線粒體功能障礙與慢性腎衰竭腎間質纖維化的關系

王艷文,李小會,陳麗名,屈 杰

(1. 陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000；2. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)是各種慢性腎臟疾病(CKD)持續進展至后期的共同結局,疾病發展過程中可見腎臟病理形態及功能的損害。腎間質纖維化是CRF發生、發展過程中的主要病理改變,是疾病進展至終末期腎臟病(ESRD)的共同通路,其進展情況直接影響CRF病情程度。CKD消耗能量多,隨病情漸進性發展，腎單位不斷遭到破壞,腎臟固有細胞(PTC)凋亡增多,需要足夠的三磷酸腺苷(ATP)來維持機體正常的運轉。線粒體是細胞合成ATP的場所,當其功能出現障礙時，ATP合成不足,同時生成過量的氧自由基,釋放大量炎癥因子,這些均會伴隨CRF的發病過程,并促使CRF進展至ESRD。研究發現，線粒體功能障礙能夠介導腎小管上皮細胞的上皮間充質轉化(EMT)[1]；保護線粒體功能可以有效緩解5/6腎切除模型中的腎間質纖維化[2]。此外，模式識別受體家族成員NLRP3的表達下調可減輕線粒體功能障礙并進一步緩解CRF腎臟纖維化[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)能夠介導多種細胞線粒體生物合成及氧化磷酸化過程,其激動劑能減輕腎間質纖維化和炎癥反應。以上均說明線粒體功能障礙可能與腎間質纖維化關系密切。目前,CRF的治療主要是減少危害腎功能的相關因素，保護殘存腎單位，延緩病情進展，但臨床預后欠佳，隨著CRF患病人數的增加，急需尋找可靠的治療新靶點對CRF進行有效防控。因此,本文就線粒體功能障礙與CRF腎間質纖維化的關系進行綜述,以期找到新的干預靶點，以抗纖維化并延緩CRF的進展,提高臨床治療效果。

1 線粒體及其功能概述

線粒體是真核細胞胞漿中由雙層磷脂膜包被的細胞器，是細胞進行氧化磷酸化、合成ATP的主要場所。線粒體膜與膜間腔內含有大量參與細胞代謝的酶以及少量線粒體DNA，其產生ATP主要是依靠內膜上的多亞基復合體即電子傳遞鏈來完成。線粒體合成ATP的途徑主要是依靠脂肪酸、葡萄糖和氨基酸的代謝產物,經三羧酸循環和氧化磷酸化過程,產生足夠的能量以滿足機體各組織器官的需求；除了產生能量,線粒體還可以控制Ca2+的儲存和釋放以維持細胞內Ca2+濃度的動態平衡,并在活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和清除、誘導炎癥反應、參與細胞生長及細胞基質代謝、調控細胞凋亡、啟動信號轉導通路等方面發揮重要作用[4-5]。ROS是線粒體氧化磷酸化過程中的副產物,能夠參與信號轉導、調節代謝等過程，并與線粒體功能障礙的發生密切相關。

線粒體是真核細胞中的能量工廠,是機體能量代謝的中心，并參與多種病理生理反應。CRF發展過程中持續受到水、電解質代謝紊亂和酸堿平衡失調等因素的影響,而線粒體又極敏感,其結構和功能受體液環境的刺激最易出現失常。當細胞被損傷所刺激時,線粒體膜流動性減慢,膜電位變低,繼而線粒體產能發生障礙,ATP合成減少,出現各器官能量供應匱乏。體內90%的ROS來源于線粒體,氧化磷酸化時會改變電子傳遞方向,電子被傳遞給ROS產物，增加了氧化應激，而線粒體又是最易因氧化應激受損的靶細胞器。線粒體一旦因各種病理因素發生功能障礙，大量產生的ROS反過來會攻擊線粒體而使其損傷加劇。ROS也是線粒體DNA(mtDNA)受損的主要原因，ROS會對mtDNA產生氧化損傷,mtDNA缺乏組蛋白的保護,又無損傷修復系統,氧化損傷后無法修復。ROS還會損害線粒體的酶類、脂類和核酸,致使ROS生成更多,進一步使線粒體膜通透性轉變孔的開關改變,造成細胞凋亡和壞死,說明體內線粒體源性ROS增多是線粒體發生功能障礙的主要表現之一?？傊?，線粒體出現功能障礙后會降低呼吸鏈酶活性,降低線粒體膜電位,使ATP合成不足；線粒體DNA復制數量減少以及促凋亡因子細胞色素C從線粒體到細胞質內的釋放,細胞內鈣穩態失衡,線粒體通透性發生轉變及脂肪酸氧化受阻而蓄積在細胞內,增加氧化應激；mtDNA氧化損傷又減少了線粒體生物合成,線粒體功能障礙進而加劇,最終出現細胞凋亡或死亡。

