鐵死亡在致盲性眼病中的相關研究進展

樊倩，張偉，李嚴為，歐陽東，王虹霞

(1.天津市眼科醫院 天津市眼科學與視覺科學重點實驗室 天津市眼科研究所 南開大學附屬眼科醫院眼科，天津 300020；2.上海市中醫藥大學附屬光華醫院 上海市光華中西醫結合醫院眼科，上海 200052)

細胞死亡是維持細胞周期及機體穩態的重要機制，主要分為程序性細胞死亡與調節性細胞壞死兩種類型。依據細胞壞死發生過程中的形態學變化及具體分子機制，可以將調節性細胞壞死分為壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡、自噬性死亡、多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依賴性細胞死亡等[1-2]。不同調節性細胞壞死激活的下游分子途徑有所不同。鐵死亡作為調節性細胞壞死的一種重要類型，主要通過長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)/溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路實現細胞死亡。目前認為在諸多調節性細胞壞死的機制中，鐵死亡與心肌梗死、腦缺血再灌注損傷、實體器官移植等病理生理過程有關[3]。此外，鐵死亡還參與致盲性眼科疾病，如青光眼、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)的發生發展。Sun等[4]通過體外培養的AMD標準模型證實，鐵死亡和自噬是谷胱甘肽減少誘發視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)死亡的兩種方式，鐵死亡抑制劑在抑制原代RPE細胞死亡方面優于細胞凋亡或壞死性抑制劑?，F就鐵死亡在致盲性眼病中的相關研究進展予以綜述。

1 壞死性凋亡的作用機制

壞死性凋亡是由受體相互作用蛋白激酶1和受體相互作用蛋白激酶3調節的一種胱天蛋白酶(caspase)非依賴性細胞死亡途徑。壞死性凋亡途徑通過多種先天免疫信號轉導，包括死亡受體、干擾素、Toll樣受體或細胞內RNA以及伴隨著受體相互作用蛋白激酶1/3和假激酶混合譜系激酶類結構域樣蛋白[5]。在細胞凋亡中，caspase家族的部分蛋白被炎癥小體激活，并被切割為成孔蛋白Gasdermin E，成孔蛋白激活后轉位到細胞膜上，形成孔洞，細胞腫脹，胞質溢出，細胞膜最終破裂崩解，其具體機制是通過炎癥小體感知刺激因素，進而活化caspase-1，活化的caspase-1切割并激活白細胞介素-18、白細胞介素-1β等炎癥細胞因子，進一步切割Gasdermin D的N端序列，使其與膜結合并產生膜孔，導致細胞焦亡[6]。敲除Gasdermin E后，caspase-3的激活程度顯著降低，表明Gasdermin E可作為細胞凋亡執行蛋白caspase-3的另一個“開啟”開關。而鐵死亡作為調節性細胞壞死的一種重要類型，主要通過ACSL4/溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3/花生四烯酸酯15-脂氧合酶通路實現細胞死亡[3]。而多腺苷二磷酸核糖聚合酶1依賴性細胞死亡是一種與細胞凋亡或壞死性凋亡不同的程序性細胞死亡，該過程不需要caspase的參與，但是依賴于多聚二磷酸腺苷核糖信號和核凋亡誘導因子移位[7]。

