健脾調腸湯對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎小鼠NLRP6、NLRP3信號通路的影響

王延秋，郭 星，龐晨歡，袁子云，劉海濤，杜曉泉

(1. 陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712000；2. 陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000)

潰瘍性結腸炎是一種以反復腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現的慢性非特異性炎癥性腸病，具有病情易反復、難治愈特點，是消化系統難治疾病之一[1]。其發病與遺傳、免疫、腸道菌群、環境因素密切相關，其中免疫調節失常貫穿該病發生發展的整個過程[2]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRs)家族作為一類模式識別受體，參與機體固有免疫，其中NLRP3和NLRP6是NLRs家族中與炎癥性腸病發生發展聯系最為密切的兩種炎癥小體[3]。當遭受炎癥或病原體刺激后，機體會啟動先天免疫應答，上調NLRP3的表達，釋放白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)等炎癥因子，導致腸黏膜屏障受損；而NLPR6在被激活時，可通過調控白細胞介素-22(IL-22)的表達而促進腸上皮occludin蛋白[4]和黏蛋白的分泌[5]，從而修復受損的腸黏膜。健脾調腸湯是杜曉泉教授在長期實踐中總結的治療潰瘍性結腸炎的有效經驗方，臨床研究證實該方可顯著改善潰瘍性結腸炎患者的臨床癥狀[6]；動物研究證實該方可通過抑制核因子-κB(NF-κB)活化，改善2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜病理改變，促進大鼠結腸潰瘍愈合[7]。本研究旨在通過觀察健脾調腸湯對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎小鼠炎癥因子及腸黏膜NLRP6、NLRP3、occludin蛋白表達的影響，進一步探討健脾調腸湯對潰瘍性結腸炎小鼠的腸黏膜修復機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠60只，8周齡，體重(20±2)g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(陜)2018-001。小鼠飼養于陜西中醫藥大學醫學科研實驗中心動物房，12h光照和黑暗循環，室內溫度(23±2)℃，空氣相對濕度40%～55%。本實驗經陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過(2020010)。

1.2藥物 健脾調腸湯由黨參15 g、白術15 g、薏苡仁15 g、敗醬草15 g、黃連3 g、陳皮12 g、厚樸12 g、血竭5 g組成，藥材購于陜西中醫藥大學附屬醫院中藥房。精確稱取上述藥物，涼水浸漬30 min，煎煮2次，每次30 min，4層紗布過濾，合并濾液水浴蒸發制成1 g/mL生藥的水煎液，高溫滅菌，冰箱4 ℃保存待用。柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業有限公司，國藥準字H31020557，批號：09201103，規格：0.25 g)，取適量片劑研磨成粉，然后溶于蒸餾水中，配制成濃度為0.02 g/mL混懸液，低溫封存備用。

1.3試劑與儀器 DSS(美國MP公司，貨號：HY-17027)；小鼠IL-1β、IL-18、IL-22 ELISA試劑盒(聯科生物，貨號：EK0201B/3，EK218-48，EK222/2-48)；山羊抗兔NLRP6 抗體、山羊抗兔 β-肌動蛋白(β-actin)抗體(武漢愛博泰克生物科技公司，貨號：A15628，BM0627)；山羊抗兔NLRP3抗體、山羊抗兔OCLN抗體(武漢博士德生物有限公司，貨號：BA3677，BM4832)；HRP-羊抗兔、HRP-羊抗小鼠(武漢博士德生物有限公司，貨號：BA1054，BA1050)。高速冷凍離心機(日本日立CR22G Ⅱ)、研究級正置數碼顯微鏡(Zeiss A1及A2)、電泳儀(北京六一)、轉膜儀(上海天能)、電子精密天平(賽多利斯)、石蠟切片機(德國徠卡)、勻漿器(寧波新芝)。

1.4實驗方法 60只小鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組及健脾調腸湯高、中、低劑量組，每組10只。正常組自由飲水進食；其余各組小鼠連續7 d自由飲用3% DSS溶液，接著連續7 d自由飲水，重復2個循環后，隨機選取3只小鼠取結腸組織，行HE染色觀察潰瘍性結腸炎模型是否造模成功。證實造模成功后，從第29天開始，健脾調腸湯高、中、低劑量組分別給予27.64 g/kg、13.82 g/kg、6.91 g/kg健脾調腸湯灌胃(按體表面積法[8]計算給藥劑量)，柳氮磺吡啶組給予0.45 g/kg柳氮磺吡啶溶液灌胃；正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每日1次，連續灌胃14 d，動物飼養期間自由飲食及飲水。每天觀察小鼠的一般情況變化，如精神狀況、活動情況、毛色、體重、飲食飲水量、大便狀況。

