梨幼果FWL1膜系統酵母雙雜交三框cDNA文庫構建及互作蛋白的篩選

賽靜憶，溫玥，郝志超，田嘉

（新疆農業大學園藝學院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】果實大小為數量性狀遺傳，是由細胞大小和細胞數目共同決定的[1-3]。庫爾勒香梨（PyrussinkiangensisYu）為薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）梨屬（Pyrus.L）植物，是新疆特色水果之一[4]。庫爾勒香梨皮薄肉脆、獨特芳香、耐貯藏等，但果實偏小，平均單果重僅為100 g 左右，且可食部位較少。不同大小香梨果實經濟價值差異較大。Fw2.2（fruit weight2.2）基因是影響果實大小中最重要的數量性狀基因之一，在細胞分裂時期對細胞數目進行負調控，占整個果實大小變異的30%。但該基因為膜蛋白，不能直接行使其功能。分析研究梨FWL（fruit weight2.2-like）同源基因與其互作蛋白之間的關系，構建梨幼果FWL1 膜系統酵母雙雜交三框cDNA 文庫，對研究FWL1基因調節果實大小機理有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已經發現了多個與果實大小性狀關聯的基因，以不同方式影響植物生長發育，調控果實大小。目前，從番茄中分離的fw2.2 是目前已知調節果實大小最關鍵的基因。細胞分裂時期，在小果野生種表達量較高，在大果栽培品種中表達量較低，影響細胞數目，負調控果實大小，占整個果實大小變異的30%。fw2.2為細胞膜蛋白，不能直接行使其功能，通過酵母雙雜交表明，與酪蛋白激酶II（CKII）調節亞基的同源蛋白相互作用[5]，調節細胞周期，進一步影響果實質量與體積[6]。李志超等[7]從酸漿屬中分離了fw2.2 的同源基因，命名為Physalis Organ Size2（POS2），POS2不但影響果實大小，對其他組織和器官大小也具有負調控作用。POS2 同樣為細胞膜蛋白，與PhysalisfloridanCKⅡβ1（PfCKⅡβ1）和MADS-box轉錄因子PfAGAMOUS-like（PfAG2）等蛋白發生互作，而PfAG2 能抑制PhysalisfloridancyclinD2；1（PfCyclinD2；1）的表達，對細胞分裂起到調控作用[7]。除了番茄與酸漿屬，fw2.2 同源基因在水稻、玉米、鱷梨、大豆等物種中相繼被分離出[8-11]，且皆具備調控細胞分裂、控制果實大小的作用。酵母雙雜交技術是一種檢測蛋白質互作的技術方法，目前已被應用在多個物種上。雷海英等[12]研究玉米中心蛋白（Zea maysL.centrin，ZmCEN）的生物學功能構建了玉米的酵母雙雜交cDNA文庫，篩出28個和ZmCEN有互作關系的蛋白質。王洋等[13]構建了番茄cDNA 酵母雙雜交文庫，篩選出了6個與Pti4 互作的轉錄因子。鄭巧玲等[14]構建了山葡萄低溫誘導酵母雙雜三框cDNA 文庫，篩選出VaPYL9 與VaCIPK18 有互作關系?！颈狙芯壳腥朦c】前期從梨中分離出梨3個fw2.2 同源基因FWL[15-16]，但其調控梨果實大小機理尚不明確。需研究梨FWL1基因與其互作蛋白作用機理?！緮M解決的關鍵問題】以杜梨、庫爾勒香梨、鴨梨、早美香果實細胞分裂關鍵時期果肉組織為材料，構建梨幼果FWL1 膜系統酵母雙雜交三框cDNA 文庫，篩選出與梨FWL1 互作的蛋白，為梨FWL1基因調節果實大小機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 梨

杜梨、庫爾勒香梨、鴨梨、早美香由新疆庫爾勒市香梨研究中心科研實驗基地采摘。每個品種分別選取一棵樹勢適中、生長狀況良好、管理水平一致的10年生樹，在果肉細胞分裂關鍵時期（授粉后15 d），每個品種分別采摘30個果實，去皮將果肉部分切下后立即置于液氮中，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.1.2 主要試劑

