與哺乳動物配子發生相關的ncRNA研究進展

陳薪全，甘麥鄰，沈林園，趙 葉，陳 蕾，張順華，牛麗莉，朱 礪

(四川農業大學 動物科技學院，四川 成都 611 30)

哺乳動物的配子包括精子和卵子，兩者結合形成受精卵，而受精卵是個體發育的起點。原始生殖細胞是精子和卵子的前體細胞，其起源于原始外胚層，經有絲分裂后數量增加，并聚集于中胚層和內胚層附近，隨后遷移到生殖嵴，周圍的體細胞微環境使其分化為精原細胞或卵原細胞，再經減數分裂產生精細胞或卵細胞。精細胞和卵細胞進一步成熟成為精子和卵子，成熟的精子獲能后在輸卵管壺腹部與卵子結合，完成受精過程，形成受精卵，再進一步發育形成早期胚胎，并最終形成個體。

配子發生是一個復雜的生物學過程，受到許多因素的調控，對這些調控作用的研究有利于我們增強對配子發生過程的理解。ncRNA是一類不直接發揮作用，但可以通過轉錄水平、轉錄后水平和表觀遺傳水平發揮作用的RNA分子，是當前生物領域研究的熱點之一。本文歸納了ncRNA在配子發生過程中的相關研究，對ncRNA在配子發生、早期胚胎發育和不孕不育癥中的調控作用進行了總結，以期為進一步闡明ncRNA在配子發生和早期胚胎發育過程中的調控機制，并為不孕不育癥的診斷和治療提供參考。

1 ncRNA的調控機制

人類基因組研究發現約2%的核酸序列用于編碼蛋白質，其余的核酸序列屬于ncRNA，這些ncRNA曾被認為是“基因組噪聲”，不具有生物學功能，隨著研究的深入，ncRNA的生物學功能被人類逐一揭示。ncRNA是一類沒有蛋白編碼能力的RNA分子，在許多生命活動中起重要作用，如調控細胞增殖、分化等過程。近年來，隨著對ncRNA研究的不斷深入，ncRNA在動物體內的功能調控機制逐漸被揭示，ncRNA的發現及其調控功能的闡明對現代生命科學具有重要意義。目前研究較多的ncRNA包含長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、microRNA(miRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、環狀RNA(circular RNA，circRNA)，不同的ncRNA的特征、調控機制各有不同(表1)。

表1 5個ncRNA的功能調控機制Table 1 The functional regulation mechanism of 5 ncRNAs

2 與精子發生相關的ncRNA

哺乳動物的精子發生位于睪丸曲細精管中，曲細精管中的精子并不具備受精能力，精子還要在附睪內進一步達到功能成熟，并在雌性生殖道內獲能才具有使卵子受精的能力。精子發生是一個連續且復雜的細胞增殖、分化過程，該過程受到一系列精確的調控。近年來，研究者們利用測序分析技術挖掘出許多參與精子發生過程的ncRNA(表2)。

表2 ncRNA調控精子發生Table 2 ncRNA regulates spermatogenesis

2.1 參與精子發生過程的lncRNA

研究表明，在哺乳動物雄性生殖細胞中存在大量的lncRNA。Arun等[14]研究發現lncRNA mrhl(meiotic recombination hot spot locous)能夠通過它的蛋白伙伴Ddx5(DEAD-box helicase 5)對小鼠精原細胞Wnt信號產生負調控作用，當mrhl表達下調時，激活Wnt信號靶基因的轉錄，調節下游相關基因的表達，表現為促進精原細胞增殖、抑制分化。此外，Anguera等[15]發現lncRNA Tsx(Testis-specific X-linked)在小鼠精原細胞中高表達，敲除Tsx后發現精原細胞生長遲緩、分化差、細胞死亡率升高，說明Tsx在減數分裂過程中起重要作用，與精子發生密切相關。

2.2 miRNA對精子發生過程的調控

miRNA通過與靶mRNA 3'非編碼區(untranslated regions，UTR)完全或不完全的互補結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，在轉錄后水平負調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡。通過高通量測序研究發現在精原細胞、精母細胞和精細胞中有大量的miRNA選擇性表達。He等[16]研究發現miR-20和miR-106a在小鼠精原干細胞中優先表達，進一步利用miRNA模擬物和抑制劑進行體外和體內功能檢測，結果表明miR-20和miR-106a是精原干細胞更新的關鍵。還有一些miRNA被報道參與精原干細胞的的增殖和凋亡，Li等[17]發現miR-204通過靶向Sirt1(silent informa-tion regulator 1)調控奶山羊精原干細胞的增殖，Niu等[18]研究發現miR-34c在P53下游表達促進奶山羊精原干細胞凋亡。上述研究表明miRNA參與了維持精原干細胞的自我更新，調控精原干細胞的增殖和凋亡，提示miRNA對精子發生過程具有重要的調控作用。

