細針穿刺細胞學未確診的甲狀腺乳頭狀癌患者BRAF V600E基因突變的關聯因素分析

章國智，史綺韻，鮑楊秋，李愛玲，吳 峰，王 成，齊曉偉，張 毅

400038 重慶，陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)第一附屬醫院：乳腺甲狀腺外科1，病理科2

甲狀腺結節非常常見，通過超聲檢查可在68%的健康人群中發現甲狀腺結節。盡管大部分的甲狀腺結節為良性結節，但也有7%～15%的惡性風險[1-3]。在過去的30年里，世界范圍內甲狀腺癌的發病率增加了300%，主要是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)的增加[4]。PTC是甲狀腺癌最常見的組織學亞型，約占新發病例的80%[5]。目前，甲狀腺結節的評估主要包括甲狀腺功能檢測、包含頸部淋巴結的甲狀腺超聲檢查以及細針穿刺細胞學(fine-needle aspiration cytopathology，FNAC)檢查。盡管甲狀腺超聲聯合FNAC是目前臨床上評估甲狀腺結節最常用及可靠的手段，但其也有局限性，大約30%的甲狀腺結節難以通過該方法明確診斷[6]?，F國際上廣泛使用Bethesda甲狀腺細胞學病理報告系統將甲狀腺結節分為6類，BethesdaⅠ～Ⅵ類結節的惡性風險分別為5%～10%、0%～3%、6%～18%、10%～40%、45%～60%、94%～96%[7-8]。臨床實踐中，Bethesda Ⅵ類結節得到了及時的手術干預，但占FNA患者數量絕大部分的BethesdaⅠ～Ⅴ類結節的惡性風險常被低估，這類患者處理方式通常是超聲隨訪、再次FNA或診斷性腺葉切除，增加這部分患者假陰性的風險和醫療負擔。研究表明即使診斷為良性，分類為Bethesda Ⅱ類的甲狀腺結節，兩年內超聲隨訪假陰性率也達到了7.5%[9]。

研究表明，BRAF V600E基因突變對診斷PTC具備高敏感性和特異度[10]。BRAF V600E基因突變出現在超過80%的PTC中[11]，BRAF V600E突變還被證明與高危臨床病理特征、腫瘤復發、轉移和放射性碘治療敏感性降低相關[12-13]。2015年《美國甲狀腺協會(American thyroid association，ATA)指南》建議在甲狀腺結節術前穿刺病理不能確診時，使用分子標記物進行輔助診斷[14]。目前，國內多對FNA樣本進行BRAF V600E單基因檢測輔助提高甲狀腺結節診斷的準確性，但FNA樣本量不足導致檢測失敗、FNA多次采樣增加患者創傷及出血風險、醫療花費增高等問題丞待解決。是否能利用患者臨床資料評估甲狀腺結節的分子表達情況，患者臨床特征及相關因素與BRAF V600E基因突變的相關性尚不明確。研究旨在對FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類，術后病理證實為PTC患者的臨床特征與BRAF V600E基因的相關性進行分析，探討BRAF V600E基因突變與此類結節臨床特征的相關性以及關聯因素的風險預測能力，以期通過常規檢查結果對該基因突變進行預測，提高診斷準確率，優化無該基因檢測條件患者的診療方案，使這部分患者獲益。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采用回顧性隊列研究設計方案。篩選陸軍軍醫大學第一附屬醫院(西南醫院)乳腺甲狀腺外科2020年6月至2021年6月期間經術后組織學病理確診的符合納入標準的127例PTC患者的臨床資料。其中男性患者27例(21.26%)，女性患者100例(78.74%)，年齡19～77(43.09±11.38)歲?；颊咝g前穿刺樣本均采用實時熒光聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術進行BRAF V600E基因檢測，根據BRAF V600E基因檢測結果分為兩個隊列，即BRAF V600E基因突變陽性組和陰性組，對比兩組患者的臨床資料差異，分析其與BRAF V600E基因突變的相聯。納入標準：①術后組織學病理診斷為PTC；②FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類；③既往未進行過射頻消融術、甲狀腺切除術等相關治療；④診療過程記錄完善且臨床資料齊全。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②相關檢查及檢驗結果存在爭議且不能得出明確結果。該研究已獲得陸軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準(KY2020032)。