Oligotex mRNA Kits（Qiagen，德國）、DEPC 水（Beyotime，中國）、無水乙醇（國藥，中國）、Normal-RunTMprestained 250 bp-I DNA ladder（上海捷瑞，中國）、NormalRunTMprestained 250 bp-II DNA ladder（上海捷瑞，中國）、Supscript double stand cDNA Kit（invitrogen，美國）、Trimmer-2 cDNA normalization Kit（Evrogen，俄 羅 斯）、μltraPureTM Phenol：Chloroform Isoamyl：Alcohol（25：24：1，v/v）（sigma，美國）、pBT3-SUC（DUALsystemsBioTech，瑞士）、pBT3-STE（DUALsystemsBioTech，瑞士）、真核表達菌株NMY51（DUALsystemsBioTech，瑞士）、YPDA（陜西普因特，中國）、SD/-Leu with Agar（陜西普因特，中國）、SD/-Leu/-Trp with Agar（陜西普因特，中國）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（陜西普因特，中國）、釀酒酵母感受態制備及轉化試劑盒（陜西普因特，中國）、3AT（Sigma，美國）、X-a-gal（Goldbio，美國）、Cycle-Pure Kit（OMEGA，中國）、TransStartFastPfu DNA Polymerase（全式金，中國）、Quick-Cloning MIX（陜西普因特，中國）、TransFastTaq DNA Polymerase（全式金，中國）。

1.1.3主要儀器

臺式高速冷凍離心機（eppendorf，德國）、移液器（eppendorf，德國）、各型號離心管（Axygen，美國）、PCR儀（東勝，中國）、電轉化儀（eppendorf，德國）、精密生化培養箱（上海精宏，中國）、恒溫搖床（上海知楚，中國）、高速冷凍離心機（湖南湘儀，中國）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

將杜梨、庫爾勒香梨、鴨梨、早美香的幼果果肉組織放入帶有液氮的研缽中，充分研磨至粉末狀。選擇Trizol 法對細胞的總RNA 進行提取，將洗脫下的RNA 取5μL 用于瓊脂糖凝膠電泳的檢測，其余放置在-80℃貯存。經NanoDrop 2 000核酸分析儀對總RNA的質量及其濃度鑒定。

1.2.2 mRNA分離

參照Oligotex mRNA Kits 說明書對mRNA 進行分離。

1.2.3 cDNA合成

在預冷的0.5 mL 無菌離心管中加入2μL mRNA 樣品、1μL 的SMART ⅣOligonucleotide 及1μL 的CDS-3M PCR Primer，將其混勻后放入離心機內進行離心，將混合物于管底聚集，之后72℃，2 min，接著置冰上2 min，再次瞬時離心，讓其均聚集于管底，向每一個管中加入2 μL 的5×First-Strand Buffer、1μL 的DDT（20 mM）、1μL 的dNTP Mix（10 mM）、1 μL 的PowerScriptTMReverse Transcriptase，輕輕吹吸使其充分混合，瞬時離心，42℃保育1 h，將離心管擱至在冰上，合成cDNA第一鏈。取一個新的離心管（0.5 mL）預冷，轉入2μL 反轉錄產物，將其擱至冰上，準備進行后續步驟。

采用LD PCR對cDNA擴增，獲得雙鏈cDNA，將PCR 儀預熱至95℃。在0.5 mL 反應管中加入以下試劑。表1

表1 二鏈合成cDNA所需試劑Table 1 Reagents required for two strand cDNA synthesis

輕彈離心管，瞬時離心，將管內物質集中在離心管的底部，滴入2 滴礦物油，覆蓋管內物質，PCR 95℃預熱后擴增，擴增步驟為95℃1 min，95℃10 s，68℃6 min（每過1個循環延伸時間增加5 s），20個循環，68℃5 min，16℃10 min。取5μL的產物進行電泳鑒定。

1.2.4 均一化處理

1.2.4.1 二鏈PCR產物純化

使用QIAquick PCR Purification Kit 對二鏈PCR 產物純化。按照5：1 的體積比例將PBI 溶液加入到PCR反應物內，將體系混合后加入吸附柱的膜上，10 000 r/min，1 min，棄濾液，加入0.75 mL PE Buffer 于膜上，10 000 r/min，離心1 min，取一個新的收集管，加入12μL純化水于膜上。

1.2.4.2 雜交

在0.2 mL 無菌離心管中加入12μL SMARTprepared ds cDNA（1 200 ng of dissolved cDNA）、4μL 4×Hybridization buffer，混勻后瞬時離心，將其平均分為4 份，各滴入2 滴礦物油，13 000 r/min，室溫離心2 min，于98 ℃下溫浴2 min，之后在68 ℃下溫浴5 h。

