微生物合成己酸的基本原理：能量代謝及影響因素

馬鴻志，武文宇，于子強，趙繼華，高 明，汪群慧

1) 北京科技大學能源與環境工程學院環境科學與工程系，北京 100083 2) 工業典型污染物資源化處理北京市重點實驗室，北京 100083

隨著有機廢物處理壓力的日益增大，開發合適的有機廢物資源化技術迫在眉睫[1].微生物合成己酸是一種基于羧酸平臺的技術，將短鏈的醇、酸通過厭氧發酵中的β 氧化逆循環進行碳鏈延長，合成高價值的己酸[2].β 氧化逆循環是一種在乙酰輔酶A 輔助下，通過逆β 氧化將羧酸的碳鏈每次延長兩個碳的厭氧代謝途徑.每次逆β 氧化為一個循環，其中代謝模式與相關酶基本一致.以乙酸為例，乙酸在第一次逆β 氧化中被乙酰輔酶A 延長碳鏈為丁酸，之后丁酸在第二次逆β 氧化中被乙酰輔酶A 延長為己酸.

在己酸合成過程中，合適的微生物十分重要，以純菌（如以乙醇為底物的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和以乳酸為底物的埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdeniiin)）為接種物，以乙醇、乳酸以及乙酸為底物的微生物合成己酸技術已較為成熟[3].近年來，以低成本混菌為接種物，以實際有機廢物為底物的微生物合成己酸技術在資源化領域取得了一定的成就.Wu 等[4]將富含乳酸、乙醇的中國釀酒廢水作為底物，以釀酒廠窖泥與污水處理廠剩余污泥作為混合接種物，進行了序批式實驗，產物中己酸質量分數達到了59.23%，產量為5.55 g·L-1，實現了釀酒廢水與剩余污泥的資源化.Zhu 等[5]將富含乳酸的黃水為底物，以釀酒廠窖泥為接種物，在序批式反應器中三次增添底物，己酸產量達到23 g·L-1，產物中己酸質量分數達到了84.74%.劉春梅[6]以果蔬垃圾發酵液為底物，以污泥為接種物，在乙醇與果蔬垃圾發酵液質量比為4∶1，pH值為7.5 的條件下，己酸產量達到了14.9 g·L-1.

盡管微生物合成己酸在有機廢物資源化領域得到了一定的成果，但仍存在著影響因素過多、產量較低等問題[7].目前的研究多介紹微生物合成己酸過程中的功能微生物、底物種類以及產物產率[8-9].同時，在機理描述時往往忽略各反應步驟之間的能量代謝與還原酶的供給關系[10].β 氧化逆循環過程中涉及多個與能量代謝相關的步驟，以及與熱力學相關的還原酶供給關系，對能量代謝與還原酶供給關系的明確有助于明晰反應機理，提高產物產率.本研究將介紹碳鏈延長的基本原理，并開展對碳鏈延長過程中的能量、還原酶供給關系的分析，結合研究現狀介紹微生物合成己酸過程中的兩種典型影響因素：pH 與頂空氣體，并分析其作用機理.綜述生物電化學強化己酸合成的研究進展，探討該技術目前的局限性以及未來的發展方向，以期提供將己酸產率提高的策略.

1 微生物合成己酸途徑與能量、還原酶的供給關系

微生物合成己酸是通過β 氧化逆循環實現的，在這個過程中發生了電子供體的氧化與電子受體的還原.一般常用乙醇與乳酸作為電子供體，乙酸作為電子受體.由于乙醇與乳酸的代謝途徑不同，將分別進行討論，并探討其中的競爭途徑.此外，將對電子受體的還原以及整個β 氧化逆循環過程中的能量代謝與還原酶的供給關系進行分析.

1.1 乳酸作為電子供體的氧化過程

圖1 為乳酸作為電子供體參與β 氧化逆循環的代謝途徑，乳酸首先被乳酸脫氫酶氧化為丙酮酸，之后與發酵液中的輔酶A 結合生成乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）.值得注意的是，在乳酸厭氧發酵過程中，存在著競爭途徑.當乳酸濃度過高時，乳酸會被轉化為丙烯酰輔酶A，從而進行奇數碳的碳鏈延長（丙酸、戊酸），無法生成偶數碳的己酸.一旦乳酸-丙烯酸酯途徑開始占主導，偶數碳的己酸合成將很難開展[11].然而，由于不同研究中發酵系統的微生物多樣性與設備復雜性，很難確定乳酸-丙烯酸酯途徑的乳酸濃度閾值.在Prabhu等[12]接種純菌（Megasphaera elsdeniiin）乳酸碳鏈延長研究中，乳酸質量濃度達到3.15 g·L-1時乳酸-丙烯酸酯途徑已經占主導地位；在Kucek 等[11]的升流式厭氧連續流反應器中，乳酸質量濃度負荷為8.50 g·L-1·d-1時，偶數碳的己酸合成占主導地位，當乳酸質量濃度負荷提升到15.14 g·L-1·d-1時，乳酸-丙烯酸酯途徑占主導地位；在Zhu 等[5]的厭氧反應器中，盡管乳酸投加量高達30 g·L-1，偶數碳的己酸合成仍占主導地位.因此，在以乳酸作為電子供體時，為避免乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭，乳酸濃度不宜過高，決定主導途徑的乳酸濃度閾值需要結合實際情況確定.

