間充質干細胞治療嚴重燙傷的研究進展

楊仁生，龐榮清

(1.聯勤保障部隊第九二〇醫院干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室 云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室 昆明市干細胞與再生醫學重點實驗室 基礎醫學實驗室，昆明 650032； 2.昆明醫科大學，昆明 650500)

燙傷是指由沸水、蒸汽等熱力所致的組織器官損傷，是常見且復雜的創傷疾病之一[1]，是嚴重的世界性公共衛生問題[2]。燙傷可損傷皮膚，嚴重燙傷往往引發機體全身炎癥反應，甚至因多器官功能障礙綜合征(multi-organ dysfunction syndrome，MODS)而導致死亡[3]。目前，嚴重燙傷的主要治療策略是抗休克治療、抗感染治療、皮膚創面修復治療以及維持器官功能的對癥支持治療[4]，但療效不佳。一方面，這些治療方法在皮膚修復中難以實現，因為沒有合適的皮膚可以移植，且難以保證移植成功[5]；另一方面，這些治療方法與嚴重燙傷后的病理生理變化相互矛盾[6]。而間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)生物學研究的不斷進展為嚴重燙傷治療帶來新的希望[7-10]。因此，研究探索MSC調節嚴重燙傷引發的免疫功能紊亂[10]、修復皮膚創面[5]和組織[11]的技術方法及其作用機制顯得十分緊迫?，F就MSC治療嚴重燙傷的研究進展予以綜述，通過分析燙傷模型的選擇與MSC治療結合綜合考慮研究方案的必要性，展望借助高通量技術方法深入開展MSC治療嚴重燙傷系列研究的前景。

1 燙傷MODS的病理生理機制

皮膚由表皮、真皮和皮下組織構成，包括血管、毛囊和汗腺等附屬物[12]，是機體將外部環境與內部器官分開的重要屏障。當皮膚受到嚴重燙傷后，一方面，熱力效應直接破壞皮膚組織結構，導致組織滲透性增加，大量液體滲出，循環血量明顯減少，引起器官組織缺血缺氧，導致肺、肝等主要器官的功能障礙和損害[13]；同時，嚴重燙傷會引起全身應激性反應，尤其是胃腸道的應激性損傷，造成黏膜組織細胞的變性、壞死、脫落，直接破壞胃腸道黏膜屏障功能[14]，微生物趁機移位進入血液循環，形成腸源性的內毒素血癥[15]。腸源性的內毒素血癥是嚴重燙傷后導致多器官功能衰竭的重要原因之一。另一方面，大面積燙傷后，若不進行手術治療，創面持續存在，殘留的壞死組織及大量滲液為皮膚表面的大量微生物異常生長提供了良好條件，當創面上的微生物達到一定濃度時，微生物趁機侵襲機體焦痂深層，并不斷侵襲鄰近的健康組織，導致嚴重外源性感染[16]?？梢?，嚴重燙傷本質上是局部直接組織損傷并發遠端多器官組織炎性損傷。其主要病理生理機制是毛細血管網通透性增加，激活機體神經內分泌和免疫系統[17]，釋放大量應激激素和炎癥介質，逐步發展為“細胞因子風暴”或“瀑布效應”[18-19]。在此基礎上，內外源性感染發生，微生物及其細菌毒素進入血液循環形成菌血癥或膿毒癥，機體在兩次打擊下極易引發全身炎癥反應綜合征，甚至發展為MODS[3]。

由此可見，機體受到嚴重燙傷后，從皮膚損傷到MODS是一個不斷發展演變遞進的過程。研究觀察嚴重燙傷后的病理生理發展變化規律，針對關鍵發展環節，探索延緩或阻斷某個關鍵環節的發展進程，最大限度地減輕、延緩或阻止嚴重燙傷后引起的免疫功能紊亂、緩解臟器功能損傷，有可能降低以MODS為病理生理特征的急危重癥患者的死亡率。因此，從燙傷引起的MODS發病機制出發，以某個關鍵發展環節為切入點，深入探討嚴重燙傷的干細胞治療策略具有非常重要的科學意義和潛在的應用價值[20-21]。