1.5標本采集 藥物干預結束，小鼠禁食24 h，用5%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉小鼠后，摘眼球取血，采血后處死小鼠，剪取全結腸，在結腸病變處截取1 cm，置于4%多聚甲醛溶液固定，剩余結腸組織凍存管分裝，-80 ℃冰箱保存。

1.6觀測指標及方法

1.6.1小鼠一般情況及體重、疾病活動指數(DAI)每天觀察小鼠活動度及糞便形狀和隱血情況，測量體重，并根據以下評分量表(見表1)計算 DAI，DAI=(體重減輕百分比評分+糞便性狀評分+隱血或血便評分)/3。

1.6.2血清IL-1β、IL-18、IL-22水平 根據ELISA試劑盒的相關說明檢測血清IL-1β、IL-18、IL-22水平。

1.6.3結腸組織病理學觀察 各組小鼠結腸組織多聚甲醛固定后脫水、包埋、切片、HE染色，觀察結腸組織病理損傷況。

表1 疾病活動指數評分量表

1.6.4結腸組織中NLRP6、NLRP3、Occludin蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：提取結腸組織蛋白，BCA法測定蛋白含量。根據待檢測蛋白相對分子質量，用合適濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離(濃縮膠電壓為80 V，待蛋白樣品電泳至下層分離膠時調為100 V恒定電流，條帶跑至底部時停止)，隨后電轉(150 mA，80 min) 至PVDF 膜上。用TBST洗膜5～10 min×3次，用脫脂奶粉封閉2 h，封閉完的PVDF膜用TBST清洗1遍后置于一抗中，置于4 ℃冰箱緩慢搖動過夜。次日，TBST洗膜后加入二抗(HRP-羊抗兔1∶5 000，HRP-羊抗小鼠1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜，加ECL工作液，吸干發光液，置印跡膜于成像分析儀自動成像，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組小鼠一般情況及體重、DAI評分變化 造模前各組小鼠活潑好動、毛色光亮、反應靈敏。造模期間，除正常組外，其余各組小鼠造模約3 d后大便變稀，無肉眼血便，部分小鼠出現大便隱血陽性；造模第7天，各組小鼠出現肉眼血便，精神萎靡，懶動遲鈍，毛色晦暗，體重下降，DAI評分均明顯高于正常組(P均<0.05)；飲用蒸餾水第3天開始小鼠大便逐漸成形，體重增加，活動度增加；循環第二周期結束時小鼠體重增加幅度小于第一周期結束時，其體重變化與DSS干預呈動態變化。各給藥組小鼠給藥期間體重隨時間的變化逐漸增加，各時間點均明顯高于模型組(P均<0.05)，且健脾調腸湯高劑量組、柳氮磺吡啶組變化更為明顯(P均<0.05)；除正常組外，其余各組小鼠的DAI評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠體重及DAI評分變化

2.2各組小鼠血清IL-1β、IL-18 和IL-22水平比較 與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18水平均明顯升高(P均<0.05)，血清IL-22水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和健脾調腸湯高劑量組血清IL-1β、IL-18水平均明顯降低(P均<0.05)，健脾調腸湯各組及柳氮磺吡啶組血清IL-22水平均明顯升高(P均<0.05)，健脾調腸湯中、低劑量組血清IL-1β、IL-18水平變化不明顯(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠血清IL-1β、IL-18和IL-22水平比較

2.3各組小鼠結腸組織病理表現 正常組小鼠結腸組織黏膜上皮結構完整，固有層腺體排布規整，杯狀細胞數量正常；模型組小鼠結腸組織黏膜上皮缺損，腺體出現分支且不規則，隱窩萎縮變形，排布雜亂，杯狀細胞變少，可見慢性炎癥細胞浸潤；與模型組比較，柳氮磺吡啶組及健脾調腸湯各組可見上皮結構缺損程度、腺體紊亂程度及炎性細胞浸潤程度有所減輕，隱窩結構改變有所緩解，其中柳氮磺吡啶組及健脾調腸湯高劑量組改善更為明顯。見圖2。

圖2 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸黏膜HE染色表現(×100)

2.4各組小鼠結腸組織中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白表達情況 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中NLRP6、occludin蛋白相對表達量明顯降低(P均<0.05)，NLRP3蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組和健脾調腸湯低劑量組比較，健脾調腸湯高、中劑量組及柳氮磺吡啶組小鼠結腸組織中NLRP6、occludin蛋白相對表達量均明顯增高(P均<0.05)，NLRP3蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，健脾調腸湯高劑量組、健脾調腸湯中劑量組及柳氮磺吡啶組各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖3和表3。

