一測多評法對金鈴子散中來源于延胡索的5個生物堿成分含量的同時測定*

任慧，崔小敏，胡靜，劉小妹，陳志永

陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003

金鈴子散是治療肝郁血滯、氣郁化火的名方，金元時期劉完素《素問·病機氣宜保命集篇》中記載：“治熱厥心痛，或發或止，久不愈者，當用金鈴子散。金鈴子，玄胡各一兩，上為細末，每服三錢，酒調下?！保?］方中金鈴子（川楝子）和玄胡（延胡索）以1∶1配伍，川楝子疏肝行氣，清泄肝火；延胡索行氣活血，尤長于止痛，以增強川楝子止痛之功［2］?，F代臨床實踐中金鈴子散主要用于治療慢性肝炎、膽囊炎、膽石癥、肝硬化、胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎等疾?。?-4］。藥理學研究表明，醋炙延胡索和炒川楝子配伍鎮痛抗炎作用尤佳［5］，而其散劑鎮痛效果強于湯劑［6］。

目前，對復方的多指標質量評價可通過對多個成分的同時測定實現，而多指標評價導致對照品消耗大，制約了中藥制劑中多成分含量測定方法研究，而一測多評法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS）是利用中藥中有效成分內在函數關系和比例關系，選擇一個廉價易得的有效成分為內參物，通過測定內參物的含量實現多成分同時測定，該法是一種快速、簡便，且符合中藥特點的質量評價方法，近年來在中藥質量控制中被廣泛應用［7］。本研究以延胡索乙素為內參物，首次建立了金鈴子散中來源于延胡索的延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿5種生物堿成分的一測多評質量控制方法，旨在提供一種快速、簡便實現金鈴子散中生物堿類成分含量測定的方法，提高金鈴子散質量控制水平，為金鈴子散的有效性、安全性提供依據。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SHIMADZU 2010A-HT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-400DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG-16WS型臺式高速離心機（湖南邁克爾儀器有限公司）；BS210S型和BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 試藥炒川楝子（產地：四川，規格：1.0 kg，批號：20180601、20190301）、醋延胡索（產地：陜西，規格：1.0 kg，批號：20181001、20190701）均購于陜西興盛德藥業有限責任公司；炒川楝子（編號：CLZ20181201）、醋延胡索（編號：YHS20180801）購于西安市老百姓大藥房，并經陜西省中醫藥研究院陳志永副研究員鑒定為正品；延胡索乙素對照品（純度99.86%，批號：MUST-18032720）購于成都曼斯特生物科技有限公司；鹽酸巴馬汀對照品（純度≥98%，批號：18082103）、鹽酸黃連堿對照品（純度≥98%，批號：19042602）均購于上海圻明生物科技有限公司；去氫紫堇堿對照品（純度≥97%，批號：CHB170220）、紫堇堿對照品（純度≥98%，批號：CHB171107）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific）；水為超純水，磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～90 min，16%～24%乙腈），柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量10 μL。在本色譜條件下，金鈴子散中5種成分分離度良好，陰性樣品無干擾。見圖1。

圖1 各溶液高效液相色譜圖

2.2 金鈴子散制備按照金鈴子散處方比例稱取不同批次炒川楝子、醋延胡索藥材，粉碎，過60目篩，制備3批次制劑，編號分別為20191106、20191107、20191108。

2.3 供試品溶液制備精密稱取金鈴子散制劑2.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇30 mL，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，取1 mL提取液以離心半徑6.3 cm，5000 r/min離心5 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 混合對照品溶液制備分別稱取延胡索乙素、鹽酸黃連堿、紫堇堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿適量，精密稱定，加70%甲醇水溶液溶解，配制成含延胡索乙素（128.0 μg/mL）、鹽酸黃連堿（48.0 μg/mL）、紫堇堿（46.0 μg/mL）、鹽酸巴馬?。?5.6 μg/mL）、去氫紫堇堿（103.2 μg/mL）的混合對照品溶液。

2.5 陰性樣品溶液制備精密稱取川楝子藥材，按照“2.2”項下金鈴子散制備工藝制備陰性制劑，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.6 線性范圍考察分別精密吸取“2.4”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積，以對照品的量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。各待測成分回歸方程、線性范圍、相關系數（r）見表1。

表1 5個生物堿成分的線性關系

2.7 精密度試驗精密吸取“2.6”項下同一份混合對照品溶液，依據“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄峰面積。計算得延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿峰面積的RSD分別為0.81%、1.41%、1.33%、1.31%、1.76%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗精密稱取同一批金鈴子散制劑（批號：20191106）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定5種待測成分的含量，并計算各待測成分含量的RSD值，結果延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿的RSD分別為2.92%、2.35%、1.84%、2.29%、2.70%，表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗精密吸取同一份供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿峰面積的RSD分別為0.92%、0.94%、0.42%、1.90%、0.88%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗精密稱取已知5個化合物含量的金鈴子散樣品（批號：20191106）1.0 g，共6份，分別精密加入各對照品適量，依據“2.3”項下供試品制備方法及“2.1”項下色譜條件進行分析，計算各待測成分的加樣回收率及RSD值，結果5個生物堿平均加樣回收率為96.79%～102.41%，RSD為0.45%～2.67%，表明該方法準確性良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.11 相對校正因子計算參考文獻方法，采用多點校正法計算相對校正因子（fs/i）［8］，即以多個質量濃度點計算所得的fs/i取平均值作為定量用的fs/i，計算公式［9］為：