2 鐵死亡的作用機制

2.1鐵死亡的特點 鐵死亡是較特殊的細胞死亡形式，2012年由Dixon等[8]首次報道，隨后引起廣大研究人員的重視。細胞死亡命名委員會更傾向于以細胞死亡的分子學進行分類，“鐵死亡”的名字由此而來。鐵死亡是一種細胞死亡過程，由鐵離子依賴的脂質過氧化作用驅動，以細胞膜完整性喪失和細胞質內容物釋放為特征。鐵死亡具有以下特點：細胞死亡過程中伴隨著大量鐵離子的累積，同時出現脂質過氧化；在細胞的亞結構中，線粒體變小、膜皺縮，同時線粒體嵴減少、消失，外膜破碎。這種死亡形式與鐵離子介導細胞的氧化還原失平衡相關，主要啟動因素是細胞膜磷脂的過氧化，而鐵死亡中過氧化底物是多聚多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PL-PUFA)。細胞中影響PL-PUFA代謝的主要通路有鐵離子代謝通路、谷胱甘肽通路和泛醇/泛醌通路，其均可參與鐵死亡過程。亞鐵離子(Fe2+)是參與鐵死亡不可或缺的因素，在氧化應激條件下，超氧化物可誘導細胞釋放Fe2+、血紅素、鐵硫簇和鐵蛋白。鐵蛋白的特異性自噬(又稱鐵蛋白吞噬)降解由核受體輔活化子4介導[9]，而核受體輔活化子4作為一種鐵蛋白受體，可識別和表達鐵蛋白，并將鐵蛋白招募至自噬體進行溶酶體降解，繼而導致游離鐵離子釋放。敲減或過表達核受體輔活化子4基因可分別抑制或誘導鐵蛋白吞噬和鐵死亡。Olamine通過鐵離子螯合劑(去鐵胺或環磷酰胺)減少鐵離子過負荷，可阻斷erastin誘導的鐵死亡，而提供外源性藥物鐵的來源(六水氯化鐵、檸檬酸鐵或檸檬酸鐵銨等)可促進erastin誘導的鐵死亡。

2.2鐵死亡的旁路調節 除鐵離子外，氨基酸代謝通路也參與鐵死亡的調節過程。谷氨酸和谷氨酰胺是鐵死亡的關鍵調節因子[10]。谷氨酸通過反轉運蛋白胱氨酸，以1∶1的比例交換為胱氨酸。細胞外高濃度的谷氨酸通過阻斷半胱氨酸轉運導致鐵死亡。當谷氨酰胺缺乏或分解被抑制時，阻止胱氨酸輸入和胱氨酸缺乏不能引起脂質過氧化、活性氧積累，最終導致鐵死亡。在谷氨酰胺分解過程中，谷氨酰胺酶2催化谷氨酰胺轉化為谷氨酸，是鐵死亡的必經過程[11]，上調谷氨酰胺酶2可導致p53依賴性鐵死亡，p53在直接轉錄水平抑制溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)的表達，亦可通過轉錄上調下游的精脒/精胺N1-乙?；D移酶1通路，進而參與鐵死亡過程。另外，p53可通過抑制二肽基肽酶-4的活性抑制鐵死亡[12]。

磷脂過氧化物酶——谷胱甘肽過氧化物酶(phospholipid peroxidase glutathione peroxidase，GPX)4和ACSL4與脂質過氧化密切相關，常作為鐵死亡過程的生物標志物[13-14]。GPX4是一種抗氧化酶，可將潛在的毒性脂質過氧化物還原為無毒的脂質醇，這是預防鐵死亡的重要過程，在此過程中，GPX4利用谷胱甘肽作為輔助因子，將還原型谷胱甘肽轉化為氧化型谷胱甘肽，隨后氧化型谷胱甘肽被谷胱甘肽還原酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/H+還原，使還原型谷胱甘肽再循環[14]。敲除GPX4可觸發依賴鐵離子和活性氧的鐵死亡，而GPX4過表達可抑制鐵死亡。小分子(如erastin)耗竭或GPX4抑制劑(1S，3R)-RSL3直接抑制GPX4的活性可導致GPX4失活，進而導致PL-PUFA過氧化和脂肪酸自由基產生，最終導致細胞死亡[15]，PL-PUFA過氧化是鐵死亡致細胞凋亡的主要環節。除直接抑制GPX4外，ACSL4還參與鐵死亡過程中氧化磷脂酰乙醇胺的產生，如花生四烯醇磷脂酰乙醇胺和腎上腺酰磷脂酰乙醇胺，它們是致死性脂質種類和鐵死亡的誘導劑。在敲除ACSL4基因時，細胞內的脂質過氧化和鐵死亡過程被阻斷[16]。

