葡萄籽原花青素對斷奶仔豬背最長肌抗氧化能力與肌纖維類型的影響

金宏莉, 孫 露, 張瀚文, 陳亞楠, 張 昊,王 恬

(南京農業大學 動物科技學院，江蘇 南京 210095)

近年來生活水平不斷提高、飲食觀念逐漸轉變，人們對畜產品的要求越來越高。肌纖維是構成肌肉的基本單位，肌肉中肌纖維類型組成顯著影響宰后肌肉的顏色、pH、系水力、嫩度、多汁性及風味等肌肉品質性狀，因此肌纖維的類型及組成與肌肉品質的優劣密切相關[1]。肌纖維的分類方法很多，目前最為廣泛認可、準確性高的肌纖維分類方法即按照肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)亞型的多樣性進行分類，成年哺乳動物骨骼肌可表達4種異構體，分別為MyHC Ⅰ(慢速氧化型)、MyHC Ⅱa(快速氧化型)、MyHC Ⅱx(中間型)、MyHC Ⅱb(快速糖酵解型)型[2-4]。在妊娠的前90 d，豬機體肌纖維數目就已穩定，但其肌纖維類型可受出生后年齡、環境、營養、運動、應激及激素等因素影響而發生轉變[5]。MyHC亞型轉化次序為Ⅰ型?Ⅱa型?Ⅱx型?Ⅱb型。通過改變肌纖維類型來改良肌肉品質已成為現今及未來肌肉品質改良研究的熱點。

原花青素(proanthocyanidins)，其化學式為C30H26O13，相對分子質量為594.52，是一種主要存在于葡萄籽、花生衣和高粱皮等植物中的多酚類化合物[6-7]。原花青素分子中含有多個活性較強的酚羥基, 在動物體內被氧化后釋放H+，與自由基及氧化物發生競爭性結合，從而保護脂質不被氧化，阻斷自由基鏈式反應，具有很強的氧自由基清除能力和抗氧化活性，故備受關注[7]。目前，原花青素已廣泛應用到食品、營養等多個領域[8-9]。王友良等[10]按照50、100和150 mg/kg的劑量給反式脂肪酸(trans fatty acids,TFAs)攻毒小鼠飼喂原花青素，結果發現相比TFAs應激對照組，原花青素緩解組肝臟損傷程度均得到明顯改善，說明原花青素對TFAs攻毒小鼠的肝臟損傷具有良好的保護作用。

目前關于原花青素調節豬肌肉發育的報道較少，其潛在作用機制也尚不清楚。因此，本試驗通過在日糧中添加GSP，解析GSP對仔豬斷奶后早期階段肌肉抗氧化能力、肌纖維類型及關鍵基因表達水平的影響，為了解GSP生物學作用及其在仔豬生產中的應用效果提供試驗證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GSP(純度95%)購自天津尖峰天然產物研究開發有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選取遺傳背景與體重相近、健康狀況良好的雄性斷奶仔豬72頭，21日齡斷奶，隨后將其隨機分為2個處理組，每組6個重復，每重復6頭仔豬。試驗期間，對照組飼喂基礎日糧，試驗組飼喂添加500 mg/kg GSP的試驗日糧，共計飼喂14 d，每天由專人定時飼喂仔豬，期間自由飲水?；A日糧組分詳見表1。

表1 基礎日糧配方及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient level of the basal diet (air-dry basis)

1.3 飼養管理

本試驗在安佑集團江蘇太倉種豬場展開。試驗期間，仔豬自由飲水，每日分別于06:00、09:00、11:00、14:00、17:00定時喂飼日糧。免疫程序按常規進行。

1.4 樣品采集與處理

試驗結束時，每個重復隨機選擇1頭仔豬，將其麻醉后頸動脈放血處死，在胴體第10根肋骨處采集背最長肌樣本，大小為 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱，用于制備冰凍切片，進行肌纖維類型觀察。另外，收集大約2 g背最長肌樣本，液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于測定背最長肌抗氧化指標和相關基因mRNA表達水平。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 肌肉抗氧化指標測定 組織勻漿制備：稱取100 mg背最長肌凍存樣本，按1∶4倍體積比加入0.86%生理鹽水，在冰水浴中用高速勻漿機勻漿至離心管中無明顯塊狀物。勻漿完成后，4 ℃條件下于3 000 g離心15 min，取上清液分裝并置于-20 ℃冰箱中保存。采用BCA法測定蛋白濃度，使用南京建成生物工程研究所商業試劑盒，測定背最長肌中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性以及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.5.2 肌肉抗氧化關鍵基因表達 使用Trizol試劑提取斷奶仔豬背最長肌總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，核酸濃度儀檢測RNA濃度和純度。使用Takara(遼寧，大連)反轉錄試劑盒獲取單鏈DNA (cDNA)作為實時熒光定量PCR模板。根據GenBank提供的基因序列，使用Primer軟件設計目的基因：核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)、血紅素氧化酶1(heme oxygenase 1,HO1)、還原型輔酶/醌氧化還原酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinone oxidoreductase 1,NQO1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的引物序列，引物信息如表2所示。采用Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)StepOnePlusTMReal-Time PCR System進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系為10 μL，包括5 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物、0.2 μL 50×ROX Reference Dye 1、2.4 μL滅菌超純水和2 μL cDNA模板。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。溶解曲線分析條件按系統推薦設置。GAPDH為內參基因，結果以2-ΔΔCt法進行表示。