1.2.4.3 DSN處理

將1/2 倍（1 μL DSN storage buffer 與1 μL DSN混勻）置于冰上，68℃預熱DSN master buffer，在每個PCR 管中加入5 μL 預熱的DSN master buffer，混合至均勻，瞬時離心，之后迅速置于68℃，保溫10 min。在管1（DSN1）中加入1 μL DSN 酶液，管2（DSN1/2）中加入1 μL 1/2DSN 酶液，管4（Control）中加入1 μL DSN storage buffer，管3（DSN1/4）不添加試劑，將其分別置于68℃保溫25 min，加入10μL stop solution于每個管中，充分混合后瞬間離心，68℃下保溫5 min，將PCR 管置于冰上并添入20μL純化水行充分混合。

1.2.4.4 第1次PCR擴增經DSN處理的樣品

對每個樣品，在無菌的PCR 管內加入第1 次擴增的試劑。

將管內混合物混勻后瞬間離心。開始第1次PCR擴增，步驟為95℃1 min，95℃15 s，68℃6 min（每過1個循環延伸時間增加5 s），7個循環，68℃5 min。經對照以判斷PCR的最適循環數，將剩余的樣品擱于冰上保存。表2

表2 PCR擴增所需試劑Table 2 Reagents required for PCR amplification

1.2.4.5 第2次PCR擴增經DSN處理的樣品

加入20μL純化水于1倍酶處理的2μL PCR樣品中，混合均勻后加入第2 次擴增的試劑，混勻，PCR 程序：95℃1 min，12個循環，95℃15s，66℃20s，72℃3min，接著64℃15s，72℃3min，取5μL電泳測定。

1.2.5 PCR產物純化及二鏈回收

用QIAquick PCR Purification Kit 進行純化，加41μL無菌水至膜上溶解，離心，測定濃度。二鏈回收用1×TAE 配置1%瓊脂糖膠，點上Marker，隔一個以上泳道點樣品，70 V 電壓2 h，將Marker切下用含EB的電泳液染色15 ～20 min，用牙簽標上1K、3K 的位置，對照樣品切下1 ～3K 的區域，稱取膠的重量。用QIAquick Gel Purification Kit純化，按照膠100 mg約等于100μL計算。加進3倍體積的QG buffer，至50℃水浴10 min，直到膠全部融解，每2 min 進行顛倒混合均勻1 次，將化開膠液加至柱子，10 000 r/min 離心1 min，棄過濾物，在柱子膜上加750μL PE buffer，10 000 r/min，離心1 min，棄過濾物，12 000 r/min 甩干1 min，在膜上加15μL無菌水，12 000 r/min，1 min，保留濾下液體，確認其濃度。

1.2.6 cDNA與載體的連接

利用同源重組的方法，將3μL酶切后的線性化三框載體pPR3-N（雙雜交）與上步中7 μL 的cDNA混合，取5μLInfusion重組酶、5μL水，將其充分融合后放入50 ℃中1 h，取2μL 蛋白酶K 對重組酶滅活，再加入78μL無菌水，將總體積加至100μL，之后依次加入1μL Glycogen（20μg/μL）、50μL 7.5 M NH4OAC、375μL 100%ethanol，充分混合，將其放在-80℃中至少1 h，在4℃下16 000 r/min 離心30 min，棄上清，加入150 μL70%的乙醇，在4℃下，16 000 r/min，離心3 min。再次重復這個過程，棄上清，保持cDNA沉淀，置室溫下5 ～10 min 晾干cDNA，取10 μLDEPC 水重懸cDNA，用槍對其進行30 ～40 次吹吸，瞬時離心2 s 后對cDNA進行收取，即刻放置于冰上。

1.2.7 電轉化大腸桿菌感受態細胞

在-80℃下放入1 mm 電擊杯（Bio-Rad）進行30 min 的預冷處理，將感受態細胞50μL 及重組產物2.5 μL 在電擊杯放在冰上的前提下一同放入杯內，持續放置45 min，經電轉化儀（Bio-Rad）電擊后，立即加入1 mL LB 培養基，將4次轉化后的菌液轉移至一個新的15 mL 離心管內，并加入培養基至5 mL，于37℃，225 ～250 r/min 培養1 h以上，之后把培養物稀釋10、100、1 000、10 000倍，將不同倍數的稀釋液分別涂10μL于平板上，其余置4℃過夜，也可倒上甘油使濃度至20%，于-80℃保存。

