肉蓯蓉浸膏制備中溫度對苯乙醇苷類成分的影響及其抗氧化活性分析

韓海霞，游 林，鐘志明，何夢夢，王 娜，李 爽

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.和田帝辰醫藥生物科技有限公司，新疆和田 848000）

0 引言

【研究意義】肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma）或管花肉蓯蓉（C.tubulosaWight）的干燥帶鱗葉肉質莖，我國主要分布于內蒙古、新疆塔里木盆地，俗稱大蕓，其味甘、咸、性溫[1-2]。其主要有效成分為苯乙醇苷類、多糖、總黃酮等[3-4]。肉蓯蓉浸膏制備過程要經歷原材料干燥、提取、濃縮、浸膏蒸制等環節，研究肉蓯蓉浸膏制備過程的原材料干燥溫度、提取溫度、濃縮濃縮、浸膏蒸制溫度，對苯乙醇苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的影響，對提高肉蓯蓉產品中有效成分含量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】苯乙醇苷是以β-葡萄糖為基本母核，與α-羥基苯乙基連接形成糖苷鍵或與苯丙烯酸連接形成酯鍵的一類化合物。有很多養生健體的中藥類食材，多數歸因于其中的苯乙醇苷[5]。苯乙醇苷類化合物如松果菊苷、毛蕊花糖苷也是肉蓯蓉中最主要的活性成分，也是肉蓯蓉中研究報道最多的一類化合物，目前已被證實是肉蓯蓉藥用作用的物質基礎[6-7]。在酸、堿、熱、光、金屬離子、生物酶等影響因素存在時，分子結構會發生降解或異構化，而失效。肉蓯蓉所含的苯乙醇苷類成分易于被其植物體內所含的生物酶水解，而降低其含量[8]，有研究報道了肉蓯蓉切片或加工過程的條件優化，盡可能地保護苯乙醇苷[9]?！颈狙芯壳腥朦c】目前的研究多集中于干燥溫度、提取溫度對肉蓯蓉有效成分提取率的影響，幾乎沒有肉蓯蓉提取液濃縮溫度、濃縮液蒸制浸膏的溫度對其中苯乙醇苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的量的研究文獻，且對干燥溫度、提取溫度說法不一。需研究肉蓯蓉制備過程中，不同溫度對苯乙醇苷成分的影響及其抗氧化活性分析?！緮M解決的關鍵問題】以苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量為測定指標，研究肉蓯蓉浸膏制備過程中原材料干燥、提取、濃縮、浸膏蒸制溫度對其含量的影響，分析各生產環節適宜的溫度，為肉蓯蓉生產加工過程中溫度的監測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

管花肉蓯蓉采自新疆和田地區洛浦縣，由和田帝辰藥業有限責任公司提供；松果菊苷對照品（批號：82854-37-3）、毛蕊花糖苷對照品（批號：61276-17-3），成都麥德生科技有限公司；甲醇（色譜醇，天津市津東天正精細化學試劑廠）

Agilent-1260 液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上?；|試驗儀器設備有限公司；AL204-IC電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；T6新世紀紫外分可見光光度計，海門市其林貝爾儀器制造有限公司

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

取適量松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品，分別置于10mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.0 mg/mL的標準溶液。

1.2.2 苯乙醇苷標準曲線的繪制

參照文獻并對其稍作修改[10]：精密吸取松果菊苷標準溶液，用50%甲醇配成0.004、0.008、0.012、0.016、0.02 mg/mL的系列對照品溶液，依照紫外-可見分光光度法，分別在330 nm 波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制苯乙醇苷標準曲線。

1.2.3 松果菊苷和毛蕊花糖苷標準曲線的繪制

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：TC-C18 柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相：甲醇-水溶液（35∶65，v∶v）等度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長334 nm，進樣量為10μL，柱溫30℃。

1.2.3.2 繪制標準曲線

精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷標準溶液，配制成濃度為10、20、40、80、160、320μg/mL 混合對照品溶液，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制松果菊苷和毛蕊花糖苷標準曲線。