1.2 診療過程

1.2.1 超聲檢查 采用Siemens S2000型彩色多普勒超聲診斷儀(線陣探頭 9L4，頻率4～9MHz)及Philips IU22型彩色多普勒超聲診斷儀(線陣探頭 L12-5，頻率5～12 MHz)，由甲狀腺超聲診斷醫師根據2017年美國放射學會制定的ACR-TIRADS系統[15]對甲狀腺結節特征進行回顧性統計記錄，記錄超聲特征包括結節數目、最大徑線、回聲性質、結構性質、結節邊緣、結節與被膜分界、結節形態、局灶性強回聲、頸部異常淋巴結。

1.2.2 超聲引導下細針穿刺細胞學檢查 采用Philips IU22型彩色多普勒超聲診斷儀(線陣探頭 L12-5，頻率5～12MHz)以及23G抽吸活檢針。根據術前常規超聲檢查以及超聲造影檢查結果明確目標結節，平臥體位，頭部后仰，常規消毒鋪巾，局部麻醉，確認最佳進針角度和穿刺路徑，在超聲引導下進入目標結節，確保針尖位于病灶處，停止進針，拔出針芯，快速提插進行常規取材，將取出物涂抹在載玻片上，推片后用95%乙醇的固定，顯微鏡觀察，根據2017年Bethesda甲狀腺細胞學報告系統[8]，由病理醫師做出診斷。

1.2.3 BRAF V600E基因檢測 127例患者均使用人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)進行檢測，將制備好的DNA樣本進行實時PCR檢測，根據5-羧基熒光素(5-Carboxyfluorescein，FAM)信號擴增曲線及閾值循環數(cycle threshold，Ct)值判讀基因檢測結果。

1.2.4 外科手術 根據2015年美國甲狀腺協會成人甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌管理指南進行手術，術式包括：①全/近全甲狀腺切除術；②單側甲狀腺腺葉+峽部切除術；③單側甲狀腺腺葉+峽部+對側腺葉大部切除或次全切除術。綜合術前檢查結果評估頸部淋巴結清掃范圍。所有手術評估與實施由同一組醫生完成。

1.2.5 組織病理學檢查 127例標本術后均經固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，由病理醫師做出診斷。

1.3 觀察指標

患者一般資料包括性別、年齡、腫瘤位置等；腫瘤超聲特征包括腫瘤大小、結節與被膜分界、頸部異常淋巴結等；BRAF V600E基因突變情況；FNAC分類情況；術后組織病理學特征包括腫瘤是否為微小癌、頸部淋巴結轉移數量、周圍血管神經侵犯等。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 患者一般資料與BRAF V600E基因突變的單因素分析

研究共納入FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類，術后組織學病理證實為PTC患者127例，其中男性患者27例(21.26%)，女性患者100例(78.74%)，年齡19～77(43.09±11.38)歲。BRAF V600E基因突變組患者82例(64.57%)，無突變組患者45例(35.43%)。對兩組患者的性別、年齡、結節位置、TSH、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)以及游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetra iodothyronine， Free T4)與BRAF V600E基因突變進行單因素分析，單因素分析結果提示BRAF V600E基因突變與上述研究因素均無相關性(P均>0.05，表1)。

表1 PTC患者一般資料與BRAF V600E基因突變

2.2 研究期間FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類患者的整體分布

2020年6月至2021年6月期間，我院FNAC檢查患者共4 030例，其中分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類1 749例(43.40%)。197例患者進行了手術治療，147例(74.62%)患者術后組織學病理為惡性腫瘤，127例(86.39%)患者術后組織學病理為PTC，見表2。

