濱蒿提取物抗乙肝病毒作用和急性毒性研究

史玉柱 王林林 李玉環 黃 華*

1.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004;2.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，北京 100050

乙肝病毒(HBV)屬噬肝DNA病毒科，具有雙鏈環狀DNA結構和明顯的噬肝性，乙肝病毒侵入機體后，在肝細胞內復制繁殖，引起細胞免疫及體液免疫應答，并激發自身免疫反應及免疫調節功能紊亂，使病變的肝細胞產生或釋放大量正?；虍惓５牡鞍踪|，進一步導致免疫損害加重，使病情不斷發展。HBV感染呈世界性流行，同時，它又是最容易變異的病毒之一，可通過基因突變來抵抗藥物的效力。目前臨床上常用的抗HBV藥物均無法徹底清除HBV慢性感染，如干擾素、拉米夫定、齊多夫定等，這些抗病毒藥還存在副作用多、停藥復發率高、易產生耐藥等種種問題[1-4]。到目前為止，還沒有發現一種能夠真正清除乙肝病毒，徹底治愈乙型肝炎的藥物，因此,HBV感染也被認為是最難治愈的病毒性疾病之一。

在我國，中藥是臨床治療乙型肝炎的重要手段之一，一些中藥材有效部位，不僅可抑制乙肝病毒的復制，還可通過調節免疫功能幫助機體清除病毒，因其可能多成分、多靶點發揮抗病毒效應，在抗病毒研究領域受到廣泛關注。常用藥材中，茵陳、蒲公英、黃芩、黃芪、野菊花、秦艽、杜仲、葉下珠、荔枝核、石榴皮等幾十種中藥材的提取物經實驗研究證實具有抗HBV作用[5-11]，能有效抑制乙肝病毒的復制，它們多為抗乙肝中成藥或經驗方的基本組方藥材。研究這些中藥材及其提取物的抗乙肝病毒作用，不僅可為傳統中醫藥治療乙型肝炎的臨床應用提供實驗依據，還有助于從傳統藥物中探尋新的抗病毒天然產物。

濱蒿(ArtemisiascopariaWaldst.et kit)學名豬毛蒿，古代本草中稱北茵陳或山茵陳，民間又稱“土茵陳”，為菊科蒿屬多年生草本植物，其收載于《中國藥典》，與茵陳蒿同為中藥材茵陳的植物來源，藥用部位為干燥地上部分。濱蒿其植株具有濃烈的香氣，性味苦、辛、微寒，具有清濕熱、退黃疸等功效，其濱蒿作為傳統中藥材常用于治療傳染性黃疸型肝炎，但有關其抗乙肝病毒作用的實驗研究尚未見報道。濱蒿原植物在歐、亞大陸溫帶與亞熱帶地區廣泛分布，生長于草原坡地、荒漠邊緣、林邊路旁等。在我國西北地區，濱蒿的資源分布比茵陳蒿更為廣泛，其適應性、再生性和抗逆性強。新疆地區的濱蒿野生資源極為豐富，其作為維吾爾醫常用藥材也有悠久的應用歷史，維吾爾醫認為其具有清熱解毒、開竅化痰、消敗津、除積物等功效[12]。濱蒿雖作為常用藥材在我國中醫學中有悠久的應用歷史，但其相關基礎研究還比較薄弱，遠不如茵陳蒿。據報道[13-16]，濱蒿中含有香豆素、酚酸、黃酮類、揮發油、色原酮等多種成分，其化學成分與茵陳蒿相近，但有所不同[17-18]。筆者前期研究[19]表明,濱蒿提取物中含有薊黃素、槲皮素、金絲桃苷等黃酮類成分，以及3,5—二咖?？鼘幩岬榷喾N酚酸類成分[20]，其具有明確的抗流感病毒作用[21],并可調節機體的免疫功能[22]。鑒于濱蒿作為茵陳藥材源在傳統中醫藥中常用于乙型肝炎的治療，而其在抗乙肝病毒方面的基礎研究以往未見報道，本研究通過體外實驗考察濱蒿提取物在兩種載體細胞中對HBV復制的干預作用，為濱蒿的傳統應用提供科學依據，并為濱蒿提取物作為廣譜抗病毒天然產物繼續深入研究奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 樣品 藥材于2014年7月采自烏魯木齊八道灣，由新疆藥物研究所何江研究員鑒定為濱蒿ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.的全草。

濱蒿提取物(BH)，其大類成分含量按總黃酮計為51.6%(主要為黃酮類成分和酚酸類成分)，由新疆藥物研究所植化室提供。

制備方法：濱蒿地上部分的粗粉加8～10倍量的水，在100 ℃提取兩次，每次2～3 h，過濾，合并濾液，將濾液濃縮后加相當于濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉淀24 h，濾除沉淀得到乙醇溶液；將乙醇溶液濃縮后以稀鹽酸調節PH值為6～8，采用AB-8大孔樹脂-聚酰胺聯合柱層析，以去離子水沖洗層析柱,再以70%的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇,在60 ℃下真空干燥，即得,出膏率約2.5%。