1.2.8 酵母雙雜交文庫質量及滴度檢測

稀釋經過轉化的10μL原液至1 000倍，將其中100μL 涂在LB 平板上（具有氨芐抗性），次日統計算出文庫的庫容量（CFU/mL=平板上的克隆數/100μL×1 000 倍×1×103μL、文庫總CFU=CFU/mL×文庫菌液總體積mL）。擴增挑取的單克隆，用電泳對PCR 產物大小檢測以鑒定插入片段的大小。稀釋原核文庫菌液10μL至106倍，將其中的100μL 涂在LB 平板上（含A+抗性平板），37℃過夜培養，次日統計，文庫滴度CFU/mL=平板上的克隆數/100μL/10μL×106倍×1 000μL。

1.2.9 誘餌載體構建

利用前期克隆的梨果實大小相關基因FWL1（Genebank 收錄號為：KM249876）[15]，根據pBT3-N、pBT3-C、pBT3-SUC、pBT3-STE 四個載體分別設計梨FWL1 基因全長設計引物，并以cDNA 為模板進行擴增，擴增過程為：95℃5 min，95℃30 s、56℃30 s、72℃2 min（該過程30個循環），72 ℃10 min。之后對PCR產物純化回收。對pBT3-N/C/SUC/STE 載體進行酶切，按照線性化載體（pBT3-N/C/SUC/STE）50 ng、對應FWL1 cDNA50 ng、Quick-Cloning MIX2 5μL，補水至10μL 配置反應體系，用DNA 連接酶將PCR 產物與線性化pBT3-N/C/SUC/STE載體連接，55℃，20 min，30℃，30 min，取1.5 mL EP 管置于冰上，轉化至Top10感受態細胞中，再加入2μL 連接產物，用手指輕輕彈EP 管2 次，置于冰上30 min，42℃熱擊90 s，迅速置于冰上5 min，加1 mL LB 液體培養基，37℃，150 r/min，震蕩45 min，6 000 r/min 離心5 min，去上清，留100μL上清液吹打沉淀使之混勻，涂布對應抗性平板，37℃倒置過夜培養后挑取白色單克隆菌落搖菌，菌液PCR，各挑取陽性克隆斑至加有相應抗性5 mL LB 液體培養基的試管中，37℃，220 r/min培養12 h，小提質粒，用對應引物測序。表3

表3 PCR引物Table 3 List of PCR primers

1.2.10 誘餌表達載體自激活及功能測定

參考釀酒酵母感受態制備及轉化試劑盒（貨號PT1183）對NMY51 酵母進行感受態制備。將Carrier DNA 和pTSU2-APP 及pNubG-Fe65 混合，加入NMY51感受態和PEG/LiAc轉化液，制備好后重懸，各取100 μL 分別涂布DDO/X（SD/-Leu/-Trp/X-a-gal）、QDO/X 平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal）平板，倒置于30℃培養箱內培養5d。對宿主（pTSU2-APP和pNubG-Fe65）檢測。

將構建好pBT3-N/C/SUC/STE-FWL1 四個載體分別與pOst1-NubI、pPR3-N 混合，分別加入Carrier DNA（10μg/mL），分成8組，加入NMY51感受態50μL和PEG/LiAc 轉化液500μL，制備好后重懸，1 ～4 組各取100 μL 分別涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）及QDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Xa-Gal）平板，5 ～6 組取100 μL 涂布SD/-Leu 平板，并倒置于30℃培養箱內培養5 d，對其進行功能檢測和自激活檢測。

取1支EP管，加入500μL 0.9%NaCl溶液，從上述轉化NMY51[pBT3-N-FWL1&pPR3-N]平板挑取1 株狀態較好菌落挑入EP 管中，混勻，均稀釋OD值為0.1和0.01，并分別取2μL菌液分別點加在DDO、QDO/10mM3-AT、QDO/20mM3-AT、QDO/30mM3-AT、QDO/40mM3-AT、QDO/50mM3-AT平板上，30℃培養箱內培養3 d，觀察生長狀態。

