境中的污染物，與電化學處理、離子交換、沉淀、反滲透、蒸發和吸附等物理化學方法相比，生物修復方法具有成本更低，效率更高等優點[1-3]。其中，微生物誘導碳酸鈣沉淀過程已被證明可以有效地固定環境中的多種重金屬，降低土壤和水體中的重金屬濃度[4]。其主要作用過程為，微生物通過新陳代謝活動，產生代謝產物CO32-，并且在環境適宜的條件下，與環境中Ca2+相互作用而形成了碳酸鈣沉淀，在形成碳酸鈣的過程中固定環境中的重金屬離子，微生物代謝過程包括：尿素分解、氨基酸氨化、反硝化、異化硫酸鹽菌的還原、光合作用、甲烷氧化等[5-9]。其中利用尿素還原菌分解尿素而誘導碳酸鹽鈣沉淀這一途徑因具有過程簡單、容易控制、短時間內就能產生大量的碳酸鹽類沉淀等特點，已被廣泛用于重金屬固定的研究中[1-3]。近年來，該領域研究涵蓋了生物科學與無機化學、生物物理學和材料科學等多個學科交叉，關于生物誘導礦化的研究及其在各個領域應用十分引人注目[10]，特別是生物誘導礦化作用為環境修復提供了一種新的思路。

1 微生物誘導下碳酸鹽沉淀機制

碳酸鈣的生物礦化主要有三種途徑[6,11]：

（1）生物控制礦化過程（Biologically Controlled Mineralization (BCM)）：所產生礦物的成核位置、組成成分以及礦物形態由微生物的代謝活動準確地控制，如原生動物和軟體動物的貝殼或珊瑚礁等。

（2）生物誘導礦化過程（Biologically Induced Mineralization (BIM)）：微生物的各種代謝途徑產生的代謝產物與環境中存在的離子之間的相互作用而生成間接沉淀，如尿素分解菌水解環境中的尿素，釋放大量OH-以及CO32-，OH-提供了可生成碳酸鈣的堿性環境，釋放的CO32-與環境中存在的Ca2+相結合生成碳酸鈣礦物。

（3）生物影響礦化（Biologically Mediated Mineralization (BMM)）：該過程為有機基質與有機和/或無機化合物相互作用，而不需要細胞外或細胞內的生物活性。

其中，微生物誘導碳酸鈣沉淀過程(microbially induced calcium carbonate precipitation，MICP)作為一種主要的生物誘導礦化作用，在海水和沉積物、淡水和土壤的各種環境中十分常見[11]。由于MICP 在自然過程中的廣泛存在和應用潛力，近年來受到了廣泛的關注。天然環境中尿素分解、氨基酸氨化、反硝化、異化硫酸鹽菌的還原作用、光合作用、甲烷氧化等是主要的微生物代謝誘導礦化（MICP）作用。

1.1 反硝化作用

微生物通過反硝化過程產生碳酸鈣的反應方程式如下：

在微生物反硝化作用過程中，有機物利用硝酸根作為最終的電子受體發生氧化反應是MICP 發生的主要原因：硝酸根與氫離子反應消耗了環境中的氫離子，生成了碳酸根，增加了液相中CaCO3的飽和指數(SI)，創造了有利于生物誘導CaCO3沉淀的環境條件，此時，環境中存在的Ca2+將會在堿性條件下與C相結合，生成碳酸鈣礦物[11]。

反硝化菌施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）的模擬反應表明，反硝化細菌礦化生成碳酸鈣的過程分為兩個階段，即NO3-還原生成NO2-，以及NO2-進一步還原生成N2(NO3-→NO2-→N2)[12]

在第一階段中，硝酸根被還原成亞硝酸根的同時生成了碳酸氫根（Eq.2），生成的亞硝酸根在第二反應階段再與氫離子反應生成氮氣并且生成更多的碳酸氫根（Eq. 3）。過程中第二反應階段中消耗了H+，提高了環境中的pH，更有利于碳酸鈣的形成，因此沉淀大多發生在第二階段，概念模型如圖1。

1.2 硫酸鹽還原

在富含有機物、鈣和硫酸鹽的厭氧環境中，硫酸鹽還原菌(SRB)通過異化硫酸鹽還原過程，可以誘導生成次生碳酸鈣礦物圖2。該反應過程通常從石膏的溶解開始(CaSO4·2H2O/CaSO4)，釋放大量游離態的Ca2+（Eq. 4），環境中存在的SRB 消耗有機物，反應生成硫化物和二氧化碳，使環境中pH 升高，進而影響溶液飽和指數（SI，Eq. 5)。SRB 表面可以作為碳酸鹽的成核位點，兩個階段的反應產物鈣離子和碳酸根離子在細菌表面結合生成了碳酸鈣(Eq. 6)[13-14]。概念模型如下：