1.2.4 不同條件下苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的測定

1.2.4.1 肉蓯蓉不同干燥溫度

肉蓯蓉切片，分別在曬干、陰干、40、60、80、100℃下于電熱恒溫鼓風干燥箱干燥5 h，粉粹備用。稱取肉蓯蓉粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入10 mL 50%乙醇（料液比為1∶10），60℃水浴，回流提取40 min，抽濾，濾渣重復回流提取3 次，合并3次濾液，用50%乙醇定容至50 mL，從中移取二份提取液各200μL，1份置于20 mL 容量瓶，以50%乙醇定容至刻度，搖勻，測定肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.4.2 不同提取溫度

稱取肉蓯蓉粉末5 份，分別在常溫、40、60、70、80℃下，測定肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.4.3 不同濃縮溫度

取肉蓯蓉粉末3.0 g，在80℃下按“1.2.4.1”方法提取，將提取液定容至150 mL，分成5 份，每份30 mL，分別在35、40、50、60 和70℃下濃縮至相同體積，測定各濃縮液中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷濃度。

1.2.4.4 浸膏的不同蒸制溫度

精密量取等量肉蓯蓉濃縮液5份，分別在40、55、70、85、98℃水浴溫度下，蒸制得到等量浸膏，測定各浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。

1.2.5 肉蓯蓉浸膏體外抗氧化實驗

1.2.5.1 肉蓯蓉供試液制備

取肉蓯蓉浸膏和VC適量，以水為溶劑，分別將其制備成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉蓯蓉供試品溶液和VC對照溶液。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力測定

參考段景峰[11]方法，取肉蓯蓉提取液2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混勻，室溫下靜置30 min，于517 nm處測吸光度，以VC溶液為陽性對照藥，同法測其吸光度。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+DPPH乙醇溶液；

A2：樣品肉蓯蓉提取液液+無水乙醇；

A0：DPPH+75%乙醇溶液。

1.2.5.3 ABTS自由基清除能力測定參考段景峰[11]方法，取肉蓯蓉提取液0.8 mL，與3.2 mL ABTS溶液混勻，避光、室溫條件下靜置6 min 后，于734 nm 處測混合溶液的吸光度，以VC 溶液作為陽性對照，同法測其吸光度，按公式（2）計算ABTS自由基清除率。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+ABTS溶液混合液；A2：肉蓯蓉提取液+蒸餾水；

A0：蒸餾水+ABTS溶液混合液。

1.2.5.4 羥基自由基清除能力測定參考段景峰[11]的方法，取肉蓯蓉提取液1 mL與雙氧水混合，再將1mL 9 mmol/L 水楊酸鈉和1 mL 1.5 mmol/L 硫酸亞鐵分別加入其中，混勻，37℃下振蕩反應30 min，于按照紫外-可見光分光光度法，在510 nm處測定吸光度。

式中，A1：肉蓯蓉提取液+硫酸亞鐵+雙氧水；

A2：肉蓯蓉提取液+硫酸亞鐵+蒸餾水；

A0：蒸餾水+硫酸亞鐵+雙氧水。

1.2.5.5 還原能力測定

參考段景峰[11]方法，試管中依次加入肉蓯蓉提取液和1%鐵氰化鉀溶液各1 mL，用PBS 溶液（pH6.6）補足至4mL，混勻，50℃水浴20 min，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，離心（3 000 r/min，10 min），取2 mL 上清液，加入0.4 mL1%六水合氯化鐵，再加2 mL 蒸餾水補足至6mL，混勻，反應10 min，于700 nm處測定吸光度。

1.3 數據處理

各項評價指標的測定結果均采用均數、標準差描述，應用采用SPSS-20.0 軟件用于數據統計分析，采用Origin-2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對肉蓯蓉浸膏制備過程中有效成分的影響

2.1.1 松果菊苷和毛蕊花糖苷色譜

研究表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品的保留時間分別為5.378和10.675 min，肉蓯蓉供試液中松果菊苷和毛蕊花糖苷的保留時間分別為5.353 和10.607 min。在該色譜條件下，松果菊苷和毛蕊花糖苷均能達到穩定基線分離，且峰形良好，適用于供試液中松果菊苷和毛蕊花糖苷的檢測。圖1

圖1 松果菊苷和毛蕊花糖苷HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatogram of echinacoside and verbascoside.