2 MSC在嚴重燙傷治療中的應用

MSC是一類起源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能的不成熟細胞，可以從骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等器官或組織中分離獲取[22]。眾多干細胞生物學研究證實，MSC不表達主要組織相容性復合體Ⅱ、CD40和CD80等共刺激分子[12,23-24]，即MSC具有低免疫原性，可以異體甚至異種移植用于臨床治療。MSC可抑制淋巴細胞的增殖反應[25]，直接抑制淋巴細胞增殖，還可分泌多種活性因子參與免疫網絡調節[26]，從而減輕炎癥反應，避免了由糖皮質激素抗炎治療引發的機體免疫功能紊亂和抗生素治療導致的機體腸道菌群的異位和失調，從而加重機體的感染；同時MSC還具有歸巢和分化功能，促進皮膚組織和臟器組織修復，從而恢復臟器功能[27]。MSC的這些獨特生物學特性使得異體移植MSC治療嚴重燙傷成為可能。

2.1基于全身免疫調節的MSC治療 雖然MSC對機體燙傷的免疫調節機制尚不完全清楚，但目前普遍認為MSC主要依賴于細胞與細胞間的直接接觸或旁分泌免疫調節介質兩種方式來發揮免疫調節作用。研究表明，MSC可使巨噬細胞從炎癥的M1表型轉變為修復性抗炎M2表型[4,7-8]，使傷口產生抗炎性細胞因子[白細胞介素(interleukin，IL)-10][7]，減少促炎性細胞因子(腫瘤壞死因子-α)[9]。另一研究也顯示，MSC治療燙傷模型可以持續減少炎癥細胞因子(高遷移率族蛋白B1、IL-6和腫瘤壞死因子-α)的生成，而增加抗炎性細胞因子(IL-10)的生成[10]。說明MSC至少具有通過以IL-10為核心的平衡途徑正向調節機體免疫功能的作用。進一步研究發現，在創傷微環境中，促炎性細胞因子可以刺激MSC分泌一氧化氮、前列腺素E2和吲哚胺2,3-雙加氧酶等介質[28]，通過影響免疫細胞的增殖及分化，發揮免疫調節作用，如轉化生長因子-β和前列腺素E2可抑制T細胞產生IL-2，抑制輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)0分化為Th1細胞，促進Th1細胞向Th2細胞轉化，抑制自然殺傷細胞、M1型巨噬細胞和B細胞等促炎免疫細胞的增殖和分化，促進M2型巨噬細胞和調節性T細胞等抗炎免疫細胞的增加[12,29-30]。MSC的這些調節作用中有一個重要的作用機制是可以調節p38促分裂原活化的蛋白激酶和核因子κB P65 蛋白的磷酸化水平，在燙傷中可激活肝臟庫普弗細胞，MSC可以在嚴重燙傷下通過分泌腫瘤壞死因子-α刺激基因6，從而減輕機體的炎癥反應[10]。

根據嚴重燙傷的病理生理進展，結合MSC生物學功能方面的實驗發現，利用MSC的免疫調節功能治療嚴重燙傷是可行的，但目前的研究主要表明MSC治療起到了調節免疫功能的作用，并揭示了部分作用機制，迫切需要在掌握嚴重燙傷后病理生理發展變化規律的基礎上，進一步廣泛研究MSC的免疫調節作用及其更全面的免疫調節網絡機制，尤其應該注意負向調節機制研究。以此為切入點，從免疫調節療效角度深入探索MSC的體外預處理方案以及細胞治療的時機和細胞治療劑量對燙傷治療的影響，有望最大限度地糾正嚴重燙傷后免疫功能失衡。這可以在一定程度上延緩或阻止機體全身炎癥反應甚至預防MODS的發生，從而降低嚴重燙傷患者的死亡率[31]。

