咖啡因對C57BL/6小鼠防脫發的實驗研究

郭曉東，趙麗娟

（1.呂梁市中醫院，山西 呂梁 033000；2.湖北省襄陽市谷城縣第二人民醫院，湖北 襄陽 441100）

0 引言

隨著現在工作壓力、生活壓力等逐漸增加，不少人群都存在脫發的情況。生理性脫發指的是毛發在休止期時自然脫落，病理性脫發是由于各種因素導致每日脫發數量超過100根的現象，打破了頭發生長的動態平衡，頭發變得稀疏，甚至會出現禿頂的情況，不僅對容貌造成影響，也對人的心理和精神產生了嚴重的負擔[1]。

迄今為止，FDA只批準口服非那雄胺與外用米諾地爾治療脫發，但20%-30%的患者在治療一段時間后仍舊沒有好的療效，而且會產生藥物依賴性?？Х纫蚴且环N天然的生物堿，主要來源是咖啡豆，其次是茶。有研究表明咖啡因可逆轉睪酮對毛囊的生長抑制作用[2]，目前對毛囊和毛細血管的研究較少，本文旨在研究咖啡因作用在小鼠毛囊和毛細血管時對毛發生長的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物

60只近交系C57BL/6小鼠，雌雄各半，6~8周齡，體重15~20g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，[編號：SCXK(京)2012-0001]。飼養于中日友好醫院臨床研究所動物飼養室（SPF級），溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每日通風1次，小鼠有充足活動空間、正常飲食，適應性飼養2周后實驗。

1.1.2 實驗材料

治療藥物為1%咖啡因溶液（自配）；5%米諾地爾溶液（自配，生產批號，60mL）；RTPCR試劑盒、DNA Marker為日本TaKaRa公司產品；Trizol為美國Sigma公司產品；丙酸睪酮注射液（1mL:25mg，天津金耀藥業有限公司，產品批號：國藥準字H12020531）；小鼠CD34單克隆抗體試劑盒，為美國Biolegend公司產品。

1.1.3 主要儀器

正置熒光顯微鏡（廣東艾斯拓鼎，型號：ASTD）；電子數顯游標卡尺（桂林廣陸，型號：211-102F）；皮膚毛發觀察儀（南京倍寧，型號：BNPFMF-8001）。凝膠掃描（ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統）成像。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

將小鼠按照隨機數字表法將其隨機分為4組，每組15只。分別為①空白組；②模型組（陰性對照組）；③1%咖啡因組（實驗組）；④米諾地爾組（陽性對照組）。

1.2.2 動物模型的建立及干預方案

以平行脊椎為長軸，空白組皮下注射注射用油，其余三組皮下注射丙酸睪酮注射液，4組均1次/d，劑量為5mg/（kg·d）。造模次日進行干預，空白組不予處理，模型組涂抹生理鹽水，咖啡因組與米諾地爾組涂抹給藥，除空白組外，另外三組用棉簽涂抹5min后使用生理鹽水沖洗干凈。每日定時給藥1次，連續給藥18d。

1.3 指標監測

1.3.1 觀察結果

觀察各時段各組小鼠的一般狀態。從第4周開始收集小鼠脫落毛發；在相同條件下梳理小鼠背部毛發，隨后用眼科鑷收集脫落毛發并保存在自封袋中，測量脫發重量，用于小鼠脫發程度的考察。

1.3.2 HE染色

在涂藥第7周，每組取3只小鼠觀察區皮膚約2cm×2cm面積大小，進行常規組織脫水、石蠟包埋、切片、HE染色（蘇木精-伊紅染色），通過電子顯微鏡與NISElements BR軟件聯用，在顯微鏡下觀察小鼠毛囊個數以及形態學變化。觀察毛囊橫斷面和縱切面，制片時取同一水平面的皮膚橫斷面統計毛囊總數，每張切片取3個視野（100倍下）。