2.1.2 苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷標準曲線

研究表明，苯乙醇苷回歸方程為：Y=24.608X+0.0396，R2=0.999 3，其在0.004-0.02 mg/mL范圍內線性關系良好；松果菊苷和毛蕊花糖苷的回歸方程分別為Y=44.505X+221.1，R2=0.999、Y=19.483X-9.383 1，R2=0.999 2，在10 ～320 μg/mL二者線性關系良好。

2.1.3 不同干燥溫度對肉蓯蓉有效成分的影響

研究表明，曬干、陰干、烘箱40℃恒溫干燥5h，測得苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷量較低，當60℃烘干肉蓯蓉，測得苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷量最高，干燥溫度為80℃，100℃時，有效成分測得量降低，肉蓯蓉干燥溫度選擇60℃烘箱干燥。圖2

圖2 不同干燥溫度下肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Fig.2 Effects of different drying temperatures on the content of phenylethanoid glycosides,echinacoside and verbascoside（n=3，m=x±SD）

2.1.4 不同提取溫度對肉蓯蓉有效成分的影響

研究表明，提取溫度升高，苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量也逐漸增加，提取溫度為80℃時，3種成分含量最高，肉蓯蓉提取溫度選擇80℃下，用50%乙醇回流提取。圖3

圖3 不同提取溫度下肉蓯蓉中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Fig.3 Effects of different extraction temperatures on the content of phenylethanoid glycosides,echinacoside and verbascoside（n=3，m=x±SD）

2.1.5 不同濃縮溫度對肉蓯蓉濃縮液中有效成分的影響

研究表明，濃縮溫度35℃時，30 mL肉蓯蓉提取液濃縮至15 mL 需要7 h，當濃縮溫度升高，提取液濃縮至相同體積所需時間明顯縮短；濃縮溫度為60℃時，肉蓯蓉提取液濃縮至等體積時僅需0.7 h，且有效成分在濃縮液中的濃度也最高。肉蓯蓉提取液濃縮溫度選擇60℃。表1

表1 不同濃縮溫度下肉蓯蓉濃縮液中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷濃度變化（n=3，m=x±SD）Table 1 Effects of different concentrated temperatures on the content of phenylethanoid glycosides，echinacoside and verbascoside.（n=3，m=x±SD）

2.1.6 不同蒸制溫度對肉蓯蓉浸膏中有效成分的影響

研究表明，蒸制溫度40℃時，肉蓯蓉濃縮液蒸至浸膏為0.4 g 時，蒸制時間需要12 h，當蒸制溫度升高，所需蒸制時間明顯縮短，濃縮溫度85℃時，肉蓯蓉濃縮液蒸至相同量的浸膏僅需1.2 h，明顯提高效率，且有效成分在浸膏中的含量也最高。肉蓯蓉濃縮液蒸制浸膏溫度選擇85℃。表2

表2 不同蒸制溫度下肉蓯蓉浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量變化（n=3，m=x±SD）Table 2 Effects of different steaming temperature on the content of phenylethanoid glycosides，echinacoside and verbascoside.（n=3，m=x±SD）

2.2 肉蓯蓉浸膏體外抗氧化實驗

2.2.1 對DPPH自由基的清除能力

研究表明，當濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對DPPH 自由基率呈持續上升，當濃度為0.5 mg/mL 時清除率達到最高，為95%。與相同濃度范圍的VC清除DPPH自由基能力相當，肉蓯蓉浸膏對DPPH清除率的IC50為0.017 mg/mL，VC為0.018 mg/mL。經過對肉蓯蓉浸膏制備過程中各環節溫度進行控制，不僅可提高苯乙醇苷類成分的含量，而且使其對DPPH 自由基的清除能力增強。圖4

圖4 不同濃度肉蓯蓉浸膏下DPPH自由基清除率變化Fig.4 Scavenging rate of DPPH radical by C.deserticola extractum