公式（1）中As為內參物峰面積，Cs為內參物濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度。精密吸取“2.4”項下混合對照品溶液1、2、3、4、5、6 μL進樣，以延胡索乙素為內參物，采用多點校正法計算其余4種待測成分的fs/i。fs/a、fs/b、fs/c、fs/d分別為待測成分黃連堿、紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇堿。4種 成 分的fs/i分別為0.3705、0.7560、0.2214和0.3332，RSD均小于3.00%。見表3。

表3 以延胡索乙素為內參物的fs/i計算結果（n=6）

2.12 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響分別采用Agilent 1260和SHIMADZU 2010A-HT高效液相色譜儀；Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱和Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，考察不同儀器與色譜柱對相對校正因子的影響，測得各待測成分的fs/i，RSD均小于5.00%，表明建立的相對校正因子在不同儀器、色譜柱上有良好的適用性。見表4。

表4 不同儀器、色譜柱測得的相對校正因子

2.13 待測成分色譜峰定位對待測成分色譜峰的準確定位是實現多成分一測多評的前提，通常采用相對保留時間或保留時間差值的方法定位，而相對保留時間定位波動較小、較穩定［8-10］。故而選擇以延胡索乙素的保留時間相對值作為待測成分定位標準，計算不同高效液相色譜儀和不同色譜柱的相對保留時間（Ts/i），計算公式為Ts/i=Rti/Rts，式中Rti、Rts分別代表待測成分和延胡索乙素保留時間。結果在不同高效液相色譜儀和色譜柱條件下，測得各待測成分相對保留時間Ts/i的RSD均小于5.00%。見表5。

表5 不同儀器、色譜柱測得的相對保留時間

2.14 一測多評法與外標法比較取3批金鈴子散樣品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依照“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各待測成分峰面積。采用外標法（the external standard method，ESM）計算各待測成分在金鈴子散中的含量，借助“2.11”項下建立的相對校正因子計算各待測成分含量，待測成分質量濃度計算公式［9］為：

公式（2）中As為內參物峰面積，Cs為內參物濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度，fs/i為待測成分與內參物相對校正因子。

將QAMS和ESM的定量測定結果看作兩個多維空間向量，計算兩者的夾角余弦值得到余弦相似度反映兩種方法測定結果的相似性［11-12］，即余弦值越接近1，表明兩者相似度越高。夾角余弦值的計算公式為：

公式（3）中cosθ為夾角余弦值，X為QAMS的測量結果，Y為ESM測量結果，i為金鈴子散待測樣品編號。通過計算各待測成分夾角余弦值均為1.0000，表明QAMS和ESM定量測定結果高度相似，且這兩種方法測定結果的相對誤差均小于3.00%，見表6。

表6 一測多評法與外標法對5種生物堿成份的測定結果

由表6可知，3批金鈴子散中延胡索乙素含量在0.8839～1.0811 mg/g之間，黃連堿含量在0.2258～0.3605 mg/g之間，紫堇堿含量在0.3567～0.4051 mg/g之間，巴馬汀含量在0.1064～0.1908 mg/g之間，去氫紫堇堿含量在0.6422～0.8342 mg/g之間；擬定各成分含量最低值的80%為含量限度，待今后積累更多數據再做修訂。因此，暫定金鈴子散中延胡索乙素含量不得少于0.7071 mg/g，黃連堿含量不得少于0.1806 mg/g，紫堇堿含量不得少于0.2854 mg/g，巴馬汀含量不得少于0.0851 mg/g，去氫紫堇堿含量不得少于0.5138 mg/g。

3 討論

3.1 含量測定指標性成分的選擇生物堿為金鈴子散中代表成分，其中延胡索乙素有鎮痛、鎮靜、抗心律失常、抗心肌缺血、抗胃腸道潰瘍、保肝等作用［13］，去氫紫堇堿有鎮痛、保護心血管等作用［14］，巴馬汀有降血糖、抗心律失常、提高免疫功能及抗老年癡呆等藥理活性［15］，黃連堿有胃黏膜保護、心肌保護、抑制A型單胺氧化酶、選擇性抑制和雙重抑制血管平滑肌細胞增殖等活性［15］，紫堇堿有鎮痛、鎮靜等作用［16］。因而選擇生物堿有效成分延胡索乙素、去氫紫堇堿、巴馬汀、黃連堿和紫堇堿為金鈴子散質量控制的指標成分。

3.2 內參物選擇延胡索乙素性質穩定，廉價易得，不與其他成分反應，分離效果較好，不受其他成分干擾，因此本研究選擇延胡索乙素為內參物，所得相對校正因子穩定性、重現性良好。

基于此，本研究建立了金鈴子散中延胡索乙素、黃連堿、紫堇堿、巴馬汀和去氫紫堇堿5種生物堿類成分的一測多評含量測定方法。采用不同儀器和色譜柱考察了所建立的相對校正因子耐用性，通過相對保留時間法實現各待測成分色譜峰的定位，通過計算QAMS和ESM含量測定結果的余弦相似度評價QAMS用于金鈴子散質量控制的準確性和科學性。本研究結果表明所建立的QAMS法準確、精密，可用于金鈴子散中5種生物堿成分含量的測定，可提高金鈴子散質量控制水平，推進金鈴子散在臨床的科學化、規范化應用。