綜上所述，鐵死亡可能由鐵離子、谷氨酸及PL-PUFA的代謝累積或通過耗竭內源性鐵死亡抑制劑GPX4與谷胱甘肽引起，并通過此通路參與視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)、RPE和視錐細胞的凋亡過程。既往研究顯示，激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate，NMDA)/二價金屬離子轉運體1通路可引起細胞內Fe2+含量增加，從而導致青光眼患者的RGC死亡，而鐵離子的積累或GPX4/谷胱甘肽水平的降低抑制了胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白活性，可分別導致AMD、RP的RPE和視錐/視桿細胞凋亡。鐵離子螯合劑(去鐵胺)和鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)可阻斷RGC、RPE或視錐細胞的鐵死亡過程[17]。因此，鐵死亡機制在多種致盲性眼病的發生發展中發揮重要作用。

3 鐵死亡與致盲性眼病

目前，鐵死亡的研究熱點和臨床應用多集中于神經系統疾病、缺血再灌注損傷、腫瘤等，此外，眼科相關疾病(青光眼、AMD、RP、視網膜母細胞瘤)也涉及鐵死亡。

3.1鐵死亡與青光眼 RGC的退行性改變是青光眼的主要病理特征。由于鐵離子和谷氨酸的運輸和代謝失調，多種通路通過激活鐵死亡參與RGC凋亡過程?，F已證實，NMDA受體通過激活鳥苷三磷酸結合蛋白Dexras1，進而激活鐵轉運體(即二價金屬離子轉運體1)，最終誘導鐵離子內流。選擇性鐵離子螯合劑可顯著降低小鼠體內NMDA的興奮性毒性，Dexras1的耗竭能夠減輕NMDA誘導的RGC死亡，提示Dexras1在介導鐵離子內流和鐵死亡中起關鍵作用[18]。Sakamoto等[19]研究發現，玻璃體腔注射NMDA第7天，視網膜RGC內Fe2+積聚、細胞丟失，而鐵螯合劑治療可防止NMDA誘導的視網膜損傷，同時減少Fe2+積聚和脂質過氧化。NMDA受體在青光眼相關鐵離子轉運中起重要作用，阻斷NMDA受體可能有預防鐵死亡的作用。此外，氧化應激通路是導致青光眼RGC凋亡的另一個重要機制。一項臨床研究表明，原發性開角型青光眼患者血漿維生素E和維生素C水平顯著低于健康人群，推測維生素E(SEC14L2)和維生素C(SLC23A2)相關基因的多態性分別與原發性開角型青光眼的高風險相關[20]。然而，低水平血漿抗氧化劑以及原發性開角型青光眼視網膜氧化損傷修復與鐵死亡的關系仍有待進一步研究。

3.2鐵死亡與AMD 大量進行性RPE凋亡是絕大多數AMD患者出現非新生血管性AMD的主要病變特征。目前認為，鐵死亡參與調控AMD病程中的RPE凋亡。Hahn等[21]研究發現，AMD患者視網膜中總鐵含量高于同齡健康人，鐵誘導生成的氧自由基參與AMD中RPE細胞的損傷過程。在采用叔丁基過氧化物處理的AMD體外細胞模型的RPE細胞中，鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)和鐵離子螯合劑(去鐵胺)可顯著逆轉Fe2+的累積、脂質過氧化和谷胱甘肽耗竭等。外源性鐵的增加可促進叔丁基過氧化物誘導的RPE細胞死亡，該過程可被鐵抑素-1與去鐵胺抑制，表明部分叔丁基過氧化物誘導的RPE細胞死亡由鐵死亡所致[22]。

目前AMD發生鐵死亡的直接證據尚未明確，但在AMD患者中可觀察到鐵離子運輸和代謝失調的發生。干性AMD患者RPE中存在年齡依賴性的鐵含量增加[22-23]；AMD患者黃斑RPE和Bruch膜的總鐵水平高于同齡人群正常黃斑[24]；干性AMD患者房水鐵含量是正常人群的2倍以上[25]。由此可見，鐵代謝參與了AMD中RPE細胞的凋亡過程。