2 腎間質纖維化

在CKD進展過程中，纖維化是導致腎功能進行性喪失的關鍵因素之一。腎間質纖維化主要表現為腎小管萎縮、炎癥細胞的浸潤、增生的成纖維細胞、細胞外基質(ECM)的沉積、瘢痕組織替代正常腎臟組織[6]。研究表明,腎間質纖維化的發生是多種致病因素持續作用的結果，如細胞會出現損傷及活化，產生促炎因子及致纖維化因子，促使纖維化形成，進一步導致腎臟結構改變及功能的衰退,并可見到聚集的小管基底膜成分和間質細胞外基質以及大量繁殖的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性肌成纖維細胞[7]。肌成纖維細胞是由腎小管上皮細胞經過EMT所產生,繼而間質區ECM大量產生和沉積,破壞了正常腎組織的細胞外基質穩態平衡,促使上皮細胞發生凋亡、腎小管萎縮,最終形成瘢痕組織及導致纖維化的發生[6]。

2.1EMT與腎間質纖維化 腎間質纖維化發病機制復雜,受多種因素影響。EMT是腎間質纖維化發病機制的核心環節，是活化的肌成纖維細胞的關鍵來源之一[8]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮細胞的特異性標志物，主要負責細胞之間的黏附。上皮細胞向間充質細胞轉化的第一步也是關鍵步驟，即E-鈣黏蛋白的下調,導致上皮細胞不能與其他細胞正常黏附,繼而α-SMA表達和肌動蛋白重組、基底膜遭到破壞,最后為能順利進行轉變,新的間充質細胞會激活α-SMA、膠原蛋白、波形蛋白和成纖維細胞特異性蛋白1的表達[9]。結締組織生長因子(CTGF)是一種促纖維化因子,能夠與表皮生長因子受體(EGFR)結合,進而參與成纖維細胞細胞外基質的合成，并誘發腎小管上皮細胞的EMT,推動腎間質纖維化進展[10-11]。腎小管EMT在腎間質纖維化發病機制中占據重要作用，其能夠誘導肌成纖維細胞的分化，促進炎癥信號轉導;EMT由多種細胞因子及信號轉導通路共同調控，其發生主要責于調控失衡導致ECM合成和降解失調進一步過度積聚所致[12]。

2.2轉化生長因子-β1與腎間質纖維化 轉化生長因子-β1(TGF-β1)是致纖維化因子中最關鍵的細胞因子,可誘導腎小管上皮細胞發生EMT,加快腎間質纖維化的進展[8]。TGF-β1是強效的誘導劑,在間充質基因表達過程中發揮重要作用，能夠促使腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化,進而增加間充質細胞標志蛋白α-SMA的表達，減少上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達[13]。TGF-β1會使ECM合成和降解失衡，通過加快ECM受體-整合素的合成,使細胞基質間的相互作用增強,抑制基質金屬蛋白酶表達而促進其抑制劑表達，減少ECM的降解[12]；還能通過Smad蛋白、蛋白激酶B等信號通路增加ECM的生成,促進EMT的發生。此外,TGF-β1還能調節小管上皮細胞、內皮細胞的凋亡,使血小板衍生生長因子、血管緊張素Ⅱ的表達上調,誘導成纖維細胞轉化為肌成纖維,進而發生上皮細胞轉分化,加快腎間質纖維化的進展[6]。

