CPNE3調控非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲及其相關機制研究

蔡 馨，劉澤毅，黃建安

215006 江蘇 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，蘇州大學呼吸疾病研究所

肺癌在全世界范圍內是導致癌癥相關死亡的最主要病因，2020年全世界約有180萬人死于肺癌[1]。根據臨床組織病理分型，肺癌患者中約85%被診斷為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)[2]。近年來，肺癌的診療工作獲得了長足的進步，靶向治療和免疫治療的應用顯著提高了晚期NSCLC的治療效果，但NSCLC患者總體的生存及預后仍未見明顯改善，最新統計數據顯示肺癌患者的預計5年生存率僅21%[3-4]。因此，進一步尋找影響NSCLC增殖和轉移的關鍵分子并探究其分子機制對于尋找新的藥物靶點、提高療效和改善患者預后都有十分重要的作用。

CPNE3是鈣依賴性的膜結合蛋白家族——Copines中的一員，在各種組織和器官中普遍表達。結構上，CPNE3在其N-端包含兩個串聯C2結構域，作為鈣依賴性磷脂結合基序，參與細胞信號傳導或膜泡運輸；在其C-端包含的A結構域發揮蛋白結合結構域的作用[5]。從作用機制來講，CPNE3表現出激酶活性，可以磷酸化H1組蛋白和堿性磷脂蛋白，激活下游信號通路，從而發揮生物學功能[6]。CPNE3在多種癌癥中發揮的作用已被證實，但CPNE3在NSCLC中發揮作用的具體分子機制仍有待進一步研究。因此，本研究旨在通過體外細胞實驗和體內動物實驗兩個方面探索CPNE3在NSCLC中發揮的作用及其具體機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Lipofectamine 2000轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)；CPNE3干擾序列(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；CCK-8試劑(碧云天公司)；RPMI-1640培養基(Hy-clone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；結晶紫染液(上海生工公司)；CPNE3、β-actin抗體(Proteintech公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、p-EGFR、EGFR抗體(CST公司)；山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司)；空白對照和過表達CPNE3慢病毒(上海吉凱公司)。

1.2 細胞培養

人肺癌細胞株(A549、H1299、H460、H520)和正常支氣管上皮細胞株(BEAS-2B)均從上海中國科學院細胞庫購買。細胞均在含有10%FBS和1%雙抗(100 U/mL青-鏈霉素)的RPMI-1640的完全培養基中、37 ℃、5% CO2條件下恒溫培養。

1.3 瞬時轉染

將A549細胞接種在6孔板中，當細胞密度達到40%～60%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。48～72 h后，收集細胞用于進一步實驗。CPNE3的干擾序列如下：si-CPNE3-1 siRNA：5′-GGG-ACUGGUCAUUCAAGAUTT-3′； si-CPNE3-2 siRNA：5′-GCAAUGGAAUCCAAGGCAUTT-3′。

1.4 CCK-8法檢測細胞實驗

將A549細胞以每孔3×103個細胞的密度接種在96孔板中，每組設置3個復孔，分別在鋪板后24、48、72 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續放到培養箱中培養2 h，然后用酶標儀測定細胞在450、630 nm的吸光度(OD值)。

1.5 克隆形成實驗

將A549細胞以1×103/mL的密度接種于小皿中，搖勻后放入培養箱培養，5～7 d后顯微鏡下觀察，待每個細胞克隆含有約10～15個細胞數時，取出培養皿，PBS洗滌后甲醇固定30 min，再用結晶紫染色2 h，使用相機拍照并計數。

1.6 Transwell實驗

將A549細胞接種在6孔板中，轉染48 h，待細胞密度達到90%，消化細胞并使用含1% FBS的培養基重懸細胞，進行細胞計數。向基質膠包被的小室上室中加入200 μL含6×104細胞的細胞懸液，向無基質膠的小室上室加入200 μL含3×104細胞的細胞懸液，下室均加入800 μL完全培養基。培養24 h，取出小室，PBS洗滌后甲醇固定30 min，再用結晶紫染色2 h，用棉棒輕輕擦去上室表面細胞，于顯微鏡下觀察拍照并計數。