圖1 乳酸的乙酰輔酶A 氧化途徑和其競爭途徑Fig.1 Acetyl-CoA oxidation pathway and competitive pathway of lactic acid

除競爭途徑外，乳酸代謝過程還存在著不同的電子選擇路徑.丙酮酸向乙酰輔酶A 的轉化過程中存在著Rnf（一種以NAD+（還原性輔酶Ⅰ的氧化形式）為電子受體的酶復合物，命名來源于Rhodobacter capsulatusnitrogen fixation，即莢膜紅桿菌的固氮行為）電子傳遞鏈與Ech（Energy-converting ferredoxin-dependent hydrogenase complexoll，以質子為電子受體的酶復合物）電子傳遞鏈這兩種選擇路徑，前者會消耗NAD+，后者則消耗質子[13].盡管兩種電子傳遞鏈的轉化目標都為乙酰輔酶A，但Ech 電子傳遞鏈會顯著升高厭氧系統的pH，導致發酵體系pH 失衡，從而使β 氧化逆循環受到不良的影響[14].因此，Rnf 電子傳遞鏈是乳酸代謝過程中更佳的選擇路徑，在確定Ech 電子傳遞鏈存在時應及時調控發酵液的pH，避免發酵體系pH失衡.

圖中，CoA 表示酶，NADH 為還原性輔酶Ⅰ，NAD+為還原性輔酶Ⅰ的氧化形式，Fdred為還原態鐵氧還蛋白，FdOX氧化態鐵氧還蛋白.

1.2 乙醇作為電子供體的氧化過程

乙醇作為電子供體參與β 氧化逆循環，其代謝途徑如圖2 所示：乙醇首先被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，乙醛被乙醛脫氫酶氧化為乙酰輔酶A.此時，部分乙酰輔酶A 可能會被氧化為乙酸，乙酸作為電子受體參與后續反應.需要注意的是，乙酸作為乙酸營養型產甲烷菌的底物，可能被消耗進行甲烷的合成，導致電子受體的流失，通常采用pH調節與添加產甲烷抑制劑對產甲烷菌進行抑制[9,15].另外一種對乙醇轉化己酸的抑制途徑是乙醇的過度氧化（Excessive ethanol oxidation,EEO）[16].EEO 主要由于CO2分壓過高導致，該競爭途徑會使得更多的乙酰輔酶A 轉化為乙酸，導致后續步驟中乙酰輔酶A 的缺失，從而使己酸的合成受到抑制.因此，在己酸合成中應時刻監測發酵液的乙酸濃度與頂空氣體組成，當乙酸濃度升高時調整反應器的相關參數，從而避免EEO 的發生.

圖2 乙醇的乙酰輔酶A 氧化途徑和其競爭途徑Fig.2 Acetyl-CoA oxidation pathway and competitive pathway of ethanol

1.3 電子受體的還原

β 氧化逆循環也需要電子受體的還原，一般是指乙酸還原為丁酸，丁酸還原為己酸.其還原途徑如圖3 所示：乙酰輔酶A 自我縮合，生成乙酰乙酰輔酶A，之后在還原型輔酶Ⅱ（NAD(P)H）的作用下還原并脫水，轉化為丁烯酰輔酶A.丁烯酰輔酶A 被丁酰輔酶A 脫氫酶還原為丁酰輔酶A 后，與乙酸結合生成丁酸與乙酰輔酶A.丁酰輔酶A 也可以與乙酰輔酶A 結合，在經過還原脫水后被己酰輔酶A 脫氫酶還原為己酰輔酶A，之后結合丁酸生成己酸與丁酰輔酶A，完成一次乙酸向己酸的轉化[13].綜上，乙酸的碳鏈被乙酰輔酶A 延長兩個碳生成丁酸，丁酸的碳鏈再被丁酰輔酶A 與乙酰輔酶A 延長兩個碳生成己酸.在微生物合成己酸過程中，丁酸作為中間產物會被首先合成，之后再進行己酸的合成，兩者的時間間隔范圍可從短約2 h 至長達144 h 不等[4,17].

圖3 丁酸與己酸的生成機理Fig.3 Diagrams illustrating the mechanism of formation of butyric and caproic acids

1.4 還原酶的供給與能量代謝

β 氧化逆循環過程中存在許多還原型輔酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）參與的氧化還原反應，同時會有反應能量的變化，本節將重點介紹β 氧化逆循環過程中的還原酶供給關系與能量代謝.