2.3NLRP3炎癥小體與腎間質纖維化 CRF進展過程中,腎臟的排泄、內分泌及代謝等功能發生紊亂，加之體內毒素的蓄積，均會引起炎性細胞因子的聚集。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體可被多種刺激原激活,引起促炎癥因子的釋放增多,加重腎組織的炎癥反應,進一步促進CRF的進展。NLRP3蛋白被激活后發生寡聚化，并與銜接蛋白凋亡相關的斑點樣蛋白共同形成炎癥小體,誘導白細胞介素(IL)-1β、IL-18前體轉化為具有活性的IL-1β、IL-18,促使纖維化的發生[14-15]。近年來,眾多體內外研究證明，腎臟炎癥發生發展的細胞學機制之一是由NLRP3炎癥小體活化所介導,阻斷其活化可明顯緩解模型動物腎臟炎癥及損傷。Vilaysane等[16]發現,單側輸尿管梗阻的小鼠模型中,NLRP3炎癥小體活化后會使腎臟纖維化加重；而在晶體型腎損傷模型中,經NLRP3炎癥小體特異性抑制劑CP-456干預后，腎臟的炎癥反應及纖維化程度明顯減輕[17]。Chi等[18]發現IL-36敲除通過抑制NLRP3炎癥小體活化從而減輕單側輸尿管梗阻引起的腎臟炎癥和纖維化。Foresto-Neto等[19]發現別嘌醇可改善5/6腎切除大鼠體內尿酸水平,抑制NLRP3炎癥小體活化,使大鼠腎小管間質纖維化得到明顯緩解。Wang等[20]發現,NLRP3炎癥小體能激活TGF-β通路,使下游Smad相關蛋白的表達增加,進一步導致腎臟纖維化加重；而TGF-β又能介導Smad3途徑活化NLRP3炎癥小體,其中Smad2和Smad3磷酸化的必要條件即NLRP3和ASC的活化。Tanino等[21]發現,CKD小鼠的腎小管上皮細胞中IL-18表達明顯升高,給予IL-18抗體處理后，UUO小鼠腎臟損傷及纖維化程度得到緩解,表明NLRP3炎癥小體下游的炎癥因子(IL-1β、IL-18等)在腎小管間質炎癥的發生發展中起到重要作用。

2.4PPARγ與腎間質纖維化 PPARγ是核細胞受體家族的三個亞型(α、β、γ)之一，其主要在腎臟中發揮作用。PPARγ能調節腎臟的發育及脂質代謝,調控水鈉的重吸收及腎血流量，并能使腎素-血管緊張素系統激活[22]；還具有調節抗氧化酶、抗氧化應激、抗細胞增殖、炎癥反應和組織纖維化等作用；其激動劑能保護腎臟,減輕腎臟細胞的損傷,緩解腎臟炎癥反應和纖維化[23]。Lu等[24]發現，PPARγ的激活在改善RIF的發展和治療CKD方面具有潛在的價值。已有研究表明,高糖刺激后,能夠明顯下調PPARγ在腎小管上皮細胞中的表達,降低E-cadherin表達,而增加α-SMA和膠原蛋白-Ⅲ表達,誘使PTC發生EMT,引起細胞增殖和細胞外基質的產生[25]。PPARγ激動后能有效減輕單側輸尿管結扎(UUO)模型中的RIF程度，表明PPARγ激動劑能減輕RIF和炎癥反應[26]。Panchapakesan等[27]發現，PPARγ激動劑能限制近端小管的促炎癥反應，早期應用能限制糖尿病腎病的發展。GW9662是一種PPARγ阻斷劑,能夠顯著上調體外培養的多囊腎細胞中的TGF-β1,并誘導膠原和纖連蛋白積聚。此外,GW9662顯著增加UUO小鼠腎組織中TGF-β1的表達, 從而顯著加重腎間質損傷和纖維化[28]。

3 線粒體功能障礙與腎間質纖維化

3.1線粒體功能障礙與EMT 眾多研究表明,線粒體功能障礙是腎小管上皮細胞損傷的主要特征,在腎臟損傷持續進展過程中發揮重要作用[29-30]。并有研究顯示，阻斷線粒體功能障礙后,能夠緩解被醛固酮刺激所導致的足細胞損傷及蛋白尿的產生，同樣，在梗阻性腎病發病過程中,腎臟纖維化及炎癥反應也得到有效減輕[31]。腎小管EMT即小管上皮細胞失去表型后,進一步轉化為成纖維細胞,腎臟纖維化發生過程中,約有36%的成纖維細胞是由局部EMT轉化而來,表明EMT在腎間質纖維化進展中發揮重要作用。研究發現，應用醛固酮處理近端小管上皮細胞后,細胞內線粒體ROS產生增多，EMT發生增加,給予魚藤酮(線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ抑制劑)干預后,EMT進展和ROS生成均得到改善，說明線粒體功能障礙能夠影響腎間質纖維化進程[32]。Yuan等[33]研究發現,醛固酮能抑制線粒體功能調節因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-α(PGC-1α)的表達,引發線粒體出現功能障礙，如膜電位降低、mtDNA破壞等,進而誘導EMT的發生,應用鹽皮質激素受體阻滯劑處理后，線粒體功能障礙得到減輕。張佳欣等[34]研究發現,線粒體生物合成在TGF-β1誘導EMT發生的過程中也受到抑制,造成ATP產生減少，不能滿足細胞能量需求,這或許會促進EMT的發生。EMT發生過程中,TGF-β1的干預引發了線粒體生物合成及功能障礙,促使ROS產生增多,說明線粒體在EMT發生中發揮關鍵的調節作用,具體可能與線粒體ROS有關。