BH樣品在小鼠給藥時以0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液助懸配制成所需濃度的混懸液，臨用前配制；體外實驗時先用DMSO溶解配成母液，臨用前加細胞培養液稀釋成所需濃度；

拉米夫定(LAM)，由北京諾德恒信化工技術有限公司生產，批號為NDS0061105。

1.2 病毒株及體外細胞模型 轉染人HBV-DNA的肝癌細胞HepG 2.2.15細胞，美國Mount Sinai 醫學中心構建，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所傳代儲存。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(新)2011-0001。

1.4 試劑 谷氨酰胺，ELISA檢測HBsAg和HBeAg試劑盒,由上?？迫A生物工程股份有限公司提供；Eagles MEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素雙抗、G418，為美國GIBCO公司產品; Real time PCR SYRB green試劑盒，由美國英杰生命技術有限公司(Invitrogen)提供; DNA提取試劑盒，為北京全式金生物技術有限公司 (TransGen Biotech)產品。羧甲基纖維素鈉，由上海山浦化工有限公司生產。

2 實驗方法

2.1 濱蒿提取物對HepG2.2.15細胞上清中乙肝病毒復制的影響 樣品對2.2.15細胞分泌HBsAg和 HBeAg的抑制作用: HepG2.2.15細胞在96孔細胞培養板中培養48 h后，加入所配不同濃度含藥培養液，繼續培養9 d(每3 d換液1次)，收集上清液，用HBsAg和HBeAg診斷試劑盒(ELISA)檢測HBsAg和 HBeAg(平行三孔)。

樣品對HepG 2.2.15細胞上清HBV DNA表達的抑制作用：將上述細胞上清液取100 μL，加100uL 8% PEG8000，振蕩混勻。4 ℃靜置4h或者過夜放置，15000RPM，4 ℃離心15 min，棄去上清。加100 μL 12% Chelex-100，振蕩混勻，100 ℃加熱10 min。取上清2 μL，進行熒光定量PCR檢測，實驗重復兩批。

2.2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞穩定表達HBV DNA的影響 HepG2.2.15細胞(約50萬個/L)接種96孔板培養板，每孔100 μL，37℃ 5% CO2條件培養48h左右加樣，BH取25～1.562 μg/mL 5個2倍稀釋濃度， LAM取2～0.125 μm 5個2倍稀釋濃度，加樣，每濃度3孔，同時設細胞對照組，于37 ℃、5%CO2條件培養，第3天換1次藥液，繼續培養，加樣第6天收取細胞，按試劑盒說明書方法提取DNA，實時熒光定量PCR檢測HBV- DNA載量(拷貝/mL)，計算樣品對細胞內HBV-DNA的抑制率。結果見表2。

對 HBV- DNA 抑制采用SybrGreen熒光檢測系統對目的基因(HBV)進行相對定量分析，采用看家基因GAPDH作為內參照對Ct值進行歸一化處理，基因表達差異計算方法采用ΔΔCt法,按照如下公式計算抑制率，按Reed-Muench法計算半數抑制濃度(IC50)。

抑制率(%) =1-2-ΔΔCT

ΔCtsample= HBV Ctsample-GAPDH Ctsample

ΔCtcontrol= HBV Ctcontrol-GAPDH Ctcontrol

ΔΔCt=ΔCtsample-ΔCtcontrol

sample代表實驗組；

control代表對照組；

HBV Ctsample代表實驗組樣品HBV基因的Ct值；

GAPDH Ctsample代表實驗組樣品內參照基因的Ct值；

HBV Ctcontrol代表對照組樣品HBV基因的Ct值；

GAPDH Ctcontrol代表對照組樣品內參照基因的Ct值。

2.3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA高表達的影響 HepAD38細胞接種24孔培養板，37 ℃ 5% CO2培養24 h左右，BH取25～1.562 μg/mL 5個2倍稀釋濃度，LAM取2～0.125 μm 5個2倍稀釋濃度，加樣，每濃度3孔, 37 ℃ 5% CO2培養, 3 d后換原濃度樣品溶液繼續培養，第6 天收取細胞。提取細胞內HBV DNA，Real-time PCR檢測HBV DNA載量，HBV DNA的相對含量用ΔΔCt法進行計算，計算各濃度對HBV DNA的平均抑制率，再按Reed-Muench法計算半數抑制濃度(IC50)。