1為柳氮磺吡啶組；2為健脾調腸湯高劑量組；3為健脾調腸湯中劑量組；4為健脾調腸湯低劑量組；5為模型組；6為正常組圖3 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白表達情況

表3 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白相對表達量比較

3 討 論

潰瘍性結腸炎病變主要累及結腸黏膜和黏膜下層，腸黏膜屏障功能受損是其發生的主要病理學基礎[9]。潰瘍性結腸炎的反復發作與多因素作用有關，其中免疫異常是主要影響因素[10]。當腸道的免疫系統發生異常，可導致大量炎癥因子釋放，從而引起腸上皮細胞壞死、脫落，腸黏膜的自我修復能力受限，使病情反復發作。

NLRs是一大類炎癥蛋白，可同時感知病原體相關的分子模式(PAMPs)和損傷相關的分子模式(DAMPs)，并通過招募凋亡相關的斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1或11(Caspase-1或11)形成炎癥復合物，參與免疫應答[11]。NLRP3蛋白激活后能促進NLPR3炎癥小體的組裝，之后促進大量有活性的IL-1β和IL-18釋放，加重腸道的炎性損傷[12]；NLRP6高度表達于腸道組織中，其嚴格調控作用是維持腸道內環境穩態的關鍵[13]，近期研究表明NLRP6在調節腸道微生物群、維持上皮屏障完整性、促進腸道上皮損傷的愈合和抑制腸上皮的異常增殖方面起著重要作用[14]。在潰瘍性結腸炎的免疫反應中，NLRP6被激活，并通過調控IL-18以促進IL-22結合蛋白分泌，競爭IL-22的結合位點，提高IL-22含量，IL-22可以促進腸道上皮細胞分泌黏蛋白、抗菌肽以增強腸道固有免疫反應，并刺激腸道內質網發生應激反應以增強腸道上皮屏障功能[15]。在潰瘍性結腸炎緩解期，適當的IL-22分泌可以上調腸黏膜中occludin表達，促進上皮細胞增殖修復，維持腸道屏障結構的完整性[16]，從而增強腸道屏障功能。

潰瘍性結腸炎屬中醫“久痢”“泄瀉”范疇，脾虛濕滯、血壅腸腑是其主要病機，臨床上常用健脾理氣、清熱利濕、解毒排膿之法治之。健脾調腸湯組方中黨參益氣健脾，敗醬草清熱解毒、排膿化瘀，二者共為君藥；白術健脾利水，黃連清熱燥濕、厚腸胃，薏苡仁健脾利濕、清熱排膿，共為臣藥；佐使藥陳皮、厚樸理氣燥濕，血竭化瘀活血止血、生肌斂瘡、消腫止痛，且血竭能抑制血栓形成，改善腸道局部血液循環，促進創面愈合[17]。全方具備健脾祛濕、養血消壅之功效。

本實驗采用3% DSS溶液與蒸餾水交替喂養小鼠構建潰瘍性結腸炎模型，該模型的病理改變及病程變化能更準確地模擬人類潰瘍性結腸炎的特點[18]，適用于研究潰瘍性結腸炎藥物潛在靶點。本研究發現，造模后小鼠出現體重下降、精神萎靡、稀水樣便、血便等，且這些癥狀隨著DSS與蒸餾水交替而呈動態變化，在DSS結束時小鼠體重下降最明顯，DAI評分最高，而開始給予蒸餾水時，小鼠體重下降停止，緩慢增加，DAI評分逐漸下降，這與臨床上潰瘍性結腸炎患者癥狀反復相似。給予藥物干預后，各給藥組小鼠體重逐漸恢復，一般狀態好轉，結腸組織病理情況改善；與模型組比較，健脾調腸湯高劑量組血清IL-18、IL-1β水平和健脾調腸湯高、中劑量組結腸組織中NLRP3蛋白相對表達量明顯降低，健脾調腸湯各劑量組血清IL-22水平和健脾調腸湯高、中劑量組結腸組織中NLRP6、occludin蛋白相對表達量均明顯增高。

本實驗結果提示，健脾調腸湯可能通過影響NLRP3、NLRP6蛋白表達以抑制IL-18、IL-1β釋放，減輕潰瘍性結腸炎小鼠腸道的炎癥損傷；通過分泌IL-22而上調occludin表達，以促進腸上皮細胞增殖，影響潰瘍性結腸炎小鼠的腸黏膜修復。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。