1.5.3 肌纖維類型觀察 將用于組織化學分析的背最長肌樣品先從-80 ℃冰箱轉入-30 ℃冰箱，逐步回溫然后沿肌纖維垂直方向制作厚度為10 μm的冰凍切片，經過固定、孵育、氯化鈷置換、硫化銨顯色等步驟后進行鏡檢。Ⅰ型肌纖維呈淺灰色或無色，Ⅱ型肌纖維呈深灰色或黑色，在顯微鏡下觀察肌纖維，拍照并統計2種肌纖維類型比例。

1.5.4 肌纖維類型關鍵基因表達 使用Trizol試劑提取斷奶仔豬背最長肌總RNA，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸濃度儀檢測RNA的濃度和純度。使用反轉錄試劑盒獲取cDNA作為實時熒光定量PCR的模板。根據GenBank提供的基因序列，使用Primer軟件設計目的基因MyHCⅠ、MyHCIIa、MyHCⅡx、MyHCⅡb、生肌決定因子1(myogenic differentiation 1,MyoD1)和內參基因GAPDH的引物序列，引物信息如表2所示。采用Applied Biosystems公司(Foster City, CA, USA)StepOnePlusTM Real-Time PCR System進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Tag、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye、6.8 μL滅菌超純水和2 μL cDNA模板。PCR反應條件為：在95 ℃下預變性30 s，在95 ℃下變性5 s，在60 ℃下退火30 s，共40個循環。溶解曲線分析條件按系統推薦設置。GAPDH為內參基因，結果以2-ΔΔCt法進行表示。

表2 實時熒光定量PCR引物序列信息Table 2 Primer sequence information of real-time quantitative PCR

1.6 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 斷奶仔豬肌肉抗氧化指標

由表3可知，與對照組相比，試驗組仔豬斷奶后背最長肌GSH-Px、CAT無顯著變化(P>0.05)；與對照組相比，屠宰前飼喂14 d GSP顯著提高了仔豬斷奶后早期背最長肌中T-AOC、T-SOD活性，顯著降低了背最長肌中MDA含量(P<0.05)。

表3 葡萄籽原花青素對斷奶仔豬背最長肌抗氧化指標的影響Table 3 Effects of grape seed proanthocyanidins on theantioxidant parameters of longissimus dorsi musclein the weaned piglets

2.2 斷奶仔豬肌肉抗氧化關鍵基因的表達

由表4可知，與對照組相比，試驗組仔豬斷奶后背最長肌NRF2、NQO1和GPX1基因mRNA表達量均無顯著差異(P>0.05)。連續飼喂14 d GSP顯著提高了斷奶仔豬背最長肌HO1、SOD1和SOD2基因的mRNA表達量(P<0.05)。

表4 葡萄籽原花青素對斷奶仔豬背最長肌抗氧化關鍵基因表達的影響Table 4 Effects of grape seed proanthocyanidins on theexpression of key antioxidant genes in the longissimus dorsimuscle of weaned piglets

2.3 斷奶仔豬肌纖維類型組織學觀察結果

仔豬斷奶后背最長肌三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase,ATPase)酶染色結果見圖1。由表5可知，屠宰前飼喂14 d GSP素顯著提高了斷奶仔豬背最長?、裥图±w維比例(P<0.05)，顯著降低了Ⅱ型肌纖維比例(P<0.05)。

圖1 仔豬斷奶后早期背最長肌ATP酶染色圖(100×)Fig. 1 ATPase staining analysis for the longissimusdorsi of weaned piglets (100×)

表5 葡萄籽原花青素對斷奶仔豬背最長肌肌纖維比例的影響Table 5 Effects of grape seed proanthocyanidins on the musclefiber types of longissimus dorsi muscle in the weaned piglets %

2.4 斷奶仔豬背最長肌肌纖維類型及相關基因的表達

由表6可知，與對照組相比，試驗組仔豬斷奶后背最長肌MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx基因的mRNA表達量均無顯著差異(P>0.05)，屠宰前飼喂14 d GSP顯著提高了背最長肌中MyHCⅠ基因和MyOD1基因的mRNA表達量(P<0.05)。

表6 葡萄籽原花青素對斷奶仔豬背最長肌肌纖維類型和肌肉生長相關基因表達的影響Table 6 Effects of grape seed proanthocyanidins on theexpression of genes related to muscle fiber types and growthin the longissimus dorsi muscle of weaned piglets