1.2.11 互作蛋白的篩選

挑取NMY51（pBT3-N-FWL1）單菌落（直徑2 ～3 mm）于YPD Plus 液體培養基培養；用TE/Li-Ac 感受態制備液重懸。在CarrierDNA 加入文庫質粒，加入NMY51 感受態及PEG/LiAc 轉化液進行培養，最后用NaCl 重懸，各取10 μL 轉化液稀釋10 000 倍取100 μL 分別涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）平板上，并倒置于30℃培養箱內培養5 d，統計轉化效率。將剩余轉化液全部涂布于80個QDO/50mM3-AT（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/50mM3-AT）平板上，倒置于30℃培養箱內培養5 d，統計陽性克隆子。將篩選所得陽性克隆子分別轉接于100μL 0.9%NaCl溶液中，測OD600值，通過補加適量0.9%NaCl 溶液使OD600 值為1，各取1μL菌液接種于QDO/50mM3-AT平板上，30℃培養3 ～5 d，對陽性克隆統計。挑單斑接種裝有2 000μLSD/-Leu/-Trp 液體培養基中培養，220 r/min，30℃過夜培養，提取酵母質粒，將PCR 產物送測。

2 結果與分析

2.1 果肉組織總RNA提取

研究表明，28 S 與18 S 條帶明晰，RNA 沒有污染，較為完整?？俁NA 經NanoDrop 2 000 測定后得出RIN≥7，A260/A280為2.01～2.08，其濃度及質量均達到要求。圖1

圖1 梨肉組織總RNA電泳Fig.1 Total RNA from pear fruit tissues separated on agarose gel

2.2 ds cDNA合成與鑒定

研究表明，ds cDNA 片段集中分布于250 ～2 000 bp，呈彌散狀，包含不同大小和豐度差異的mRNA取得有效反轉錄，符合建庫基本要求。圖2

圖2 LD-PCR 電泳Fig.2 LD-PCR amplification products by agarose gel electrophoresis

2.3 均一化ds cDNA鑒定結果

研究表明，經均一化處理過的ds cDNA 無特異性條帶的出現，其覆蓋片段長度范圍與未均一化處理的ds cDNA 一致，且出現亮度較為統一的彌散狀條帶，不同片段的轉錄產物拷貝數已被調節至相似數目。圖3

圖3 均一化ds cDNA電泳Fig.3 Normalized ds cDNA by agarose gel electrophoresis

2.4 文庫的構建及鑒定

研究表明，庫容為3×107CFU，大于1×107CFU，該文庫的庫容量較高。平均插入片段大于1 000 bp，陽性率≥98%，該文庫的重組率和隨機性符合要求。平板上菌落數量大于600個，該文庫滴度為≥6×108CFU/mL，文庫的各類指標符合基本要求。圖4

圖4 均長檢測Fig.4 Average length detection

2.5 誘餌表達載體自激活及功能檢測

2.5.1 宿主檢測

研究表明，無論在DDO/X 或QDO/X 平板上，均能生長出藍色菌落，宿主基因型狀態未發生突變，各報告基因能正常激活。圖5

圖5 宿主驗證Fig.5 Host validation

2.5.2 功能檢測和自激活檢測

研究表明，共轉組pBT3-N-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-N-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生長，在QDO/X 平板上能正常生長且變藍；共 轉 組pBT3-C-FWL1 及pOst1-NubI 和pBT3-C-FWL1 及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生長，在QDO/X 平板上未能生長；共轉組pBT3-SUC-FWL1及pOst1-NubI和pBT3-SUC-FWL1及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生長，在QDO/X 平上未能生長；共轉組pBT3-STE-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-STE-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生長，在QDO/X平板上只有少量菌斑變藍。pBT3-N一個載體可用。圖6

圖6 誘餌表達載體功能和自激活檢測Fig.6 Decoy expression vector function and self-activation detection

2.5.3 3-AT工作濃度檢測

研究表明，NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）在QDO/50mM3-AT 平板上生長受到抑制。圖7

圖7 NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）生長情況Fig.7 Growth of NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）

2.6 文庫篩選

研究表明，每次篩選菌斑數＞1 000，轉化率≥1.0×106CFU，共轉效率達到篩庫要求。圖8

圖8 篩庫轉化效率Fig.8 Screen storage conversion efficiency

2.7 酵母陽性克隆DNA提取和測序比對

研究表明，與梨FWL1 篩選互作蛋白長出了300個以上菌斑，在陽性克隆子轉接測序中，共計長出274個陽性克隆，共計272個陽性克隆測序成功，在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對。有13個未知蛋白，6個蛋白出現頻率在10次以上，其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的預測功能顯示與細胞分裂有關。表4

表4 出現10次以上的梨FWL1互作蛋白及其功能預測Table 4 FWL1 interacting proteins of pear with more than 10 occurrences and their functional prediction