此外，脫硫弧菌（Desulfovibrio）還可以通過溶解-沉淀和擴散等過程形成碳酸鈣。細菌還原硫酸鹽時，石膏（CaSO4）釋放出的鈣離子與重碳酸根發生反應，生成方解石沉淀（Eq. 7）[15]。

1.3 光合作用

光合作用是在水環境中生物誘導礦化生成碳酸鈣主要機理。在有氧環境中，藍藻和微藻是水環境中主要的光合微生物，這些光合微生物利用水環境中的CO2（Eq. 8）合成自身所需的營養物質。光合微生物產生碳酸鈣沉淀主要機理是HCO3-和CO32-的平衡交換（Eq. 9），光合作用消耗CO2，促使HCO3-分解生成更多的CO32-（Eq. 9）。同時HCO3-也可以通過細胞膜擴散，并經細胞質中碳酸酐酶(CA)催化分解成CO2以及OH-，生成的OH-通過細胞膜泵出細胞，導致pH 升高。較高的pH 進一步促進碳酸平衡向CO32-濃度增加的方向轉移，有利于CO32-與水環境中Ca2+結合生成碳酸鈣 (Eq. 11) (Eq. 12)[6,16-17]。

根據上述反應過程構建概念模型（圖3）[17]。由于水環境中呈現堿性，光合作用吸收碳發生在生物體的同一側，光合速率、水生化學和生物周圍邊界層內的擴散作用決定了CaCO3過飽和水平和鈣化速率。

在無氧條件下，反應的電子受體為硫化氫時，反應過程中不產生氧氣，而是生成了單質硫（Eq. 13），反應過程中消耗CO2，從而影響了碳酸根與碳酸氫根的平衡（Eq. 9），促進碳酸鹽的沉淀（Eq. 11）。

1.4 甲烷氧化

在海洋和淡水沉積物中，無論是氧化環境還是還原環境，甲烷氧化菌都可以通過自身代謝過程誘導生成碳酸鹽礦物。

在好氧環境下，氧氣和甲烷在細胞膜上將甲烷轉化為甲醇（Eq. 14），產生的甲醇轉化為甲醛（Eq.15），并在細胞內進一步轉化為甲酸（Eq. 16），溶解的甲酸處于平衡狀態（Eq. 17），甲烷氧化菌再利用甲酸脫氫酶將甲酸氧化為CO2（Eq18），在堿性條件下，CO2轉化為CO32-并與環境中的Ca2+結合形成碳酸鹽沉淀（Eq. 19）[18-20]。

在厭氧的環境下，產甲烷菌將二氧化碳和氫氣轉化為甲烷，產生的甲烷以硫酸根離子為電子受體氧化產生碳酸根離子，生成HS-以及HCO3-（Eq. 20）。生成的碳酸氫根與水環境中的Ca2+結合生成碳酸鈣沉淀及CO2（Eq. 21)，其概念模型如圖4[21]。

1.5 尿素分解

相比于其它MICP 機理，尿素分解菌具有在短時間內產生高濃度碳酸鈣的優勢。在該過程中，1 mol尿素在尿素分解菌作用下水解成1 mol 氨基甲酸和1 mol 氨（Eq. 22），氨基甲酸可以自發分解產生氨和碳酸（Eq.23）。反應中生成的氨發生水解，生成OH-，使水環境pH 升高，促使碳酸的水解平衡不斷的向生成碳酸根的方向移動（Eq. 24），產生大量的碳酸根離子，與環境中存在的鈣離子反應，在過飽和狀態下形成碳酸鈣沉淀（Eq.28）[22]。此外，細菌表面存在的負離子有利于鈣離子的吸附，因此細胞表面以及其胞外聚合物可以作為碳酸鈣的沉淀位點（Eq. 29）[11,23-24]。尿素分解菌誘導生成碳酸鈣沉淀示意如圖5。

2 尿素分解菌誘導碳酸鹽沉淀的影響因素

如前所述，微生物可以通過多種途徑生成碳酸鈣。其中，尿素分解菌具有不依賴額外營養物質快速生成CO32-的特點，得到了廣大科技工作者的廣泛關注。利用尿素分解菌修復環境已成為了當前微生物地質環境領域廣為應用的技術之一，微生物礦化作用受到鈣源、溫度、pH 條件、離子濃度等多種關鍵因素的影響[22]。