2.2.2 對ABTS自由基的清除能力

研究表明，當濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對ABTS 自由基清除率呈持續上升，當濃度為0.5 mg/mL 時清除率達到最高，為92%。肉蓯蓉浸膏對ABTS 清除率的IC50為0.023 mg/mL，VC為0.003 mg/mL。圖5。

圖5 不同濃度肉蓯蓉浸膏下ABTS自由基的清除率變化Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radicals by C.deserticola extractum

2.2.3 對羥基自由基的清除能力

研究表明，當濃度在0.1 ～0.5 mg/mL，肉蓯蓉浸膏溶液對羥基自由基清除能力逐漸上升，在0.1 ～0.3 mg/mL 呈明顯的劑量依賴性，當0.5 mg/mL 時，清除率達到最高72%，其IC50為0.248 mg/mL，VC為0.14 mg/mL。圖6

圖6 不同濃度肉蓯蓉浸膏下羥基自由基的清除率變化Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radical by C.deserticola extractum

2.2.4 肉蓯蓉浸膏還原能力測定

研究表明，在0.1 ～0.5 mg/mL，隨著濃度的增加，肉蓯蓉浸膏還原能力隨之增強，表現出良好的量-效關系，當濃度為0.5 mg/mL 時其總還原能力達到最高，但略低于VC還原力。圖7

圖7 不同濃度肉蓯蓉浸膏下肉蓯蓉還原能力變化Fig.7 Extractum reduction capacity of C.deserticola

3 討論

肉蓯蓉含水量、含糖量高，采用自然干燥，所需時間長達3 ～4個月，致使苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷等有效成分在干燥過程中被酶降解，影響肉蓯蓉的品質和藥用價值[12-18]。目前的研究報道中，肉蓯蓉采后干燥的方式有微波干燥[19]、冷凍干燥[20]、90～100℃烘干或日光曝曬快速干燥[9]、自然晾干和40℃烘干[21]、60 ～80℃烘干[8]，研究發現，烘干60℃時，苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量最高。對于肉蓯蓉采后干燥方式的不同結論，可能是由于肉蓯蓉產地、采收期、自然氣候等因素的不同有關。

在80 ～90℃提取肉蓯蓉時浸膏得率、松果菊苷及毛蕊花糖苷含量均較高[10，22-23]，研究表明，對產自新疆和田的管花肉蓯蓉在80℃浸提，其中苯乙醇苷、松果菊苷及毛蕊花糖苷得率最高。劉洋等[24]采用響應面法進行單因素篩選結果顯示，最佳提取溫度為48℃，是否與肉蓯蓉產地的不同造成次生代謝產物的積累量差異有關，原因有待進一步研究。

實驗室通常采用水浴98℃將植物提取液蒸制成浸膏，用于活性成分的分離鑒定、藥效研究等[25]，但是高溫蒸制是否造成苯乙醇苷類的損失目前無相關研究。將提取液濃縮后，再經冷凍干燥、或真空干燥技術制得固體粉末[9，26]，但是，這些現代干燥技術耗時、耗能、且需要特定的干燥儀器，價格高，導致生產成本增加。研究采用水浴蒸制肉蓯蓉浸膏發現，85℃水浴蒸制肉蓯蓉浸膏，與98℃水浴蒸制相比，耗時短、且盡可能降低了浸膏中苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的損失。

經過篩選干燥溫度、提取溫度、濃縮溫度、浸膏蒸制溫度后制得的肉蓯蓉浸膏，其抗氧化活性與文獻報道結果相比，DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羥基自由基清除能力更高，優選適宜的制備條件，所得的肉蓯蓉浸膏也具有更好的抗氧化活性。

4 結論

肉蓯蓉在干燥、提取、濃縮、水浴蒸制浸膏過程中，不同溫度對苯乙醇苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷有較大影響，肉蓯蓉干燥溫度為60℃，提取溫度為80℃，濃縮溫度為60℃，蒸制浸膏溫度為85℃時為宜。肉蓯蓉浸膏對DPPH 自由基、ABTS自由基、羥基自由基都具有清除能力，對鐵離子具有較強的還原能力，肉蓯蓉浸膏具有較強的抗氧化活性。