1.4.1 還原酶的供給

乙醇和乳酸向乙酰輔酶A 的轉化都是在NAD+的作用下實現的.在氧化過程中，NAD+會從中間產物得到H+，并從電子供體處得到電子，完成向NADH 的轉化.1 mol 乙醇轉化為1 mol 乙酰輔酶A 時會轉化2 mol NAD+為NADH.1 mol 乳酸轉化為1 mol 乙酰輔酶A 時，通過Rnf 電子傳遞鏈會轉化2 mol NAD+為NADH，通過Ech 電子傳遞鏈時會轉化1 mol NAD+為NADH.丁酸與己酸的生成需要NADH 的參與.每1 mol 乙酰輔酶A 生成1 mol 丁酸（己酸），丁酰輔酶A 脫氫酶（己酰輔酶A 脫氫酶）需消耗1.4 mol NADH（消耗2 mol NADH，但同時鐵氧化還原蛋白的轉化會生成0.6 mol NADH）[18].綜上，如圖4 所示，電子供體氧化生產NADH，而電子受體還原消耗NADH.因此，1 mol電子供體向1 mol 乙酰輔酶A 轉化生成的1～2 mol NADH，可以提供到1 mol 乙酰輔酶A 向1 mol丁酸或己酸的轉化過程中.

圖4 β 氧化逆循環中還原酶的供給Fig.4 Reductase supply in reverse β oxidation

1.4.2 能量的供給與電子分岔

厭氧發酵過程中微生物需要足夠的能量維持自身的生長代謝.不同于好氧過程，厭氧發酵過程中由于缺乏氧氣作為電子受體，部分能量伴隨電子供體中電子的轉移而進入到其他電子受體中，如β 氧化逆循環中的己酸.因此，在合成己酸過程中，微生物往往會選擇最佳途徑來保證足夠的能量供給，明確β 氧化逆循環過程中的能量代謝至關重要.本部分內容將總結細化前文的己酸合成途徑，并標注關鍵的能量代謝位點，從酶與電子傳遞的角度進一步明確微生物合成己酸過程中ATP的合成與厭氧微生物對不同電子氧化還原電位的利用.

β 氧化逆循環過程中伴隨著底物水平磷酸化（Substrate level phosphorylation,SLP）與電子傳遞磷酸化（Electron transport phosphorylation,ETP）兩種ATP 合成方式[19].前者來源于磷酸基團向二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate,ADP）的轉移，后者來源于電化學離子梯度作用下還原態鐵氧還蛋白（Fdred）向氧化態鐵氧還蛋白（FdOX）的氧化.圖5與圖6 分別展示了電子供體氧化與電子受體還原過程中的ATP 合成.如圖5 所示，SLP 發生在乙酰輔酶A 被氧化為乙酸的過程中，乙酰輔酶A 先轉化為磷酸乙酰酐，之后磷酸乙酰酐的磷酸基脫落，發酵液中游離的ADP 會與磷酸基結合，進而生成三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP），即能量.同理，丁酰輔酶與己酰輔酶A 被氧化為丁酸和己酸時也會產生ATP[20].然而，如圖6 所示，在β 氧化逆循環中，該過程有乙酸或丁酸的參與，則不會產生ATP.β 氧化逆循環中丁酰輔酶A（己酰輔酶A）到丁酸（己酸）的步驟類似于基團的交換，而SLP 則是由氧化過程中磷酸基脫落造成的，這是兩種本質不同但產物相同的反應類型.若微生物將丁酰輔酶A（己酰輔酶A）通過SLP 轉化為丁酸（己酸），盡管ATP 產量增加，但將導致乙酰輔酶A 缺失，從而導致β 氧化逆循環受阻，使碳鏈延長過程停滯在丁酸.從能量代謝的角度來說，若β 氧化逆循環中碳鏈延長被停滯在丁酸，則可能是因為微生物需要通過SLP 供給的能量維持自身生長代謝，而非通過β 氧化逆循環將能量轉移到己酸中導致的.ETP 發生在丙酮酸的氧化（圖5）與丁烯酰輔酶A、2-己烯酰輔酶A 的還原過程（圖6）中，這些過程都涉及Fdred的氧化.如圖5 所示，這種氧化是在Rnf 或Ech 上發生的，Na+或H+向胞外移動，形成離子電化學梯度，此時ATP 合成酶會結合胞外的離子電化學梯度進行ATP 的生產[14].這兩種來源不同的ATP 都可以在電子受體還原時為碳鏈的延長提供能量.

圖5 電子供體氧化過程中的能量代謝Fig.5 Energy metabolism during electron donor oxidation

圖6 電子受體還原過程中的能量代謝Fig.6 Energy metabolism during electron acceptor reduction

在ETP 過程中Fdred被氧化為FdOX，之后FdOX需要被還原為Fdred繼續參與電子的傳遞，維持微生物的基礎代謝.然而，FdOX向Fdred的轉化是熱力學困難的過程，因為此電對的氧化還原電勢E（FdOX/Fdred）=-510 mV，在厭氧發酵中基本不存在可以還原FdOX的電對（E（H+/H2）=-414 mV，E（NAD+/NADH）=-300 mV）[21].為解釋FdOX還原的熱力學不利，在早期的研究中，Thauer 等[22]認為乙酰輔酶A 是這一過程的高度特異性激活劑，然而這種假設并不能從熱力學上得到支持.Kaplan和Kennedy[23]則認為厭氧微生物會避免通過ETP獲取能量，因當時的研究并未明確NADH 可以還原FdOX.