氧化應激亦是導致RPE凋亡的重要機制之一，一些抗氧化酶功能失調被認為是參與AMD中RPE細胞鐵死亡的原因。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，而GPX是谷胱甘肽生物合成至關重要的谷胱甘肽依賴酶。谷胱甘肽缺失導致GPX4失活，加速細胞內脂質過氧化進程，繼而引發鐵死亡[11]。谷胱甘肽對保護RPE免受活性氧損傷至關重要，谷胱甘肽的缺失可導致體外培養的ARPE-19細胞發生早衰，細胞活力降低，活性氧生成增加，GPX4表達降低，最終導致RPE凋亡[4]。谷胱甘肽缺乏引起的鐵死亡與ARPE-19細胞凋亡有關，鐵離子螯合劑(去鐵胺)和選擇性鐵死亡抑制劑(鐵抑素-1)可減輕細胞凋亡。由于ARPE-19細胞早衰可能與AMD的特征有關，谷胱甘肽功能異常引起的鐵死亡可能參與AMD的發病。

3.3鐵死亡與RP 目前人類已知的感光細胞有視桿細胞、視錐細胞和RGC 3種。RP中視桿細胞和視錐細胞呈現累積性的退行性凋亡，鐵死亡可能參與光感受器細胞的死亡。在rd10小鼠RP模型中，鐵螯合劑(去鐵胺)可減弱鐵離子相關氧化應激，光感受器退行性變與視網膜鐵蛋白減少以及脂質過氧化水平的降低有關[26]。去鐵胺可減少暴露于強熒光燈下小鼠視網膜的光損傷，與未給予去鐵胺組小鼠相比，給予去鐵胺小鼠光感受器細胞的細胞核保存較好，存活的光感受器較多[27]。另有研究證實，VK28和VAR10303(鐵螯合藥物)可部分挽救rd10小鼠RP模型視錐細胞，顯著改善其視功能[28]。

多數對鐵死亡參與RP發病的研究顯示，上調某些抗氧化酶的活性可使光感受器免受氧化損傷。GPX4和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)是視網膜中重要的抗氧化酶。研究顯示，光感受器細胞中誘導過GPX4的轉基因小鼠的視網膜結構與功能更佳，而與SOD1水平正常轉基因小鼠相比，SOD1缺乏RP小鼠視網膜的損傷氧化應激反應更輕[29]。SOD1缺乏rd10小鼠RP模型的視網膜氧化損傷加重，視錐細胞丟失加快，而SOD1和GPX4的共同表達可降低視網膜氧化損傷[29]。SOD1缺乏以及SOD1過度表達、GPX4表達水平降低的RP小鼠模型的視網膜氧化損傷增加，視錐細胞生理功能喪失加快[29]。以上研究提示，GPX4對保護光感受器免受氧化損傷至關重要，上調GPX4活性可能是治療RP的一種潛在途徑。

3.4鐵死亡與視網膜母細胞瘤 視網膜母細胞瘤是一種嬰幼兒多發的眼部惡性腫瘤，6%為常染色體顯性遺傳，94%為散發病例，其中25%為基因突變，余為體細胞突變。視網膜母細胞瘤的發病機制復雜，可致盲甚至致死，確切病因目前尚未明確，且尚無有效的治療手段。目前認為，p53基因突變、視網膜母細胞瘤1基因缺失是視網膜母細胞瘤發病的重要原因，而p53基因、視網膜母細胞瘤1基因均參與了鐵死亡。p53基因在細胞周期內扮演重要角色，具有抑細胞凋亡、促細胞增生的作用，許多腫瘤中均有p53的表達，且通過普通化學性手段無法將p53檢出。p53的表達水平與腫瘤的發生密切相關，視網膜母細胞瘤中其表達水平明顯高于正常視網膜組織[30]。

4 小 結

近年來，鐵死亡相關的研究均取得了較大進展，現已明確鐵死亡參與多種致盲性眼病的發生和進展過程，包括青光眼、AMD和RP等。鐵死亡通路為退行性改變導致的致盲性眼病的研究提供了新的方向，針對致盲性眼病信號通路的研究可能有助于尋找新的治療方法，如明確特異性基因治療作用靶點、開發有效的抑制性藥物，進而干預或延緩疾病進展。干預鐵死亡通路可能是一種潛在的眼病治療新策略，深入研究鐵死亡在眼科疾病中的作用及機制將為未來多種致盲性眼病的臨床治療帶來新的希望。