3 討論

酵母雙雜交技術多用來研究蛋白互作及蛋白質的結構與功能[17]，也是迄今為止研究蛋白質互作中最常用的生物技術之一[18]。傳統酵母雙雜交系統適用于定位在細胞核內的互作蛋白。試驗研究的FWL1 基因定位于細胞膜，不能直接行使功能，而DUAL membrane 技術在原有酵母雙雜交系統的基礎上，利用分離的泛素系統（splitubiquitin）進行蛋白質相互作用的篩選，為膜蛋白互作研究提供了可能[19]。酵母雙雜交三框cDNA文庫通過在普通單獨文庫上逐個增添了一個堿基于上游引物上，使得其讀碼框后移一到兩位，用可能的3種讀碼框來表達克隆的cDNA，能夠更好的捕捉生物體內真實的讀碼方式，確保篩選出所有可以正確表達的插入片段，提升了文庫表達效率[20]。由于DSN 要求cDNA 片段長度和未經均一化處理的覆蓋范圍必須一致，能在不損壞大片段cDNA 的前提下，有效去除高豐度的cDNA[21]，增加文庫內cDNA均一化程度。實驗利用同源重組的手段連接了合成的cDNA及通過酶切處理后的pPR3-N 載體?；蚪MDNA 多個序列與線性化DNA兩端具備同源性，這將大大提升后續重組連接的精確性。這種方法結合了其它連接方法的優點，降低了操作難度，提升了連接的效率，提升文庫的質量[22]。

判斷cDNA文庫質量的重要指標是文庫的庫容和重組cDNA 序列的完整性[23]。文庫當中的獨立重組子克隆數就是該文庫的庫容量，獨立重組子克隆數的數量代表了該文庫的覆蓋度。cDNA文庫最少應當含有1×106CFU 的庫容量[24]，經檢測，研究所構建的梨幼果膜系統酵母雙雜交三框cDNA 文庫的庫容量為3×107CFU，大于1×106CFU。構建的炭疽菌侵染后刺葡萄果皮酵母雙雜交cDNA文庫、陸地棉酵母雙雜交cDNA文庫以及小麥酵母雙雜交cDNA 文庫的庫容量均大于1×106CFU[25-27]。研究所構建的梨幼果膜系統酵母雙雜交三框cDNA文庫符合建庫的基本要求。重組cDNA序列完整性由重組率與插入片段的長度共同組成[21]。構建的草莓果實酵母雙雜交文庫、劍麻酵母雙雜交cDNA 表達文庫以及Cf-19 介導的抗番茄葉霉病免疫應答酵母雙雜交cDNA文庫的平均插入片段長度均大于500 bp，且陽性重組率為92%以上[28-30]。研究構建的cDNA文庫經檢測，

平均插入片段大于1 000 bp，陽性重組率≥98%。文庫指標合格，符合后續篩庫的基本要求。

篩選的272個互作的候選蛋白中，collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的預測功能可能與梨果實細胞分裂有關。collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 為膠原蛋白和含鈣結合EGF域的蛋白，EGF為表皮生長因子（epidermal growth factor EGF）[31-32]，EGF 可以促進細胞的增殖分化[33-34]，龐實鋒等[35]將大豆油體和EGF 融合基因成功轉化進紅花細胞的基因組中，并證實表達的EGF 對一些細胞具有促細胞增殖活 性。 metallothionein- like protein type 2 和metallothionein-like protein（Met1）為金屬硫蛋白（metallothionein，MT），其功能為螯合重金屬離子及重金屬解毒，參與必須微量元素的儲存、運輸和代謝，參與激素和發育過程的調節等[36]。Yuan等[37-38]研究發現水稻OsMT2b 參與了植物體內細胞分裂素的調控，MT 可能在細胞的修復、生長和分化過程中起著金屬調節劑的作用[39]。梨FWL1可能與上述兩個蛋白互作后調節梨果實大小。

4 結論

利用DUAL membrane 系統構建梨幼果膜系統酵母雙雜交三框cDNA 文庫，文庫的庫容量為3×107CFU，平均插入片段大于1 000 bp，陽性率≥98%，均達到cDNA 文庫的建庫標準，符合后續篩庫的基本要求。誘餌載體無自激活功能，利用共轉化方法，篩選出272個與FWL1互作的蛋白質，其中collagen and calcium-binding EGF domaincontaining protein 1 和metallothionein-like protein可能與梨果實大小發育有關。