3.2線粒體功能障礙與TGF-β1TGF-β1在CKD發生、發展過程中也發揮關鍵作用,能夠通過多種途徑干預CKD的進展,并與線粒體功能障礙及腎間質纖維化密切相關，主要表現為四個方面:①誘導近端腎小管上皮細胞內的線粒體發生裂解,引起小管上皮細胞凋亡；②促進腎小管EMT的發生,引發腎間質纖維化；③誘使細胞外基質異常堆積,腎小球基底膜厚度增加,腎間質纖維化程度加重；④誘導細胞內線粒體生成ROS增多,Smad3的表達受到刺激,纖維化相關因子的基因表達增加,推動腎臟纖維化進程[35-36]。TGF-β1能夠促使人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)發生EMT,線粒體ROS在TGF-β1誘導EMT的信號通路中起到作用。線粒體ROS介導了醛固酮誘導的HK-2細胞發生EMT,由于mtDNA與相關蛋白會被電子傳遞鏈過程中產生的氧自由基破壞,加之脂質過氧化以及線粒體滲透性轉換孔的打開,引發線粒體功能障礙,推動EMT的發生。HK-2細胞發生EMT后，線粒體融合蛋白2(Mfn2)表達也受到影響,說明Mfn2及線粒體功能與腎間質纖維化的發展相關[8]。MnTBAP具有抗自由基氧化損傷作用,能夠改善線粒體功能[37]。Yu等[38]應用MnTBAP預處理阻斷TGF-β1誘導的腎臟固有細胞EMT和線粒體功能障礙，發現MnTBAP預處理能夠減輕PTC線粒體功能障礙相關指標的變化，如ROS、線粒體膜電位、mtDNA,并改善TGF-β1誘導的E-cadherin表達減少、α-SMA表達增加，提示阻斷線粒體功能障礙能夠緩解TGF-β1所誘導的PTC損傷。又進一步對5/6腎切除小鼠應用抗氧化劑MnTBAP腹腔注射,研究阻斷線粒體功能障礙對CRF小鼠腎間質纖維化的影響，發現MnTBAP能夠抑制CRF小鼠腎臟纖維化,減少尿蛋白。以上結果提示線粒體功能障礙參與了5/6腎切除誘導的小鼠CRF腎間質纖維化以及TGF-β1所誘導的腎臟固有細胞EMT,抑制線粒體功能障礙能夠緩解CRF腎損傷。此外,MnTBAP還能抑制梗阻性損傷所誘導的線粒體功能障礙,可改善水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3和AQP4等的表達,緩解腎組織炎癥和纖維化[39]。因此,靶向線粒體氧化應激可能是延緩慢性腎臟病腎纖維化和疾病進展的有效策略。