2.2基于外泌體的MSC治療 MSC除了分泌多種活性因子及介質外，還能分泌外泌體發揮生物學作用。外泌體是一種由真核細胞的多泡體與胞膜融合后釋放到胞外的納米級膜性小囊泡[32]，其作為信號分子載體，可以在不同細胞間進行信息傳遞及細胞大分子間的傳遞，調節細胞間的信號轉導，參與疾病的發生發展，將生物分子傳遞到受體細胞發揮多種生物學功能[33]。MSC能夠通過外泌體將巨噬細胞暴露于微RNA來調節炎癥反應，這些RNA結合到免疫細胞中并抑制促炎性細胞因子的分泌。然后通過免疫細胞之間的這些微RNA的交換來傳遞信息，進一步調節免疫系統[34]。同時，MSC來源的外泌體還可以促進傷口的血管生成素2上調，進而增強損傷區域血管內皮細胞的增殖、遷移、成管能力，從而促進血管生成，加快傷口愈合[35]。MSC的免疫調節作用與分化修復作用并不是孤立存在的，如MSC釋放的外泌體除了促進血管生成，還可通過極化M2型巨噬細胞來減輕黏膜炎癥，維持小鼠腸道結構的完整性[36]?？梢?，外泌體是MSC臨床轉化應用的延伸。外泌體遠小于MSC，大劑量使用不會導致肺栓塞，更重要的是可以制成注射液，目前已經有外泌體直接注射、靜脈注射、腹膜內注射、口服給藥和基于水凝膠的包埋研究，已經被用來治療不同的疾病模型[37]。在戰爭條件下，燃燒彈、火焰噴射器等武器的使用更易集中出現大量嚴重傷病員，MSC來源的外泌體注射液的成功開發，使得野戰條件下使用成為可能。

2.3基于組織修復的MSC治療 MSC治療嚴重燙傷的另一個重要機制是干細胞的分化和修復功能?；A研究表明，移植進入體內的MSC可以在趨化因子的引導下靶向遷移到燙傷創面及機體組織中定植，在特定微環境條件下分化為相應的組織細胞，如皮膚細胞等[2,38]。有研究發現，介導MSC靶向遷移的是炎癥組織中的基質細胞衍生因子1，呈梯度分布的基質細胞衍生因子1會引導更多的MSC向受損部位遷移[9,12]，并分化為功能組織細胞以替代受損細胞[12]。MSC可通過旁分泌機制分泌多種生長因子和誘導因子，激活機體原位干細胞分化成熟，促進傷口快速愈合[9]。同時，MSC還可分泌乳酸鹽，使巨噬細胞極化轉變為修復性抗炎M2型巨噬細胞，從而增加抵抗素樣分子α和整合素(CD11b)的表達，其中抵抗素樣分子α可抑制炎癥反應的發展，促進新生血管的生成和成肌纖維細胞的增殖和分化，進而促進傷口的愈合[39]；CD11b可誘導IL-10的表達，通過多途徑調節傷口炎癥反應，并通過抑制T細胞增殖抑制長時間炎癥引起的皮膚纖維化[40]，從而抵御外界病原微生物的侵入，預防炎癥進一步加重。此外，MSC還廣泛參與腸[36]、肺[41]和肝[25]等器官損傷修復，并通過修復組織器官緩解內源性感染，促進皮膚愈合預防外源性細菌侵入機體進一步加重全身炎癥反應。因此，開展MSC修復嚴重燙傷組織研究，需要復制不同損傷程度的模型，并開展不同途徑的細胞給藥比較研究。

