一種水溶性超分子熒光探針對農藥縮節胺的識別

陳麗霞，宋桂先，楊 梅，黃 英,3，衛 鋼，陶 朱*

(1.貴州大學 貴州省大環化學及超分子化學重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 神奇民族醫藥學院，貴州 貴陽550005；3.貴州大學 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025；4.澳大利亞聯邦科學與工業組織(CSIRO)，新南威爾士州 2070)

縮節胺(mepiquat chloride, MC)，化學名N,N-二甲基哌啶嗡氯化物，是一種白色或淺黃色的粉狀物質，水溶液中無熒光發射。因其對植物生長調節具有高效、低毒、廣譜的特性，在農產品方面廣泛應用[1]；然而縮節胺作為植物生長調節劑對人類和動物的不良影響已得到廣泛報道和研究[2]，因此，建立一種簡單、快速檢測MC的方法是必然的。近年來，對縮節胺殘留的檢測已有毛細管電泳-質譜法[3]和液相色譜-質譜法[4-6]等，但是這些方法都需要用到質譜儀，所需儀器昂貴，分析成本高[7-8]。

超分子熒光探針是由具有空腔結構的主體分子作為外來物質的接受體，主體分子和熒光分子通過非共價作用形成的一類熒光傳感器[9-12]。超分子熒光探針可用于陽離子、陰離子、生物分子(蛋白質、DNA和氨基酸)以及藥物分子等物質的檢測，其檢測機理主要是客體分子的競爭或協同作用，光誘導電子轉移、能量轉移、電子轉移等。這種簡單、快速、靈敏的識別方式近年來受到研究者廣泛的關注[13-20]。

瓜環又稱葫蘆脲(cucurbit[n]urils, 簡稱Q[n]或CB[n])，是一個高度對稱的、剛性的、南瓜形狀的大環籠狀化合物，由亞甲基橋聯的“n”個苷脲單元組成，具有一個電中性疏水空腔、兩個負電性羰基修飾端口以及正電性外壁三大特征[21]。由于瓜環空腔內外的極性等存在差別，熒光物質在瓜環空腔內或外面時，其理化性質、光學性質會發生不同程度的變化。因此，可通過瓜環與具有熒光的客體分子構成超分子熒光探針，待檢測分子與超分子熒光探針作用后導致熒光探針發光性質改變，再通過測熒光探針發光特性的變化來實現目標分子的測定[9-10]。對于空腔較大的Q[8]來說，通常能與尺寸合適的客體分子形成穩定的三元超分子配合物。

本文通過堿性黃T (thioflavin T, ThT)與Q[8]間的非共價鍵主客體相互作用，形成了一種水溶性Q[8]/ThT配合物，且該配合物在570 nm處產生強烈的新型準分子發射帶[22]，從而設計了一種用于無熒光性質的MC的選擇性識別的超分子熒光探針體系。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：Q[8]按文獻[23]由本實驗室自制，ThT、MC均購自Sigma-Aldrich試劑公司；實驗用水為去離子水。儀器：紫外-可見分光光度計(Agilent 8453，美國安捷倫)；熒光光譜儀(Cary Eclipse，美國瓦里安)；等溫滴定量熱儀(Nano ITC，美國TA儀器)；400 MHz核磁共振波譜儀(JNM-ECZ400S，日本電子株式會社)。

1.2 實驗部分

1.2.1光譜的測定

將Q[8]配制成0.1 mmol/L溶液，ThT配制成1.0 mmol/L溶液，MC配制成1.0 mmol/L的母液備用。實驗所提的各個溶液的濃度均通過稀釋法獲得。

采用摩爾比法進行光譜測定：向若干個10 mL的容量瓶中依次加入0.2 mL濃度為1.0 mmol/L的ThT溶液，再向其中分別加入0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0、5.0 mL濃度0.1 mmol/L的Q[8]溶液，用pH=7的Tris-HCl溶液定容。搖勻放置10 min，在250～600 nm波長范圍內測量各個溶液的紫外-可見吸收光譜。樣品池是光程1 cm的標準石英比色皿。在激發狹縫和發射狹縫均為5 nm，激發波長為309 nm條件下，測定體系的熒光發射光譜。