3 討 論

在生豬生產中，受營養、環境及心理等因素影響，仔豬在斷奶后早期易發生氧化應激，引發抗氧化能力下降、免疫力降低、腸道功能受損、腹瀉率和死亡率升高等一系列負面問題[11]。因此，在斷奶仔豬日糧中添加適宜的抗氧化劑能有效減輕機體氧化應激風險，改善仔豬健康狀況。在敵草快誘導的急性氧化應激模型中發現，原花青素能夠提高仔豬肝臟抗氧化能力，緩解其在應激狀態下生長受阻的現象[12]。然而，本試驗通過對生長性能的統計發現，日糧添加GSP并未明顯影響仔豬在斷奶后2周內的日增重、采食量或飼料效率(未發表數據)，這與前人研究結果并不一致，其原因可能與原花青素的種類和添加量、受試仔豬的生長階段及氧化應激的劇烈程度等因素有關。

本試驗發現，日糧添加500 mg/kg GSP顯著提高了斷奶仔豬背最長肌T-AOC和T-SOD活性，表明GSP可有效提高仔豬肌肉抗氧化能力。T-AOC可反映組織抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平。SOD是抗氧化防御系統的重要成員之一，負責將毒性較強的超氧陰離子轉化為毒性較弱的過氧化氫，后者可被GSH-Px或CAT轉化為無毒的水分子[13]。與此相似，在大鼠上的研究發現，口服原花青素后大鼠肝臟組織SOD活性明顯增強，這或與原花青素激活機體抗氧化防御體系的作用有關[14]。添加適宜劑量的原花青素也可有效提高美洲鰻鱺肝臟SOD活性，提高肝臟抵抗氧化損傷的調節能力[15]。另外，本試驗結果表明，連續飼喂14 d含有GSP的試驗日糧可有效降低斷奶仔豬背最長肌MDA含量。MDA是脂質過氧化反應的主要產物，其含量與氧化應激程度呈正相關性[16-17]。因此，上述結果表明GSP可有效提高斷奶仔豬肌肉抗氧化能力，改善肌肉脂質過氧化程度。

NRF2是細胞抗氧化防御體系的關鍵調節因子，在抵抗氧化應激及修復組織損傷等方面發揮著重要作用[18]。研究發現，GSP能夠通過激活NRF2通路以促進NQO1、HO1及SOD2等下游抗氧化基因的轉錄表達[19]。本試驗結果顯示，飼喂GSP的試驗組背最長肌HO1、SOD1和SOD2 mRNA表達豐度較對照組均顯著提高，與前人研究結果基本一致。HO1在各組織器官均有表達，可通過催化血紅素降解，產生具有細胞保護作用的活性物質，具有抗氧化、免疫調節及抗凋亡等作用[20-21]。SOD1和SOD2分別編碼位于細胞質的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)和位于線粒體內的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)，其表達上調也一定程度地解釋了GSP試驗組肌肉T-SOD活性升高的現象。另外，蘇凡等[22]在缺血再灌注損傷模型中發現，GSP干預可上調HO1表達，促進抗氧化反應和損傷修復。孫明等[23]也發現GSP處理能夠提高細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)蛋白磷酸化水平，進而上調了NRF2和HO1蛋白表達水平。上述結果表明，GSP可通過激活NRF2介導的抗氧化防御機制，以改善斷奶仔豬背最長肌抵抗氧化應激的能力。

肌纖維是骨骼肌的基本結構單位，其組成及類型是影響宰后肌肉品質的重要因素。有研究表明，肉的嫩度、色澤與Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維含量呈正相關，而與Ⅱb型肌纖維含量呈負相關。因此，Ⅱb型肌纖維數量越多，肉品質越差[24]。本試驗中，肌纖維染色結果表明，連續飼喂14 d含有GSP的試驗日糧顯著提高了仔豬斷奶后早期背最長?、裥图±w維比例，降低了Ⅱ型肌纖維比例，說明GSP可能起到改變肌纖維組成的作用。通常，不同類型肌纖維的數量均與其相應的MyHC編碼基因表達水平呈正相關性[25]。本試驗結果表明，試驗組仔豬背最長肌MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡxmRNA表達水平與對照組均無顯著差異，但MyHCⅠ mRNA表達量顯著提高，這與染色結果基本一致。另外，本試驗結果表明，試驗組背最長肌MyOD1 mRNA表達量較對照組顯著提高。MyOD1又稱生肌決定因子，可將多種其他類型的細胞轉化為成肌細胞，并促進其分化為成熟的肌纖維，是控制骨骼肌生長的關鍵調節因子之一[26]。因此，上述結果提示，在斷奶仔豬日糧中添加500 mg/kg GSP具有改善肌纖維類型與促進肌肉生長的潛力。

4 結 論

綜合以上結果可知，日糧添加500 mg/kg水平的GSP具有改善斷奶仔豬背最長肌抗氧化能力與提高Ⅰ型肌纖維比例的積極作用。