近些年來，電子分岔的發現給出了答案.Seedorf 等[24]提出了一種Clostridium kluyveri通過耦合放能反應來驅動耗能反應進行的假設.Herrmann 等[19]細化了這種代謝方式，并提出了厭氧微生物的電子分岔理論.從熱力學的角度來講，電子分岔是指一個熱力學無法自發進行的反應（ΔG＞0）被另一個熱力學自發進行的反應（ΔG＜0）所激活了，這與Seedorf 等[24]的觀點相同.從電子傳遞的角度來講，電子分岔是指來源于相同分子的一對電子（該對電子不一定都存在于同一個分子中，但必須是同一種分子）被一種黃素基電子傳遞蛋白所分開，分別置于高電位與低電位.以Clostridium kluyveri引導的碳鏈延長過程為例，NADH 在電子分岔的作用下將FdOX還原.圖6 介紹了該過程中的電子傳遞，將來自NADH 的兩個電子分別命名為e-1與e-2.在丁烯酰輔酶A 還原的過程中，Clostridium kluyveri的黃素基電子傳遞蛋白與丁酰輔酶A 脫氫酶緊密結合形成復合物，一分子的NADH 的e-1與e-2被該復合物分開，e-2進入丁酰輔酶A 脫氫酶參與丁烯酰輔酶A 的還原（E（丁烯酰輔酶A/丁酰輔酶A）=-10 mV）；e-1進入到FdOX中，之后下一個分子的NADH 將一個電子提供到FdOX中，實現FdOX向Fdred的還原（式(1)）.從氧化還原電位的角度來說，各具有-300 mV 還原力的NADH 中的一對電子，其中一個電子僅發揮了-10 mV 的還原力去還原丁烯酰輔酶A，理論上這多余的還原力無法繼續參與該對電子的反應，然而電子分岔使得該還原力轉移到了另一個電子上，使得其能發揮至少-510 mV 的還原力，將FdOX還原.

除此之外，H2也可以通過電子分岔將FdOX還原，且不需要借助脫氫酶.如圖5 所示，氫氣的e-1與e-2被分開，其中e-2電子進入電勢更高的狀態，將NAD+還原為NADH，e-1進入FdOX，下一對氫氣的電子重復此過程，則能實現FdOX的還原（式(2)）[25].

如圖5 所示，在乳酸的氧化中同樣存在電子分岔現象.這種分岔表現于乳酸向丙酮酸的轉化可以通過電子分岔進行逆向反應，NADH 中的e-1與e-2分別將丙酮酸（E（丙酮酸/乳酸）=-190 mV）與FdOX還原（式(3)）[26].

電子分岔被認為是厭氧微生物中能量代謝的重要過程.厭氧發酵過程的熱力學不利在于微生物代謝缺乏足夠的能量供給.在這種情況下，微生物需要減少能量的損耗.電子分岔可以將厭氧環境中還原型物質的還原電位進一步的轉化為ATP.從能量的角度來說，在β 氧化逆循環中，電子分岔可以從SLP 和ETP 兩個方面為微生物提供能量.以乙酰輔酶A 的代謝的為例，1 mol 乙酰輔酶A 氧化為1 mol 乙酸提供1 mol ATP，還原為丁酸提供0.5 mol ATP（此處假設不再進行β 氧化逆循環）.當電子分岔不發生時，1 mol 丁烯酰輔酶A 轉化為丁酸需要1 mol NADH，而當NADH 的電子被電子分岔分開至FdOX與丁酰輔酶A 脫氫酶時，1 mol 丁烯酰輔酶A 轉化為丁酸則需要2 mol NADH[19].因此，更大的NADH 需求量導致乙酰輔酶A 更少的轉化為丁酸，而是轉化為乙酸，從而加強了SLP 的能量供給.因該過程中電子分岔的發生導致更多Fdred的生成，由Fdred驅動的ETP 更加劇烈，ETP 的能量供給也被加強.從還原力的角度來說，電子分岔避免了還原力的浪費，例如前文中描述的，分別具有-300 mV 氧化還原電位的NADH 的一對電子，其中一個發揮了-10 mV 的還原力將丁烯酰輔酶A 還原后，該氧化還原電位差值并沒有被浪費，而是被轉移到了另一個電子中，使其能發揮-510 mV 的還原力.