固定探針Q[8]/ThT的濃度為20.0 μmol/L，改變MC的加入體積，并用Tris-HCl溶液調節體系pH=7，定容，使體系中MC的濃度范圍為0～20.0 μmol/L。搖勻放置10 min，在激發狹縫和發射狹縫均為5 nm，激發波長為309 nm條件下，測定體系的熒光發射光譜。

1.2.2氫核磁共振譜的測定

在25 ℃條件下，以氘代水為溶劑，使用日本JEOL JNM-ECZ400S型400 MHz核磁共振波譜儀測定Q[8]與ThT及MC作用的1H NMR譜圖。

1.2.3等溫量熱滴定法的測定

ThT和MC分別配制成濃度為1.0 mmol/L母液備用，Q[8]配制成濃度為0.1 mmol/L母液。以水為參比溶液，采用Nano ITC等溫滴定量熱儀測定主體分子Q[8]分別與客體分子ThT、MC在25 ℃下的平衡常數及熱力學參數，樣品池體積為1.3 mL，攪拌速度為250 r/min，6 μL/滴，間隔時間為250 s。

2 結果與討論

2.1 MC對Q[8]/ThT熒光探針的熒光猝滅

ThT是一種常見的熒光標記染料，常用于淀粉樣原纖維的熒光標記[24-25]。ThT溶液中加入Q[8]溶液后，溶液熒光逐漸增強，通過非共價鍵與Q[8]形成了2 ∶2的超分子配合物，與文獻[22]一致。

當在Q[8]/ThT(2 ∶2)水溶液中逐漸滴加MC，隨著MC濃度的增加，體系在414 nm處的最大紫外-可見吸收光譜逐漸降低，且在440 nm處出現一個增強的峰，當MC的濃度達到20.0 μmol/L時，紫外可見吸收光譜無明顯變化(圖1(a))。從圖1(b)可以看出：體系的熒光強度隨MC的濃度的增加逐漸降低，同時伴隨著最大熒光發射峰從570 nm逐漸移至490 nm，藍移了大約80 nm，且MC在該激發波長下無熒光發射。因此，可利用Q[8]與ThT形成主客體超分子配合物Q[8]/ThT的熒光“開-關”效應，實現對MC的檢測。

(a)紫外-可見吸收光譜 (b)熒光光譜 (λex=309 nm)圖1 在pH為7的Tris-HCl溶液中，熒光探針Q[8]/ThT(20.0 μmol/L)隨不同濃度MC(0～20.0 μmol/L)作用光譜Fig.1 Absorption and fluorescence spectra of Q[8]/ThT(20.0 μmol/L) in pH=7 Tris-HCl solution at different concentrations of MC (0～20.0 μmol/L)

2.2 pH值及共存離子對Q[8]/ThT探針的影響

為了考察pH值對探針Q[8]/ThT熒光強度的影響，測定了不同pH值下探針Q[8]/ThT的熒光強度。圖2是探針Q[8]/ThT在pH為2～11范圍內的570 nm處熒光發射強度的變化。從圖2可以看出：探針Q[8]/ThT在pH為5～9時，熒光強度最強且變化輻度不大，因此選擇pH=7的Tris-HCl溶液作為測試介質。

圖2 在不同pH值的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT在570 nm處熒光強度變化(λex=309 nm)Fig.2 Variation of fluorescence intensity of Q[8]/ThT at 570 nm under different pH in Tris-HCl solution (λex=309 nm)

表1 離子干擾結果Tab.1 The result of ion interference study

2.3 探針Q[8]/ThT識別MC的檢出限

MC能使Q[8]/ThT探針的熒光強度減弱。在pH=7的Tris-HCl溶液中考察Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)熒光強度下降值隨MC濃度的變化。根據其工作曲線(圖3)可得，當MC的濃度在2×10-8～30×10-8mol/L范圍時，MC的濃度與Q[8]/ThT熒光探針強度的降低值呈線性關系，線性方程式：△F=8.31C+44.41，R=0.989。依照IUPAC規定，根據CL=KS0/S計算求得探針檢測MC的檢出限為3.6×10-8mol/L。式中：K為與置信水平相關的常數，當置信水平為90%時K取3；S0為測定10次空白溶液的標準偏差；S為校正曲線的斜率。