3.3線粒體功能障礙與NLRP3 有報道顯示[40]，NLRP3炎癥體的激活使蛋白尿腎病中腎小管線粒體功能障礙加重。NLRP3炎癥小體活化與線粒體受損及自噬有關。線粒體功能障礙能激活NLRP3炎癥小體,誘導組織發生炎癥反應。理論上，炎癥可引起線粒體損傷，導致線粒體產生氧化應激和凋亡，而線粒體功能障礙也會促進炎癥的發生和進展，從而形成炎癥與線粒體功能紊亂之間的正反饋回路。近年,調控NLRP3炎癥小體的中心一直被認為是線粒體來源的ROS[41]。線粒體出現功能障礙時,會生成大量的ROS,機體不能及時清除,聚集的ROS會進一步使相關的信號通路被激活而導致細胞受損[42]。線粒體持續產生細胞活性氧，在細胞應激期間，ROS的水平會顯著增加，其進入胞質后可活化NLRP3炎性體。研究顯示,線粒體靶向抗氧化劑抑制ROS的生成后,腎小管上皮細胞NLRP3炎癥小體的激活也受到抑制,細胞損傷得到減輕[43]。此外，線粒體發生功能障礙時,釋放至胞質的mtDNA會形成損傷相關分子模式，可直接活化NLRP3炎癥小體并與其結合,調控下游炎性因子IL-1β等的合成和分泌,調節炎癥反應和組織損傷[44]。線粒體自噬是通過清除受損、功能異常的線粒體，降低細胞內ROS，從而減少NLRP3炎性小體活化。研究顯示,在巨噬細胞中，敲除自噬基因ATG16L1或ATG7后,會增加IL-1β的表達,而IL-1β的成熟與釋放主要依靠NLRP3炎癥小體活化,提示自噬會干預NLRP3炎癥小體的活化[42]。將自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤作為自噬阻斷劑添加進體外培養的腹膜間皮細胞中，干預自噬過程中發揮關鍵作用的蛋白(Beclin1干預小RNA、ATG5干預小RNA)后,發現損傷的線粒體增加，ROS產生增多,IL-1β表達水平顯著提高,再經白藜蘆醇促進細胞發生自噬后,NLRP3炎癥小體被激活，但其上調IL-1β表達的效應明顯減弱[44]?？梢?阻止自噬發生后，細胞內會出現受損及功能障礙的線粒體堆積，進而釋放過多的ROS，促使NLRP3炎癥小體被激活；而適度自噬會保持線粒體功能的正常,并減少NLRP3炎癥小體的激活。

3.4線粒體功能障礙與PPARγ PPARγ擁有很強的抗炎、抗氧化、調節氧化代謝能力,能參與多種細胞線粒體生物合成并調節氧化磷酸化過程,而ROS生成、氧化應激是線粒體功能障礙的主要表現。PPARγ發生突變時會增加細胞內ROS的表達,降低線粒體膜電位,線粒體功能正常的維持需要依靠PPARγ的高表達[45]；PPARγ又能減少ROS的生成,促進內皮型一氧化氮合酶磷酸化并增加一氧化氮的產量。另外,人工合成的PPARγ激動劑-噻唑烷二酮類藥物(羅格列酮等),已被廣泛用于臨床治療2型糖尿病,并被證明通過抑制線粒體功能障礙能對部分神經性病變的治療發揮潛在價值[46]。PPARγ激動劑也被證明能保護腎臟,減輕蛋白尿、改善腎纖維化,而這與抑制線粒體氧化應激有關[47]。在小鼠成纖維細胞中,增加PPARγ表達會升高線粒體膜電位。在血管內皮細胞中,PPARγ通過抑制線粒體膜電位下降而維持線粒體功能正常。另外,PPARγ亦能調控線粒體合成ATP及mtDNA的拷貝數[48]。PPARγ過表達能夠抑制TGF-β1誘導的PTC線粒體發生功能障礙,通過逆轉線粒體膜電位降低及mtDNA拷貝數減少,緩解PTC損傷。因此,作為線粒體功能調控者的PPARγ,有望成為潛在的治療靶點以改善PTC損傷。

4 小 結

近年來,CRF的臨床治療雖已取得良好的進展,但仍無特效藥物或合理的干預措施對CRF患者進行根治性治療,伴隨腎間質纖維化的進展,最終發展為ESRD。腎間質纖維化發生機制復雜,由多個環節相互作用、相互調節,其最主要的病理變化是腎間質纖維細胞增生和ECM積聚，最終會導致腎臟功能喪失,延緩或阻止腎間質纖維化的產生及進展可有效減少ESRD的出現。目前臨床上主要通過控制加劇腎功能惡化的危險因素來防治腎臟纖維化,一旦纖維化進展導致PTC少于10%,腎臟功能嚴重受損,患者只能接受腎臟移植或透析治療。因此,緩解腎臟組織的持續性損傷,改善腎功能,關鍵是要阻止腎臟纖維化的發生、發展。線粒體功能障礙伴隨多種慢性腎臟疾病的發生發展,通過對線粒體功能障礙與CRF腎間質纖維化的相關機制進行研究,發現其參與了腎間質纖維化發生過程中的關鍵機制,如EMT的發生、致纖維化因子TGF-β1相關通路、NLRP3炎癥小體活化、PPARγ的表達,線粒體功能障礙與RIF相關機制之間相互影響,相互調控。因此,或許能夠通過阻斷線粒體功能障礙以減輕或抑制腎間質纖維化的發生，緩解CRF患者病情，但具體干預方法有待進一步深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。