表2 FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類患者整體分布

2.3 超聲特征與BRAF V600E基因突變的單因素分析

研究對82例BRAF V600E基因突變的PTC超聲特征(圖1)和45例無突變的超聲特征進行了回顧分析，總結了所記錄的超聲特征與BRAF V600E基因突變的相關性，其中結節與被膜分界、結節形態、頸部異常淋巴結情況、TIRADS分級與BRAF V600E基因突變存在相關性(P<0.05)，結節最大徑線、結節數目、回聲性質、結構性質、結節邊緣與BRAF V600E基因突變無相關性(P>0.05)，見表3。

2.4 細胞學分類與BRAF V600E基因突變的單因素分析

研究納入了術前FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類(圖2)，即標本不滿意或無法診斷(BethesdaⅠ類)、良性濾泡性腺瘤或慢性淋巴細胞性甲狀腺炎(Bethesda Ⅱ類)、意義不明確的細胞非典型病或意義不明確的濾泡性病變(Bethesda Ⅲ類)、可疑濾泡性腫瘤(Bethesda Ⅳ類)、可疑甲狀腺乳頭狀癌(Bethesda Ⅴ類)，組織病理證實為PTC患者127例。BRAF V600E基因突變組BethesdaⅠ～Ⅴ類患者分別為11例(13.41%)、0例、30例(36.59%)、0例、41例(50.00%)；BRAF V600E基因無突變組患者例數分別為0例、2例(4.44%)、4例(8.89%)、1例(2.22%)、38例(84.45%)。由于BethesdaⅠ～Ⅳ類樣本量小，故將其做為一組進行統計分析，單因素分析結果提示細胞學分類與BRAF V600E基因突變有相關性(P<0.001)，見表4。BRAF V600E基因檢測與FNAC為同時進行，不予以納入多因素分析進行風險預測。

→：示甲狀腺結節 邊界欠清、邊緣成角

表3 PTC患者超聲特征與BRAF V600E基因突變單因素分析結果[例

A：Bethesda Ⅰ類 標本不滿意或無法診斷；B：Bethesda Ⅱ類 良性濾泡性腺瘤或慢性淋巴細胞性甲狀腺炎；C：Bethesda Ⅲ類 意義不明確的細胞非典型病或意義不明確的濾泡性病變；D：Bethesda Ⅳ類 可疑濾泡性腫瘤；E：Bethesda Ⅴ類 可疑甲狀腺乳頭狀癌

表4 PTC患者細胞學分類與BRAF V600E基因突變

2.5 組織病理學特征與BRAF V600E基因突變的單因素分析

研究所納入的樣本均為組織學病理證實的PTC患者(圖3)，對組織學病理特征與BRAF V600E基因突變的相關性進行分析，分析特征包含組織學病理類型、中央區淋巴結轉移、中央區淋巴結受累個數、頸側方淋巴結轉移、頸側方淋巴結受累個數、向外侵犯(被膜、血管以及神經侵犯)、T分期、N分期以及AJCC分期。單因素分析結果顯示BRAF V600E基因突變與組織學病理類型、T分期相關(P<0.001)，與中央區淋巴結轉移、中央區淋巴結受累個數、頸側方淋巴結轉移、頸側方淋巴結受累個數、向外侵犯、N分期以及AJCC分期無關，見表5。

圖3 奧林巴斯BX53顯微鏡下BRAF V600E基因突變PTC

表5 PTC患者組織學病理特征與BRAF V600E基因突變單因素分析 [例

2.6 多因素Logistic回歸分析

對單因素分析中分析得出的具有統計學意義的術前變量納入Logistic多因素回歸分析，結果顯示被膜分界不清為BRAF V600E基因突變的危險因素(OR=34.117)，而頸部異常淋巴結為BRAF V600E基因突變的保護因素(OR=0.071)。見表6。繪制回歸模型的ROC曲線(圖4)，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.921(95%CI：0.876～0.967)，敏感度及特異度分別為82.9%和86.7%。