圖3 在pH=7的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)熒光強度下降值隨MC濃度變化曲線Fig.3 Fluorescence intensity decreasing values of Q[8]/ThT (20.0 μmol/L) changing with the MC concentrations in Tris-HCl (pH 7)

2.4 Q[8]/ThT超分子熒光探針對MC識別機理

為了探討Q[8]/ThT超分子熒光探針對MC的識別原理，利用1H NMR和ITC考察了超分子熒光探針Q[8]/ThT與MC相互作用情況。Q[8]/ThT與MC相互作用的1H NMR譜圖如圖4所示。由圖4(a)和(b)可以看出：與游離的客體相比，作用的ThT的質子H1向高場方向移動了0.03，H2向低場方向移動了0.80，H3—H8向高場方向分別移動了0.82、0.60、0.70、0.97、0.58、0.83，表明ThT大部分受到了瓜環的屏蔽作用，即ThT大部分進入Q[8]空腔[12]。同樣，由圖4(d)和(e)可以看出：作用MC與游離MC比較，Ha—Hd向高場分別移動了0.20、0.21、0.21、0.20，說明MC進入到Q[8]的空腔，發生了主客體相互作用。隨著MC滴入Q[8]/ThT中(圖4(e))，ThT的所有質子相對于Q[8]/ThT中的質子幾乎沒有變化，而MC的所有質子和游離MC相比均在低場，即非游離的MC，亦非單獨與Q[8]、與MC作用的MC的質子，可能是MC與Q[8]/ThT熒光探針中的Q[8]的端口進行主客體相互作用。因此，我們推測出Q[8] ∶ThT ∶MC為2 ∶2 ∶2的作用模式。熒光探針(Q[8]/ThT)對MC的“開-關”識別示意如圖5所示。

(a) ThT；(b) Q[8]/ThT (2 ∶2)；(c) Q[8]/ThT/MC (2 ∶2 ∶2)；(d) Q[8]/MC (1 ∶2)；(e) MC。圖4 Q[8]與ThT及MC作用的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra for the cucurbit[8]uril with ThT and MC

圖5 熒光探針(Q[8]/ThT)對MC的“開-關”識別示意圖Fig.5 Schematic representation of the “on-off” recognition of MC for Q[8]/ThT fluorescent probe

進一步使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)研究了Q[8]/ThT超分子熒光探針對MC的識別機制。在25 ℃下，Q[8]分別與ThT和MC相互作用，其熱力學擬合參數見表2，等溫滴定量熱圖如圖6所示。Q[8]與ThT的結合常數Ka1=(8.33±0.28)×107L/mol，Ka2=(9.12±0.12)×105L/mol，Q[8]與MC的結合常數Ka=(7.70±0.41)×106L/mol。結果表明，ThT和MC都能夠分別與Q[8]發生主客體作用，形成主客體復合物。然而，由于Q[8]與ThT的作用強于MC，因此，推測當ThT與Q[8]形成Q[8]/ThT超分子熒光探針后，MC不能夠進入Q[8]的空腔，只能與Q[8]的端口作用。該結果與1H NMR測試結果相符。

表2 Q[8]與ThT和MC相互作用的熱力學參數Tab.2 Thermodynamic parameters obtained by ITC for the Q[8] complexation of ThT and MC in aqueous media

(a)ThT (b)MC圖6 在25 ℃下，Q[8]分別與ThT和MC相互作用的等溫滴定量熱圖Fig.6 ITC profiles for the cucurbit[8]uril with ThT and MC at 25 ℃

3 結論

本文基于超分子識別作用原理構筑了一種Q[8]/ThT超分子熒光探針，研究在Tris-HCl溶液(pH=7)中熒光探針Q[8]/ThT對MC的識別響應。結果表明：熒光探針Q[8]/ThT對MC具有良好的識別能力，分析測試結果表明該方法具有檢出限低，快速的優點。此外，利用氫核磁共振波譜及等溫滴定量熱法考察了Q[8]/ThT超分子熒光探針對MC識別機理，即ThT與Q[8]通過非共價主客體相互作用，形成了2 ∶2的主客體包結超分子熒光探針(Q[8]/ThT)，而MC的加入使其能夠進一步與該超分子熒光探針中Q[8]的端口發生主客體相互作用，從而使Q[8]、ThT和MC形成了2 ∶2 ∶2作用模式的超分子三元檢測體系。