1.7 Western blot實驗

在A549細胞中瞬時轉染干擾序列后，使用RIPA法提取細胞總蛋白。以每孔50 μg蛋白樣品量加樣，用濕轉法將蛋白轉至NC膜上，4 ℃過夜孵育一抗，次日TBST洗4次，每次5 min，室溫孵育二抗2 h，TBST洗4次，每次5 min，顯影液孵育數秒后，使用化學發光成像儀檢測蛋白表達。

1.8 動物模型實驗

選用4～6周齡，體質量16～20 g的雌性BALB/c nude小鼠10只(由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：0051246)。在A549細胞中使用慢病毒侵染細胞構建CPNE3的過表達穩轉細胞株。培養對照組和CPNE3過表達細胞株，待細胞處于對數生長期時消化，離心后使用無血清的培養基重懸。計數并調整細胞濃度為4×106/50 μL，取等體積的基質膠混合，隨后迅速置于冰上備用。在無菌條件下吹打細胞混勻，隨后用1 mL胰島素注射器分別吸取100 μL細胞混懸液接種于裸鼠的兩側肋下，使其成為一皮丘，5～7 d后待皮丘消退，觀察小鼠成瘤情況。密切記錄成瘤時間，以后每隔2天使用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑值，按照計算公式：V(mm3)=a×b2/2計算體積，其中a為長徑，b為短徑。同時觀察裸鼠體質量及生長狀態等。待腫瘤體積達800 mm3時處死裸鼠，取裸鼠皮下瘤體拍照、稱重，并研磨組織蛋白，Western blot檢測相關蛋白表達水平。

1.9 生物信息學分析

從癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據庫(https：//portal.gdc.com)獲得NSCLC組織的RNA-seq數據和臨床信息，并與配對癌旁組織的RNA-seq數據對比，得到配對差異分析結果，使用Rstudio軟件v4.0.3進行統計分析，P值<0.05被認為具有統計學意義。Kaplan-Meier生存分析比較上述兩組或多組之間的生存差異。對于Kaplan-Meier曲線，P值和具有95%CI的風險比(hazard ratio,HR)通過logrank檢驗和單變量Cox回歸得出。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 NSCLC組織中CPNE3高表達并與患者的不良預后相關

基于來自TCGA數據庫獲得的NSCLC組織的RNA-seq數據和臨床信息進行生信分析，結果顯示，與配對癌旁組織相比，CPNE3在NSCLC組織中表達水平顯著升高(P=0.024，圖1A)，且與患者的不良預后相關(HR=2.198 7，P=0.001 2，圖1B)。

2.2 NSCLC細胞株中CPNE3表達升高

通過Western blot檢測CPNE3在正常支氣管上皮細胞株BEAS-2B和NSCLC細胞株A549、H1299、H460和H520中的表達水平(圖2)。與正常支氣管上皮細胞相比，CPNE3在NSCLC細胞的表達顯著升高。選取表達量中等的A549細胞進行后續實驗。

A：TCGA數據庫分析配對的106對癌/癌旁組織中CPNE3的mRNA表達情況(n=106)；B：TCGA數據庫中CPNE3表達情況與NSCLC患者預后的相關性

2.3 干擾CPNE3抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲

在A549細胞株中轉染干擾序列，Western blot檢測CPNE3蛋白水平顯著降低(圖3A)，通過CCK-8實驗和克隆形成檢測發現，與si-NC組相比，si-CPNE3-1和si-CPNE3-2組A549細胞的增殖能力顯著降低(P<0.001，P<0.001，圖3B、C)。Transwell實驗表明si-CPNE3-1組和si-CPNE3-2組的細胞較si-NC組相比，遷移和侵襲能力亦顯著降低(P<0.001，P<0.01，圖3D)。

a：P<0.001，b：P<0.01，與BEAS-2B比較

A：Western blot檢測CPNE3干擾后蛋白水平；B：CCK-8法檢測干擾CPNE3后細胞的增殖能力a：P<0.001，與si-NC組比較；C：克隆形成實驗檢測干擾CPNE3后細胞的增殖能力 a：P<0.01，與si-NC組比較；D：Transwell實驗檢測干擾CPNE3后細胞的遷移和侵襲能力 a：P<0.001，b：P<0.01，與si-NC組比較