2.1 鈣 源

微生物誘導沉淀的首要問題是生化沉積過程。由于這個過程涉及到將可溶性鈣源轉化為不溶性碳酸鈣，因此鈣源的類型至關重要。 鈣源不同，生物誘導碳酸鹽沉淀的形態，晶體尺寸、形貌以及沉積速率等方面都會有所不同。Xu 等人[25]研究了兩種不同類型的鈣源-乳酸鈣和硝酸鈣對尿素溶菌礦化沉淀的影響，利用X 射線衍射分析證實沉積的CaCO3都為方解石，但通過動力學研究表明，在沉積速率方面，有微生物參與的乳酸鈣的沉淀速率是硝酸鈣的兩倍以上。并且當鈣源不同時，CaCO3晶體尺寸和形貌有所不同，硝酸鈣沉積物為球形、層狀顆粒，粒徑小于50 μm，乳酸鈣沉積物多為不規則致密的塊狀或菱形晶體，粒徑較大，晶體表面印跡長2～4 μm，寬0.7 μm。Achal 等[26]做了類似的研究，他們分析了四種不同的碳源(氯化鈣、氧化鈣、醋酸鈣和硝酸鈣）對MICP 過程中的影響，結果表明，當用氯化鈣作為碳源時，礦物主要晶型為方解石，但同時含有少量文石和球霰石晶體。Amiri 等[27]認為以硝酸鈣為鈣源時，生成的礦物晶型主要為文石而不是方解石，而以氯化鈣為鈣源時，則生成的主要以方解石為主。

2.2 環境溫度

溫度是影響尿素分解菌誘導生物碳酸鹽沉淀的關鍵因素[28-30]。尿素分解菌生成沉淀過程的最佳溫度主要取決于細菌生長和代謝的適宜溫度，通常都在20～40 ℃之間[31-34]。Armstrong 等[28]從巖石洞穴中分離出四株尿素分解菌（Sporosarcina pasteurii WJ-4、Sporosarcina pasteurii fwzy14、Sporosarcina pasteurii WJ-5、Sporosarcina pasteurii fwzy14），發現在25 ℃到30 ℃范圍內時，脲酶活性最大。這一溫度范圍在自然環境中是很常見的，這也意味著優化的MICP 工藝可以在自然環境中實現工程應用。

2.3 pH 條件

微生物生長環境的pH 不僅在誘導微生物形態變化、激發其分泌酶、影響其穩定性等方面起著重要作用，而且也影響著碳酸鈣的沉淀過程。pH 通過影響HCO3-、CO32-、NH4+等離子濃度從而改變沉淀速度，而沉淀速度直接決定了礦物晶體的大小，沉淀速度越快晶體越小[28]。雖然不同種類細菌的最佳活性所需的pH 各不相同，但尿素分解菌誘導碳酸鹽沉淀的最佳pH 范圍在中性到弱堿性之間，因此這也是生成碳酸鹽所需的pH 條件[32-33]。

2.4 離子濃度

在非生物環境碳酸鈣生長過程中，陽離子的存在可以改變碳酸鈣的晶型、晶貌、晶體大小以及沉淀量[35-37]。在生物成礦過程中亦存在類似的現象，如尿素分解誘導碳酸鈣沉淀的過程中，低濃度的鎂離子顯著促進了文石的形成，提高了碳酸鈣沉積率，且晶粒的平均直徑更大[38]。高濃度的Cr6+同樣促進了文石以及球霰石的生長，抑制方解石的生成[34]。除了Mg2+、Cr6+之外，Andrew 等[39]發現Sr 離子通過對晶體生長位點的影響延緩了方解石的沉淀速率，進而影響碳酸鈣晶體的大小。此外，Ni2+濃度顯著影響著尿素分解菌誘導生成碳酸鈣行為[40]，研究發現，在加入 Ni2+后生物成因碳酸鈣的沉淀量急劇增加，溶液中Ni2+濃度為100 umol·L-1時，沉淀量最高。隨著Ni2+濃度升高至 500 umol·L-1時，碳酸鈣沉淀量反而大幅降低，當Ni2+濃度達到 1 mmol·L-1時，則沒有碳酸鈣沉淀生成。

3 MICP 的環境應用及作用機制

尿素分解菌通過分解尿素來誘導生成碳酸鹽，具有過程簡單、容易控制、短時間內就能產生大量碳酸鹽類沉淀等特點，在環境修復領域已經得到了廣泛的關注。與傳統的處理方法相比，該過程降低了能源和材料消耗，副產物減少，提高了經濟效益，更具環保性的特點[1,41]。在微生物誘導礦化沉淀的過程中，環境中的重金屬元素或直接與CO32-反應形成碳酸鹽沉淀，或通過替換CO32-達到固定的效果。已有研究表明，在天然環境中，較高濃度的HCO3-會通過競爭性吸附影響沉積物中重金屬濃度[42]。目前，根據重金屬被固定的過程以及形成的產物，可以將重金屬的固定過程分為兩大類：共沉淀作用和置換作用[34,43]。