在碳鏈延長過程中，電子分岔可以分為三種，第一種是導致乙酰輔酶A 氧化的丁酰輔酶A 脫氫酶-NADH-FdOX電子分岔，第二種是NAD+-H2-FdOX電子分岔，第三種是可逆的丙酮酸-NADHFdOX電子分岔.在β 氧化逆循環中對第一種電子分岔的抑制可以提高碳鏈延長效率，對第二種電子分岔的促進可能會向厭氧系統提供更強的還原力，第三種電子分岔導致的乳酸氧化受阻暫未見報道.值得關注的是，當第一種電子分岔發生時，乙酰輔酶A 被更多的轉化為乙酸，這是EEO 的一個表現.因此有理由懷疑，丁酰輔酶A 脫氫酶-NADH-FdOX電子分岔與EEO 有關，或者能調控EEO.隨著電子分岔研究的深入，尋找合適的手段去調控電子分岔的發生甚至電子的流向，可能將進一步提高己酸甚至更長鏈酸的產量.

2 影響因素

2.1 PH

pH 是微生物合成己酸過程中的重要影響因素，合理地調控會大幅度提高己酸的產量.pH 會從功能微生物的偏好范圍、產物累積以及競爭途徑三方面影響己酸的生成.下面分別就pH 對乳酸和乙醇為電子供體開展碳鏈延長的影響進行討論.

2.1.1 pH 對以乙醇為電子供體的碳鏈延長的影響

Clostridium kluyveri是一種研究最多，應用最廣的以乙醇為底物的己酸功能菌.研究表明，Clostridium kluyveri可以在pH 為5.2～8.0 的范圍內生長[27].在β 氧化逆循環過程中，Clostridium kluyver在pH 為6.8 時獲得最高的己酸產率，pH 從7.0 到5.5 的降低會導致己酸功能菌的生長率降低約40%[28-29].San-Valero 等[30]以Clostridium kluyveri為接種物，在pH 為6.8 時獲得了高達21.4 g·L-1的己酸產量.Zhang 等[31]研究了初始pH 對Clostridium kluyveri己酸生產的影響，發現當初始pH 為7.4 時己酸產量最高，當pH 下降至約6.6～7.0 時己酸開始迅速累積，最終獲得了16.5 g·L-1的己酸產量.低的pH 會導致羧酸以未解離的方式存在，累積的羧酸會造成產物抑制[32].在Yu 等[33]的研究中，以最佳醇酸比的條件進行了不同pH 下的己酸生產.結果表明，在pH 為5.5 時，己酸生產受到抑制，丁酸成為了主要的產物.Yu 等[33]認為，更多的丁酸積累是由于微生物將底物更多代謝為丁酸，而不是未解離毒性更大的己酸.在Ge 等[34]的連續流己酸生產厭氧反應器中發現，當pH 為5.5，未離解的己酸在濃度高于0.0075 mol·L-1時會對己酸功能菌造成生物毒性，當厭氧反應器中己酸質量濃度積累到5.48 g·L-1時，微生物會更多的積累丁酸，這可能也源于微生物為避免生物毒性的一種反應.從功能微生物的最適pH 范圍與產物抑制的角度來說，偏向于中性的pH 是更適合乙醇為底物的碳鏈延長的.然而，中性的pH 也有利于產甲烷菌的代謝，產甲烷競爭途徑導致了碳源的流失[35].酸性條件可以降低產甲烷菌的活性，且產甲烷菌對于未解離羧酸的耐受能力弱于己酸功能菌[36].Wu 等[15]的研究表明，大于0.005 mol·L-1的未解離的羧酸足以完全抑制產甲烷菌，此時的pH 約為5.4，甲烷產量為0，且在不添加產甲烷抑制劑的情況下仍具有一定的己酸產率（此時己酸質量濃度約為1.91 g·L-1，相比初始pH 為6.5 時產量提高約10.76%）.因此，為避免產甲烷競爭途徑的影響，許多研究在pH＜6 的條件下進行了以乙醇為底物的碳鏈延長.Vasudevan 等[37]在pH 為5.44 時獲得了1 g·L-1的己酸產率.Crognale 等[38]以餐廚垃圾提取物中的乙醇為主要電子供體進行己酸生產，當有機負荷（以化學需氧量為標準）為15 g·L-1·d-1時，pH 大部分時間保持在6 以下，最終獲得了4.8 g ·L-1的己酸產量.Wang等[39]以污泥為接種物的產己酸研究表明，pH 為6 時，產甲烷菌已經被抑制.這些在較低pH 進行的研究在不投加產甲烷抑制劑的條件下，實現了對甲烷菌的抑制，減少了對己酸功能菌的競爭并節約成本，但相應己酸產量較低.綜上所述，pH 為5.5～6 應該是一個更合適的范圍（圖7）.然而，該pH 范圍內隨著己酸產量的提高，未解離的己酸對己酸功能菌產生抑制的可能性也極高，需要開展在線提取己酸等方式從而避免產物毒性累積，但該方法會提高生產成本.在現階段添加產甲烷菌抑制劑，采用接近中性的pH 可能是提高己酸產率更好的選擇，研發經濟的產物分離技術也應是微生物合成己酸的研究方向.