3 基于MSC治療需求的燙傷動物模型選擇

從上述分析可知，開展MSC治療燙傷研究必須首先建立一個穩定、規范化、符合臨床要求的燙傷動物模型。從實驗動物的特點來看，豬的皮膚組織結構和生化指標與人極其相似[1，20]，體型大小也更適于皮膚移植的手術操作，但實驗成本相對較高，且難以大批量復制模型用于細胞劑量篩選等研究。小鼠個體太小，血管太細，而MSC直徑較大，當靜脈輸注MSC進入血管時，細胞數量稍多易造成梗死，不太適于開展MSC靜脈輸注治療研究。因此，燙傷動物模型最常用大鼠和兔[42-44]。

從MSC治療實驗設計來看，利用金屬棒[45-48]直接接觸動物皮膚造成局部皮膚不同程度損傷的方法簡便易行，容易精準控制燙傷作用時間、創面形狀和面積，便于批量復制燙傷動物模型，但因為金屬燙頭與皮膚之間容易導致致傷壓力不均、局部高溫容易造成表皮凝固性壞死而不利于熱力效應向深層傳播、金屬燙頭容易快速降溫，故這類局部燙傷的動物模型均一性不好，不易誘發全身應急性損傷，較適于小樣本局部皮膚創面修復的治療觀察研究。直接接觸熱水致傷的方法[29，39]容易控制水溫，但不好控制燙傷皮膚的形狀和面積，且水溫最高100 ℃，易導致表皮凝固性壞死，不利于熱力效應向深層傳播，同樣相對不易誘發全身應急性損傷。而蒸汽溫度遠超100 ℃，即便在海拔1 890 m的昆明地區也可高達110 ℃，且熱力效應穿透力極強，蒸汽作用時間極易精準控制，特別容易造成大面積皮膚深度損傷，如果輔以特定的蒸汽產生裝置和特定的皮膚保護模具[7]，很容易短時間內批量制備不同創面大小或不同燙傷程度的均一燙傷模型，很容易誘發局部組織變性壞死和全身性炎癥反應，特別適于開展局部皮膚組織MSC修復治療、MSC系統性預防和治療效果評價以及治療機制研究，同時獲得的模型也可用于研究觀察MSC生存演變規律。

回顧MSC治療燙傷的相關研究發現，不同實驗研究的結果不適合進行比較，因為制作燙傷模型差異較大，如熱水致傷大鼠模型水溫差異太大，故動物模型病理生理變化差異也很大。因此，在開展MSC治療燙傷研究時，應充分考慮不同制備方法獲得的燙傷動物模型的病理生理變化特點、將動物模型制備與MSC治療方案結合起來綜合考慮設計研究方案，如研究MSC預防或治療嚴重燙傷引發的全身性炎癥反應時，只有選擇蒸汽致傷這類致傷嚴重的模型，才能模擬從皮膚損傷到MODS的過程，也才能探索延緩或者阻斷某個關鍵環節發展進程的切入點，在構思科研立項時，才能找準需要解決的科學問題，也才更有利于從不同角度深入推進MSC治療嚴重燙傷的系列研究。事實上，目前MSC治療燙傷的研究，最需要的就是基于從皮膚損傷到MODS的動態發展變化規律的認識、借助各種高通量檢測分析技術手段開展的非現象觀察的深層次研究，有望理清嚴重燙傷引發的免疫功能紊亂以及MSC調節的十分復雜的調控網絡機制和因果關系，以為將來臨床轉化應用提供理論依據。

4 小 結

MSC在嚴重燙傷中發揮重要作用，可以利用其生物學功能調節炎癥反應、促進創面血管新生、促進創面愈合。鑒于目前嚴重燙傷的治療效果尚不滿意的現狀，結合嚴重燙傷的病理生理變化特點，充分運用MSC基礎研究的最新成果，建立合適的動物模型研究開發嚴重燙傷等以MODS為病理生理特征的急危重癥治療新技術具有重要意義。但是MSC的輸入途徑、劑量、時間仍需要明確，未來應進一步了解MSC的功能及其機制，以為臨床治療嚴重燙傷提供理論依據。