A：Western blot檢測A549細胞干擾CPNE3后各組之間CPNE3和下游蛋白的表達和定量結果 a：P<0.001，與si-NC組比較；B：Western blot檢測EGFR磷酸化水平及其下游相關信號通路蛋白的表達和定量結果 a：P<0.001，與si-NC EGF(+)組比較；b：P<0.01，與si-NC EGF(+)組比較

2.4 CPNE3對AKT/ERK和EGFR信號通路的影響

在A549細胞中干擾CPNE3后，通過Western blot檢測增殖和轉移相關蛋白標志物的表達水平變化。結果顯示，與si-NC組相比，si-CPNE3組AKT、ERK和EGFR的磷酸化水平顯著下降，而總AKT、ERK和EGFR的表達并沒有顯著變化(圖4A)。為了進一步驗證CPNE3和EGFR信號通路的關系，在CPNE3干擾組加入外源性EGF(50 ng/mL)刺激，30 min后提取總蛋白。Western blot結果顯示，與si-NC EGF(+)組相比，干擾CPNE3后，外源加入EGF所誘導的EGFR磷酸化及其下游相關信號通路的激活被抑制(圖4B)。證明干擾CPNE3后可以通過EGFR信號通路抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲。

2.5 過表達CPNE3在體內增強A549細胞的增殖能力

通過構建裸鼠皮下移植瘤模型，觀察皮下移植瘤生長速度、腫瘤重量，發現與NC組相比，過表達CPNE3組的瘤體生長速度明顯更快，瘤體重量也高于NC組(圖5A～C)。通過Western blot檢測瘤體組織的蛋白表達情況，發現過表達CPNE3組AKT、ERK和EGFR的磷酸化水平顯著上升(圖5D)。證明過表達CPNE3可以增強A549細胞在體內的增殖能力，這與EGFR信號通路的激活相關。

3 討論

本研究首先通過TCGA數據庫生信分析發現：CPNE3在NSCLC組織中表達明顯升高，并且其高表達與NSCLC患者的不良預后顯著相關，提示CPNE3可能作為癌基因在NSCLC中發揮促癌作用，并可能對患者的預后有一定指導意義。隨后通過一系列體外表型實驗和體內動物實驗進行研究探索，發現干擾CPNE3可以抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力，伴隨著AKT/ERK、EGFR的磷酸化水平的下降；提示CPNE3通過影響EGFR及其下游信號通路發揮作用。體內動物實驗進一步證實了過表達CPNE3可以在裸鼠體內促進移植瘤的生長。以上結果證實了CPNE3這一膜結合蛋白家族成員，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，有潛力成為全新的治療靶點或者評估患者預后的分子標志物。

Copines是一個鈣依賴性的膜結合蛋白家族，在真核生物中普遍存在，具有高度保守、可溶性的特點。目前已確定該家族中有九個成員，越來越多的證據表明，Copines家族成員參與了多種癌癥的發生和進展[7]。

a：P<0.001，與NC組比較；b：P<0.001，與NC組比較；c：P<0.05，與NC組比較；d：P<0.05，與NC組比較；e：P<0.05，與NC組比較；f：P<0.01，與NC組比較

在本文中重點研究的CPNE3是該家族中的一員，其在腫瘤發生發展中的作用得到越來越多的關注。已有文獻報道，在乳腺癌中，CPNE3可以通過激活ErbB2蛋白誘導上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition， EMT)，繼而促進乳腺癌細胞侵襲和遷移[8]。在結直腸癌中，相關研究發現外泌體中CPNE3水平較低的結直腸癌患者的無病生存期和總生存期明顯更好，提示CPNE3可能作為診斷和評估結直腸癌患者預后的生物標志物[9]。在肝細胞癌中，有研究證實敲低CPNE3的表達會增強肝細胞癌細胞對分子靶向藥物索拉非尼的敏感性[10]。在膠質母細胞瘤中，研究表明CPNE3可以通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。在NSCLC中，CPNE3可以與RACK1相互作用并激活黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)信號通路，促進NSCLC的增殖和轉移[12]。

CPNE3在多種癌癥中發揮的促癌作用提示其可能與重要腫瘤相關信號通路存在潛在聯系，其機制亟需進一步探索，為腫瘤靶向治療的臨床實踐提供新的線索。