1.3.3 RT-PCR檢測

提取總RNA 及 RT-PCR。脫毛后第7周取背部皮膚，Trizol法提取總RNA，采用DNA Marker試劑盒進行一步法RT-PCR。針對小鼠血管內皮細胞生長因子VEGF mRNA的特異性引物序列為5＇-CAGGCTGCTGTAACGATGAA-3＇及5＇-AATGCTTTCTCCGCTCTGAA-3＇，反應產物為266bp。針對小鼠肝細胞生長因子HGF特異性引物序列為5＇-CCATGAATTTGACCTC-TATG-3＇及5＇-ACTGAGGAATGTCACAGACT-3＇，反應產物為421bp。針對小鼠類胰島素一號生長因子 IGF-1 特異性引物序列為5＇-CACACCCAGGAGGGGAACAG-3＇及5＇-GTGTTGTTGATGCTCCGTCC-3＇，反應產物為327bp。RT-PCR步驟按照 DNA Marker 試劑盒說明書進行，RT-PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳（100V，25min），溴乙啶染色。凝膠掃描（ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統）成像。

1.3.4 CD34免疫組化染色

CD34表達采用免疫組化法，操作步驟按試劑盒說明書進行。以抗CD34抗體標記顯示血管內皮細胞，顯微鏡下每條棕黃色血管內皮細胞或細胞簇代表單獨微血管。先于100倍視野內選擇CD34標記的微血管密度高的區域，再在200倍視野內選取5個視野，取平均值（MVD）。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較使用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠一般狀態觀察

給藥組小鼠注射丙酸睪酮注射液后，有明顯活動增加，并出現相互廝打現象。持續給藥4周后，小鼠背部毛發呈灰暗顏色，持續給藥6周后毛發脫落?？Х纫蚪M和米諾地爾組比模型組脫落的毛發少，其中米諾地爾組最為明顯，咖啡因組較為明顯。

表1 各組小鼠脫發重量（n=15，±s）

表1 各組小鼠脫發重量（n=15，±s）

注：＊咖啡因組與模型組比較，t=9.673，P＜0.01，米諾地爾組與模型組比較，t=12.420，P＜0.01。#與米諾地爾組相比較，t=2.308，P＜0.05。

組別 脫毛重量（mg）空白組 10.6±1.62模型組＊ 26.6±2.33咖啡因組＊# 18.5±2.08米諾地爾組＊ 16.8±1.79

2.2 四組小鼠毛囊數量

HE染色后，于顯微鏡下觀察毛囊縱切面及同一水平橫斷面。觀察縱切面模型組毛囊稀疏，而咖啡因組與米諾地爾組毛囊密度較好。同一水平橫斷面比較各組毛囊數量，咖啡因與米諾地爾兩組明顯較模型組增多，差異具有統計學意義。小鼠毛囊數量比較，見表3。

表2 4組小鼠毛囊數量比較（n=15，±s）

注：＊咖啡因組與模型組比較，t=2.130，P＜0.05，米諾地爾組與模型組比較，t=5.332，P＜0.01。#與米諾地爾組相比較，t=3.254，P＜0.01。

組別 毛囊數量（個）空白組 75.4±10.18模型組＊ 34.3±10.85咖啡因組＊# 42.9±10.51米諾地爾組＊ 55.9±10.52

2.3 咖啡因對小鼠皮膚 VEGF mRNA 表達的影響

脫毛后第18天，咖啡因組、米諾地爾組在小鼠皮膚266bp處檢測到VEGF mRNA 表達、模型組及空白組有輕微特異性條帶，見圖1。

2.4 咖啡因對小鼠皮膚 HGF mRNA 表達的影響

脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在421bp處檢測到HGF mRNA 表達，空白組與模型組可見輕微HGF特異性條帶，見圖2。

2.5 咖啡因對小鼠皮膚 IGF-1 mRNA 表達的影響

脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在327bp處檢測到IGF-1 mRNA 表達，空白組與模型組可見輕微IGF-1特異性條帶，見圖3。

2.6 免疫組化CD34測定小鼠脫毛區MVD

取平均值之后的差異性對比發現，咖啡因組與米諾地爾組對比，差異無統計學意義（P＞0.05）?？Х纫蚪M與空白組對比差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