圖7 幾種典型己酸功能菌的pH 工作范圍Fig.7 pH range of several typical caproic acid functional bacteria

2.1.2 pH 對以乳酸為電子供體的碳鏈延長的影響

以乳酸為底物的碳鏈延長過程中主要采用混菌為接種物，大部分己酸功能菌可適應偏酸性的pH 條件.Zhu 等[40]利用CPB6，一種新分離的瘤胃科菌種進行了己酸生產，發現其在pH 值為5.5～6 時表現最好.Kucek 等[11]以Megasphaera elsdeniiin為主要功能微生物菌群的馴化混菌為接種物，通過在線提取進行了以乳酸為電子供體的己酸連續生產.在這個連續生產過程中pH 值＜5.5，這是因為Megasphaera elsdeniiin是一種能耐受低pH 的菌種，同時在線提取也避免了未解離己酸帶來的產物抑制.偏酸性的條件同樣可以抑制乳酸-丙烯酸酯途徑[41].丙酸桿菌已被證明能在pH 值為6.5～7 時從乳酸中產生乙酸和丙酸，在pH值＜6 時丙酸桿菌的生長速率迅速下降[42].在Xie等[43]以乳酸為電子供體，丁酸為電子受體的研究中，采用低濃度乳酸與低pH（pH 值為5.0）的調控策略，有效抑制了乳酸-丙烯酸酯途徑.Candry等[41]配置了與實際廢水相同構成，把糖類物質替換成乳酸的模擬廢水，并接種了馴化的混菌.結果表明，pH 值＞6 時乳酸-丙烯酸酯途徑為主導途徑，導致己酸產量極低；pH 值＜6 時中雖然無法完全抑制乳酸-丙烯酸酯途徑，但己酸產量明顯提升.Candry 等[41]從熱力學角度解釋了pH 對乳酸-丙烯酸酯途徑的影響，接近中性的pH 會使微生物通過乳酸-丙烯酸酯途徑獲得更高的能量，隨著pH的降低，微生物生成己酸將獲得更多的能量.在Nzeteo 等[44]以餐廚垃圾滲濾液中的乳酸為主要電子供體，Clostridiumsp.為主要己酸功能菌的己酸生產研究中，pH 降至5.5 時己酸生成速率下降，pH 降至5.0 時己酸生成被完全抑制.因此，以乳酸為底物進行碳鏈延長時，控制pH 在5.0～6.0 的范圍既可保證己酸的生產，又可以抑制乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭.然而，由于混菌體系的復雜性，也存在例外.Zhu 等[5]利用實際廢水中的乳酸生產己酸，接種物為馴化的酒窖窖泥，其中Clostridium IV是馴化混菌中的主要己酸功能菌.在pH 值為6.0～6.5 的條件下，且不進行在線提取時，最高己酸生產速率達到2.97 g·L-1·d-1.與Kucek 等[11]的研究不同的是，在pH 值＞6 的情況下，Zhu 等[5]的反應器中未出現乳酸-丙烯酸酯途徑的痕跡，原因可能是氧化乳酸的菌群與進行β 氧化逆循環的菌群不同，即Clostridium IV負責碳鏈延長，而其他菌群負責乳酸的氧化，不同菌群的相互協作使乳酸-丙烯酸酯途徑受到抑制.在Gao 等[45]的釀酒廢水產己酸的研究中，接種物同樣為馴化的窖泥，但并未實時調控pH，pH 從6.3 降至5.2，期間每克揮發性固體獲得了0.20 g 的己酸，且無乳酸-丙烯酸酯途徑的干擾，主要功能菌為Caproiciproducens，這個過程中也可能存在不同菌群的相互協作.綜上，以乳酸為電子供體，進行在線提取己酸時，應盡量控制pH 在5.0～6.0 的范圍內，這樣可避免乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭（圖7）.除此之外，以混菌為接種物，調控不同菌群的相互協作，可能同樣會抑制乳酸-丙烯酸酯途徑，同時強化己酸生產.

2.2 頂空氣體

CO2與H2作為微生物合成己酸過程中的兩種典型頂空氣體，可以參與到β 氧化逆循環中從而提高己酸的產量，明確CO2與H2的作用機理至關重要.