3.1 共沉淀作用

替換Ca2+等陽離子型礦化示意圖如圖6，尿素分解菌在脲酶的參與下分解尿素生成CO32-、OH-，創造了有利于碳酸鹽沉淀的環境和條件。細菌細胞通過其表面的負電荷吸附重金屬陽離子M。尿素分解產生的CO32-在微生物表面與被吸附的陽離子反應生成礦物沉淀（MxCa1-x）CO3而被固定。

目前，該類型的重金屬元素主要包括Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 等（表1）。從表1 中數據可知，各重金屬的最高固定率分別可達97.15%、99%、98.80%、94.83%以及97%，同時，MICP 過程所用微生物以芽孢桿菌屬居多，該類細菌水解尿素速率相比于其它細菌效率更高。利用芽孢八疊球菌類細菌對Cd 元素以及Zn 元素的固定率分別達到了97.15%以及94.83%。Zhu 等[47]利用蠟樣芽孢桿菌NS4 固定某蓄電池廠工業土壤中的Ni2+，利用MICP 過程使土壤中總鎳含量由900 mg·kg-1降至38 mg·kg-1。同時，Li 等[48]利用分離出蠟樣芽孢桿菌對水體中的Ni 元素進行固定實驗，固定效率都在88%～99%之間，證明蠟樣芽孢桿菌對土壤以及水體中的Ni 元素都具有較好的固定效果。

表1 尿素分解菌MICP 固定陽離子型重金屬表Table 1 Cationic heavy metals fixed by urea decomposing bacteria MICP

續表1

與單菌株培養相比，混合菌體表現出更高的生長速率、脲酶活性和對重金屬的抗性，同時也具有相當高的重金屬生物修復能力。如Kang 等[50]利用綠芽胞桿菌、沙棘綠桿菌、陰溝腸桿菌混合菌種進行Cd 元素的固定試驗，固定率達到了85%，這可能是在高重金屬水平下，細菌細胞密度較高所導致的。

除細菌外，具有尿素分解能力的真菌同樣可以通過MICP 過程來固定重金屬元素。Qian 等[52]從污泥中分離得到的真菌青霉菌（Chrysogenum CS1）對Pb 的固定率達到了98.8%。Dhami 等[53]從洞穴中分離出的真菌Fusarium sp. UF8.以及Aspergillus sp.UF3，對Pb 的固定率分別為48%以及34%。

3.2 置換作用

水環境中的部分重金屬元素可以形成絡合陰離子，如亞砷酸根等，會以類質同像置換方式取代CaCO3中的CO32-，使得重金屬離子摻入礦物結構而被固定（圖7）。

目前，通過該機制固定的重金屬元素主要為As、Cr 等（表2）。Yamamura 等[62]利用芽孢桿菌探究了As5+以及As3+的相互轉化機制，認為尿素分解菌可用于砷污染土壤的生物修復。Tripti 等[57]從高砷地區分離出耐砷細菌地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis DAS-2，探究了不同價態砷和初始濃度下砷的生物礦化效率。Cr 元素與As 元素類似，在環境中通常以六價以及三價的形態存在，Qian 等[52]利用從污泥中分離的產黃青霉菌來固定土壤中的六價鉻，固定率最高可達到95.30%。同步輻射檢測表明，CrO42-主要是通過置換作用占據了方解石中的CO32-位置。

表2 MICP 固定陰離子型重金屬表Table 2 Table of anionic heavy metals fixed by MICP

4 總 結

利用生物礦物修復土壤或水體重金屬污染的生物礦化機理包括：生物控制礦化、生物介導礦化、生物誘導礦化。而微生物誘導礦化過程的成因機制包括細菌反硝化、硫酸鹽還原、尿素分解等。利用尿素分解誘導礦物沉淀具有能夠快速生成CO32-，并且只依賴于一種酶-脲酶，不需要額外的營養素用來長期維持細菌活性的特點而受到科研人員的廣泛關注。

微生物分解尿素誘導礦物沉淀過程很大程度上受到環境因素的影響，如pH、溫度、離子濃度等，已有大量研究表明通過控制（或改變）環境因素會對微生物的生長、固體沉淀速率、礦物類型等多方面產生影響。

在固定重金屬方面，主要通過共沉淀或置換作用達到固定重金屬的目的。利用MICP 過程修復環境重金屬對比傳統的修復方法具有明顯的優勢，并且對環境中常見的重金屬污染元素，如砷、鎘、銅等，都有較好的固定轉化率，因此利用MICP 過程處理水體或土壤中的重金屬已經成為當下的研究熱點。但微生物的生長代謝受環境條件限制，因此在應用方面，對環境條件要求較為嚴苛，所以在今后的研究里，應更多的關注環境條件對于微生物生長代謝以及對環境中重金屬的轉化率的影響，以便實現MICP 修復環境更廣泛的應用。