脫發是一種由多因素引發的常見疾病，會造成抑郁、焦慮等多種心理問題，并對生活質量有巨大的負面影響，包括使一個人的自我意識增強、失去自信和降低自尊心等[3-4]。主要病因是雄性激素入血后，至頭皮轉化為毒性物質，使毛囊的能量和蛋白質代謝發生障礙，導致脫發。微循環是生命的基本特征之一，其發生障礙可導致血液流量下降，毛囊供血不足，發無生長之源而脫落[5]。迄今為止，非那雄胺和米諾地爾治療20%-30%的脫發患者療效不佳[6]，同時具有藥物依賴性。

最近已有研究報道咖啡因的抗纖維化、抗炎和抗氧化活性[7]，同時觀察到咖啡因在皮膚微血管中的作用，增強皮膚小動脈和毛細血管的微血管功能[8]。大量研究[9]表明局部使用咖啡因能夠刺激毛囊生長，從而防止脫發。N.Otberg[10]等通過對6名男性志愿者使用咖啡因洗發水（Alpecin；Dr.Kurt Wolff GmbH）進行試驗，研究結果表明在使用2min后，檢測到咖啡因滲透到角質層和毛囊中，在使用2h后達到最高值。Rachita Dhurat[11]等研究發現在6個月時，使用5%米諾地爾溶液組的毛狀圖的生長期比值平均改善率為11.68%，而使用1%咖啡因溶液組的生長期比值平均改善率為10.59%，兩組間均值差異為1.09%；意味著1%的咖啡因溶液可以達到防止毛發脫落的效果。同時研究發現使用0.2%的咖啡因溶液的頭皮瘙癢基線有顯著改善，而5%的米諾地爾溶液沒有改善。因此，對于雄激素性脫發，基于咖啡因的局部液體效果不低于5%米諾地爾溶液，且不良反應事件較少。但是有研究[12]觀察到使用較高濃度的咖啡因具有抑制作用，高濃度的咖啡因可能會導致毛囊處于高代謝狀態，消耗大量能量后導致脫發。所以，在治療脫發時要注意咖啡因的使用濃度，這也為后續研究提供新思路。

毛囊的正常發育和周期性循環取決于毛囊上皮與鄰近的間充質真皮乳頭的相互作用[13]。單個毛囊可分生長期、退行期和休止期[14]，而生長期對于新毛發的產生至關重要，其中毛發長度（未剪斷）與生長期（頭皮毛發：2-8年）的長度成正比[15]。從生長期到退行期的轉變受維持生長的類胰島素一號生長因子（IGF-1）的影響[16]。IGF-1是種胰島素生長因子，能促進細胞的生長和增殖，同時也可以促進血管內皮生長。通過刺激IGF-I表達，可以促進毛囊的生長，抑制毛囊進入退行期，達到相對延長毛發生長期的目的[17]。因此，IGF-1的高表達有利于維持生長期。另一種研究較多的是利于維持生長期的生長因子，即血管內皮生長因子（VEGF），它是一種二聚體糖蛋白，可刺激血管生成。多項研究表明，VEGF可以促進頭發生長，增加毛囊大小和頭皮厚度。VEGF是可作用于毛囊的生長因子，其表達高低影響著毛囊周圍血液微循環，VEGF表達增加能促進毛囊細胞新陳代謝和發育[18]。肝細胞生長因子（HGF）有多種功能，但其調節毛囊毛發生長的機制可能為：調節真皮乳頭細胞和上皮角質形成細胞之間的相互作用；誘導毛囊周圍血管的形成；影響毛囊的周期性循環[19]。CD34陽性細胞是毛囊循環再生的因素之一，用于評估皮膚的毛細管密度，其缺乏可能導致毛囊循環的中斷，但其具體機理有待進一步證明和研究[20]。

綜上所述，咖啡因對C57BL/6小鼠毛發、微循環血供的研究結果表明，1%咖啡因與米諾地爾皆可以減少小鼠毛發脫落，增加頭皮毛囊數量，并增強VEGF mRNA、HGF mRNA、IGF-1 mRNA表達；增加毛細血管密度，最終達到防止小鼠毛發脫落的效果。