在碳中和、碳達峰的背景下，CO2作為一種合適的資源化底物，其在微生物合成己酸中的應用成為了研究的熱點.CO2從三個方面影響己酸的生產.第一個方面，Clostridium kluyveri可通過化能自養代謝將CO2用于合成自身的蛋白質[46].Tomlinson 和Barker[47]以乙酸鹽和CO2為底物培養Clostridium kluyveri，利用同位素示蹤法確認Clostridium kluyveri細胞內部25%的碳來自CO2，11%的碳來自于乙酸鹽.第二個方面，CO2可以通過還原乙酰輔酶A 途徑轉化為乙酰輔酶A，或進一步被氧化為乙酸，從而參與β 氧化逆循環.Roghair 等[16]研究了CO2濃度負荷對碳鏈延長過程中乙醇消耗的影響，結果表明高CO2濃度負荷（每升底物每天通入CO22.5 L）下己酸產量為10.8 g ·L-1·d-1，低CO2濃度負荷（每升底物每天通入CO20.5 L）下己酸產量為2.9 g ·L-1·d-1.San-Valero 等[30]通過碳 酸氫鈉調節pH，向發酵液中補充了CO2，己酸產量從18.3 g·L-1提升到21.4 g·L-1.第三個方面，高CO2濃度負荷會造成EEO 的發生，導致乙酰輔酶A 更多的轉化為乙酸，而不是參與己酸的合成.在Roghair等[16]的研究中，高CO2濃度負荷使EEO 的影響從16%提升到了29%.Grootscholten 等[35]將每升底物的CO2的濃度負荷從2.4 L·d-1提高到4.8 L·d-1，未觀察到碳鏈的延長，且EEO 現象更加嚴重.因此，提供適量的CO2有助于微生物合成己酸，但濃度負荷不宜過高，較低的濃度負荷會更高效地利用碳源轉化為己酸.

H2作為還原性物質，可以降低發酵體系的氧化還原電位，同時可以被厭氧微生物利用，作為電子供體與CO2通過還原乙酰輔酶A 途徑生成乙酰輔酶A 和乙酸，參與β 氧化逆循環.在pH 值為7，溫度為25 ℃時，該反應ΔG=-94.96 kJ·mol-1，反應易于進行[48].除此之外，H2分壓也從多個方面影響著己酸的合成.首先，H2可以通過與CO2的反應，或者本身的分壓來降低CO2的分壓，從而避免EEO[49].但是過高的H2分壓將會導致β 氧化逆循環的能量供給不足[18].這來源于：（1）過高的H2分壓使得乙酰輔酶A 向乙酸的轉化受阻，進而影響SLP 提供ATP 的過程；（2）過高的H2分壓抑制了Ech 上發生的H+還原，導致ETP 提供ATP 的過程受影響.盡管該情況下，微生物仍可通過前文所提及的電子分岔（如NAD+-H2-FdOX電子分岔，通過H2將FdOX還原，繼而進行ETP）將H2的還原力轉化為ATP，從而進行碳鏈的延長[24].但這種轉化的完成將延長發酵時間，造成己酸合成效率的降低.Stams[50]通過熱力學計算，得出H2分壓＜10 kPa 時可避免高分壓的負面影響.過低的H2分壓同樣會抑制己酸的合成[13].當H2分壓＜10-2kPa 時，H+通過ETP 合成一個ATP 所需要的能量大于一個ATP釋放的能量，造成凈能量損失，使β 氧化逆循環的能量供給受到抑制[51].這種情況下微生物可能會通過脂肪酸β 氧化獲取能量，導致碳鏈縮短[35].低H2分壓主要由氫營養型產甲烷菌對H2的消耗導致.González-Tenorio 等[52]利用有機廢物為底物，CO2與H2作為頂空氣體進行了己酸的生產，在H2被快速代謝時檢測到了甲烷的生成，其分壓最高可達頂空氣體的約25%.通過調整pH 或添加產甲烷抑制劑可以抑制產甲烷菌的活性，解決H2分壓過低導致的己酸合成受到抑制的問題[50].Grootscholten 等[35]認為，微生物合成己酸過程中應保持H2分壓＞3 kPa，以此來保證對EEO 的抑制.綜上所述，β 氧化逆循環中H2分壓應保持在3 kPa到10 kPa 之間.

上述關于H2分壓的討論主要基于以乙醇為電子供體的己酸合成過程.當電子供體為乳酸時，過高的H2分壓（H2分壓＞10 kPa）可能將不再造成上述不良影響.在Wu 等[32]以乳酸為電子供體的產己酸研究中，相比不添加H2，H2分壓為150 kPa 時乳酸-丙烯酸酯途徑被抑制，中鏈脂肪酸產率提高約1.65 倍.盡管高H2分壓可能抑制ETP 過程從而造成能量供給障礙，但Wu 等[32]的研究中長達30 d 的發酵時間足夠使微生物將H2的氧化還原電位轉化為能量以供給自身生長代謝，這可能是盡管ETP 被抑制，但己酸產率仍然提高的原因.因此，在以乳酸為電子供體進行碳鏈延長時，提高H2分壓并適當延長發酵時間，可抑制乳酸-丙烯酸酯途徑并提高己酸產量.