圖4 FNAC分類BethesdaⅠ～ⅤPTC患者的臨床影像學特征預測BRAF V600E基因突變的Logistic回歸模型ROC曲線

3 討論

本研究針對我院FNAC分類為BethesdaⅠ～Ⅴ類患者的臨床數據進行回顧，分析了術后組織學病理證實為PTC患者的臨床資料與BRAF V600E基因突變的相關性。一般資料得出結果與既往研究證實的女性為PTC好發人群，男女發病比例為1∶3，43%的病例發生在45～64歲，<55歲人群發病率高于≥55歲人群相吻合[4]。研究中PTC患者BRAF V600E基因突變發生率為64.57%，略低于中國PTC患者整體BRAF V600E基因突變發生率71.2%[16]，這可能是研究未納入BethesdaⅣ類PTC患者BRAF V600E基因數據導致。在對PTC患者的臨床資料與BRAF V600E基因突變的相關性分析中，患者基礎特征(包括性別、年齡、結節部位及甲功)與BRAF V600E基因突變無相關性。以術后病理為金標準，197例手術患者中147例(74.62%)被證實為惡性腫瘤，其中127例(86.39%)為PTC，與既往研究中PTC新發病例占比一致[5]。BethesdaⅠ～Ⅴ類結節中惡性腫瘤分布結果提示除BethesdaⅣ類結節外，余惡性概率均高于Bethesda分類報告系統給出的惡性風險[8]，這表明此類結節惡性風險確被低估。但僅統計了手術病例，可能存在選擇偏倚，使結果惡性比例高。

現有研究中，PTC患者超聲特征對BRAF V600E基因突變的預測能力爭議很大。本研究單因素分析結果顯示結節與被膜分界、結節形態、超聲提示頸部異常淋巴結及TIRADS分級是BRAF V600E基因突變的相關因素，多因素分析結果提示結節與被膜分界和超聲提示頸部異常淋巴結是BRAF V600E基因突變的獨立預測因素。有研究指出結節多灶性和縱橫比是PTC患者BRAF V600E基因突變的風險因素，在本研究中未得到證實[17]。超聲提示頸部異常淋巴結在既往研究中被作為BRAF V600E基因突變的預測風險因素[18]，而本研究中超聲提示頸部淋巴結異常是保護因素，與蘭雨等[19]研究結論一致。這可能與臨床實踐中多對攜帶BRAF V600E基因突變的BethesdaⅠ～Ⅴ類患者進行手術干預，而無BRAF V600E基因突變時僅對癥狀明顯、腫瘤較大或輔助檢查高度可疑的患者進行手術干預，這就導致了BRAF V600E基因無突變組患者分期相對晚，頸部淋巴結異?；颊弑壤?。本研究中結節與被膜分界不清是BRAF V600E基因突變的風險預測因素，與既往研究結論一致[20]。

表6 多因素Logistic回歸分析BRAF V600E基因突變的危險因素

單因素分析提示Bethesda分類、腫瘤T分期、是否為微小癌與BRAF V600E基因突變相關。但由于上述資料的獲得發生在BRAF V600E基因檢測之后，遂不予以納入多因素分析進行風險預測。一項關于PTC患者BRAF V600E基因突變風險及預后因素的大型Meta分析確定了年齡、性別、多灶性、淋巴結轉移、血管侵犯、甲狀腺外侵和晚期腫瘤淋巴結轉移是BRAF V600E基因突變的危險因素[21]，本研究僅得出部分一致結論，后續需增加研究樣本，納入FNAC分類為Bethesda Ⅵ類的PTC患者臨床數據進行分析，更全面的評估我國PTC人群BRAF V600E基因突變的相關風險因素。

綜上，本研究認為BethesdaⅠ～Ⅴ類結節的惡性風險或被低估，FNAC聯合BRAF V600E基因檢測可提高PTC的診斷效能，減少假陰性發生。結節與被膜分界、彩超提示頸部異常淋巴結為此類患者BRAF V600E基因突變獨立影響因素，可以用來預測BRAF V600E基因突變情況以提高此類結節的診斷準確率，對臨床診療及預后評估有一定的指導意義。