2.4 濱蒿提取物在小鼠口服的急性毒性研究

2.4.1 預實驗 取昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重18～22 g，禁食不禁水12 h。濱蒿總黃酮以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成最大給藥濃度為15%的混懸液，按40 mL/kg體重灌胃給藥2次(間隔6 h)，觀察24 h，未見死亡，且精神與活動狀態無異常。

2.4.2 最大給藥量(MTD)的測定 取昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為3組，每組20只，即溶媒對照組、濱蒿總黃酮小劑量組和大劑量組，禁食不禁水12 h。濱蒿總黃酮以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成最大給藥濃度為15%的的混懸液，按40 mL/kg體重灌胃給藥，小劑量組給藥1次，大劑量組給藥2次(間隔6 h)，溶媒對照組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。觀察小鼠毒性反應情況，連續觀察14 d，詳細記錄小鼠給藥后毒性癥狀出現、發展、消退和死亡的時間以及出現反應的動物數量；觀察期結束稱取小鼠體重、解剖受試小鼠、觀察臟器病變情況，并對肉眼可見異常的器官進行組織病理學檢查。

3 實驗結果

3.1 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA復制及抗原分泌的影響 實驗結果表明，濱蒿總黃酮可明顯抑制2.2.15 細胞上清HBV DNA表達，IC50平均為142.5 μg/mL;同時還明顯抑制表面抗原和e抗原的分泌，IC50平均為102.9 μg/mL和105.3 μg/mL。見表1。

表1 對2.2.15細胞上清HBV DNA復制和抗原分泌的影響(2批實驗)

3.2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞穩定表達HBV DNA的影響 實驗結果如表2所示，濱蒿總黃酮顯著抑制HepG2.2.15細胞內HBV DNA的復制，其IC50為26.5 μg/mL(如圖1A所示), 拉米夫定對2.2.15細胞內HBV DNA復制的IC50為0.2 μM(如圖1B所示)。

3.3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA高表達的影響 實驗結果見表3，濱蒿總黃酮顯著抑制HepAD38細胞HBV DNA的高表達，其IC50為97.1 μg/mL(如圖2A所示), 拉米夫定抑制HepAD38細胞HBV DNA表達的IC50為0.28 μm(如圖2B所示)。

3.4 小鼠一日內最大給藥量MTD 試驗觀察期內溶媒對照組和給藥組動物均未出現死亡，外觀體征、行為活動及飲食等均未見異常；試驗結束時小劑量組動物體重為(31.7±4.2)g，大劑量組體重為(31.5±3.6)g，對照組體重為(31.7±3.8)g，給藥組體重與對照組比較無顯著性差異；大體解剖檢查給藥組與溶媒對照組臟器比較亦未發現有明顯異常。故小鼠一日內灌胃濱蒿提取物的最大給藥量為12 g/kg·d，且未出現明顯的毒性反應，提示本樣品口服給藥安全性較好。

表2 濱蒿總黃酮對HepG2.2.15細胞HBV DNA表達的抑制率

表3 濱蒿總黃酮對HepAD38細胞HBV DNA表達的抑制率

A：濱蒿總黃酮；B：拉米夫定圖1 不同藥物處理對HepG2.2.15細胞內HBVDNA的復制的影響圖

A：濱蒿總黃酮；B：拉米夫定圖2 不同藥物處理對HepAD38細胞HBVDNA表達的影響圖

4 結論與討論

目前，抗HBV 藥物的篩選都是基于對HBV DNA 表達和抗原表達的抑制活性。HepG2.2.15細胞是被轉染HBV基因的人肝癌細胞系，可以穩定進行HBV 基因組的復制，在細胞上清中也可檢測到HBV DNA和抗原，被廣泛應用于研究HBV復制周期、免疫效應細胞及抗病毒藥物的篩選與評價[15-17]。HepAD38人肝癌細胞在常規培養時采用含四環素的培養基，細胞不產生HBV,當撤去四環素時 細胞開始誘導產生HBV,由于其產毒可進行人為調控，HepAD38細胞的安全系數較2.2.15細胞高。當對HepAD38細胞進行誘導時，其復制產生HBV顆粒的數量迅速提高，最終其產毒水平可達到持續產毒細胞的10倍[24]。

本研究采用的濱蒿提取物主要含酚酸和黃酮類成分，其在上述兩種HBV載體細胞上均顯示出良好的抗乙肝病毒作用，可明顯抑制2.2.15細胞內HBV DNA的復制，同時抑制細胞上清中HBV DNA的表達和HBsAg、HBeAg的分泌，對HepAD38細胞HBV DNA的高表達也有顯著的抑制作用，該濱蒿提取物不僅抗HBV作用強，而且口服給藥的安全性良好，是一個值得深入研究的抗病毒天然產物。上述研究也為濱蒿作為傳統藥材在中醫藥及維吾爾醫藥中的應用提供了的可靠的實驗依據。