2.3 生物電化學系統強化己酸合成

生物電化學系統（Bioelectrochemical system，BES）可以通過外加陰極增強發酵過程的還原驅動力，在微生物合成己酸中的應用成為了近年來研究的熱點[53].2013 年，Eerten-Jansen 等[54]僅以乙酸為底物，在BES 中將乙酸還原為己酸，己酸產量接近0.8 g·L-1.該研究中并沒有傳統的電子供體（如乙醇和乳酸），表明生物陰極可以作為電子供體參與β 氧化逆循環.該研究提出了兩種外加陰極電子的去向，其一是電子通過電解水轉移到氫氣中，然后還原乙酸為乙醇；其二是電活性微生物在陰極上直接將電子轉移入細胞內，同時結合游離的H+將乙酸還原為乙醇.這兩種電子流動皆表明該研究中的己酸仍來源于乙醇與乙酸驅動的β 氧化逆循環，而非構建了新的己酸合成途徑.但該項研究提供了一種利用BES 生產己酸的技術，使人們意識到BES 強化己酸合成的可能性.Andersen等[55]發現對發酵液通電可以促進乳酸的碳鏈延長，己酸產量提高了3%，這項研究說明BES 強化了以乳酸為電子供體的己酸生產.Jiang 等[56]以乙醇與乙酸為底物，研究了生物陰極對碳鏈延長過程的影響.結果表明，與開路控制相比，BES 中產物的己酸電子選擇性提高了約28%，這項研究說明BES 強化了以乙醇為電子供體的己酸生產.Cheng等[57]對乙醇與乙酸驅動的碳鏈延長進行了深入研究，評估了不同乙醇乙酸比例下BES 對己酸產量的提升，并證明己酸產量隨著醇酸比的升高而升高.在醇酸比為3∶1 時，相比開路系統，BES 提高了26.1%的己酸濃度.

對CO2的固定是近些年來BES 強化己酸合成研究的重點.早期的研究發現BES 能將CO2通過厭氧發酵固定為甲烷和乙酸，這來源于生物陰極對還原乙酰輔酶A 途徑的強化[58-59].Raes 等[60]以CO2與乙酸為底物進行BES 混合微生物培養，發現高電流密度會顯著增加丁酸鹽的累積，并生產微量的己酸.這表明生物陰極促進了CO2的還原乙酰輔酶A 途徑，并且CO2通過生物陰極參與了碳鏈延長.近些年來，在BES 中以CO2為底物進行己酸生產受到了重視[61].Igor 等[62]以CO2為唯一碳源，在 BES 中進行了碳鏈的延伸，中鏈脂肪酸產量達到1.2 g·L-1.然而，CO2作為唯一碳源，其既要通過還原乙酰輔酶A 途徑轉化為乙酰輔酶A 作為電子供體，又要進一步被氧化為乙酸作為電子受體，這可能會造成底物供給的不足.因此，應該考慮將CO2與其他物質協同發酵進行己酸生產.Jiang 等[63]使用CO2和乙醇為底物進行了己酸的生產，外加陰極使產物中的己酸電子回收效率從32.22%提高到91.47%.乙醇的添加彌補了電子供體的不足，克服了以CO2為唯一碳源時存在的電子供體或電子受體缺少的問題，且BES 同時促進了CO2的還原乙酰輔酶A 途徑與乙醇為電子供體的碳鏈延長.

綜上，BES 強化己酸合成技術具有十足的潛力，與自然發酵相同的是，BES 也面臨著產甲烷抑制、熱力學瓶頸以及底物的供給等問題[61].不同的是，BES 對β 氧化逆循環過程的促進機理尚不清晰，且缺乏BES 對乳酸為電子供體的碳鏈延長的影響的研究[64].結合近些年來在厭氧微生物體內，尤其是Clostridium kluyveri內發現的電子分岔現象，可能會將外加電勢與胞內的鐵氧化還原蛋白的氧化還原電勢結合起來，這值得深入的研究.從結構優化的角度出發，未來的研究可以通過調整電解池的參數、修飾電極以及優化產物的在線提取來提升己酸產率[65].同時，可以將基因工程、代謝工程與BES 強化己酸合成結合，提高微生物的工作效率[66].從應用的角度出發，以實際廢水、廢氣為底物的BES 強化己酸合成也應是重點研究方向[46].

3 結論與展望

本文介紹了碳鏈延長過程中還原酶與能量的供給關系，分析了pH、頂空氣體對碳鏈延長的影響機理并提供了相應策略.在β 氧化逆循環過程中，電子供體的氧化為電子受體的還原提供了還原酶，并存在三種能量合成途徑：SLP、ETP，以及將氧化還原電位轉化為能量的第三種能量代謝方式——電子分岔.調控電子分岔的發生以及電子的流向，可能將進一步提高己酸的產量.對以pH與頂空氣體為代表的影響因素分析表明：（1）pH值＜6 時可以同時實現對產甲烷途徑與乳酸-丙烯酸酯途徑的抑制，需要研究低成本的底物分離技術，避免己酸的毒性抑制并提高產率.現階段添加產甲烷菌抑制劑，采用接近中性的pH 可能是提高己酸產率更好的選擇；（2）CO2作為底物參與微生物合成己酸有助于碳固定，但應避免過高CO2分壓引起的EEO；（3）合適的H2分壓應保持在3 kPa到10 kPa 之間，以抑制乙醇過度氧化的發生，同時避免電子供體氧化的熱力學不利；（4）生物電化學強化己酸合成技術具有巨大的潛力，未來應深入研究其對β 氧化逆循環過程的影響機理，并以實際廢水廢氣為底物的開展己酸生產.