2.3 piRNA參與精子發生過程

piRNA通過抑制轉座子活性，有效維持了生殖細胞基因組的穩定性，保證了精子的正常發生。Piwi蛋白首次在果蠅中被發現，它對生殖干細胞干性的維持起重要作用[19]。Piwi蛋白家族主要有3個成員Miwi、Miwi2和Mili，piRNA通過與它們結合形成piRNA復合物在精子發生過程中發揮作用。Girard等[20]發現Piwi蛋白家族是無脊椎動物干細胞自我更新和雄性生殖細胞發育所必需的。小鼠的Piwi蛋白在睪丸中高表達，Miwi和Mili蛋白出現在小鼠精子發生的不同階段[21]。Kuramochi-Miyagawa等[22]研究發現，在小鼠中敲低Mili后，粗線期精母細胞精子發生受阻，精細胞不能發生形變形成成熟的精子，Chuma等[23]研究發現，在小鼠中敲低Miwi2后，小鼠減數分裂受阻，生殖細胞數量顯著減少。這提示piRNA對正常的精子發生過程具有調控作用。

2.4 其他ncRNA對精子發生的調控

小干擾RNA(siRNA)可以誘導轉錄后基因沉默，這種現象廣泛存在于生物體內，RNA干擾是研究基因功能和基因治療的一個重要工具。Song等[24]在小鼠雄性生殖細胞中發現有大量的內源性siRNA(endo-siRNA)表達。Zhang等[25]在豬的精子細胞中發現了一種轉座子Line1特異性表達的endo-siRNA (L1-specific endo-siRNA)，它通過抑制Line1反轉錄活性來抑制早期胚胎發育。和內源性siRNA一樣，外源RNA干擾技術也是研究基因功能和基因治療的一個重要工具。目前，RNA干擾技術在生物學領域的運用十分常見。在小鼠精子發生的早期階段，運用RNA干擾技術沉默Gfra1(glial cell line derived neurotrophic factor α1)基因，可以促進精原干細胞分化為精原細胞，而沉默Nodal基因則會抑制精原干細胞分化[26]。上述研究表明在雄性生殖細胞中存在大量的內源性siRNA，敲低某些基因的表達后，精原干細胞的分化、精子的發育和釋放受到影響，這提示我們siRNA在精子發生過程中發揮重要作用。

3 與卵子發生相關的ncRNA

哺乳動物的卵子發生位于卵巢內，卵子發生包括增殖期、生長期和成熟期。在生長期結束之后，卵母細胞準備進行減數分裂，但卵母細胞不會自動進入成熟期，而是停滯在減數分裂前期I，在促卵泡激素、促黃體生成素等激素的共同作用下完成成熟過程。卵子發生和精子發生一樣是一個連續且復雜的細胞增殖、分化過程，越來越多的研究發現ncRNA在卵子發生過程中參與調控雌性生殖細胞的增殖、分化等過程(表3)。

表3 ncRNA調控卵子發生Table 3 ncRNA regulates oogenesis

3.1 lncRNA參與的卵子發生過程

研究表明，lncRNA參與調控雌性卵泡發育的各個階段，包括參與卵子發生、卵母細胞成熟、黃體形成和功能維持等。越來越多的研究發現lncRNA在雌性生殖細胞中發揮重要的調控作用。Wang等[27]發現在新生小鼠卵巢中GAS5(growth arrestspecific 5)高度表達，且在女性生殖干細胞和卵母細胞中也有表達，另外還發現GAS5可以促進女性生殖干細胞的增殖，促進其體外存活，抑制體外培養的女性生殖干細胞的凋亡。另外，有些lncRNA可以促進排卵、促進卵泡發育。李加宇[28]的研究結果顯示在小鼠卵巢組織中lncRNA647、lncRNA147、lncRNA274相對特異性高表達，在8周齡雌鼠右側卵巢轉染這3個lncRNAs，發現轉染lncRNA274后與對照組相比卵泡發育相關的基因表達上調，黃體數量也顯著增加。此外，lncRNA可以維持妊娠。Nakagawa等[29]發現，敲除小鼠的Neat1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1)后，小鼠的卵巢黃體形成嚴重受損，血清中孕酮水平降低。上述研究表明lncRNA可以調控雌性生殖干細胞的增殖、凋亡，促進卵泡排卵、發育，對黃體形成和妊娠維持起重要作用，這也提示我們lncRNA在卵子發生過程中發揮重要的調控作用。

3.2 miRNA對卵子發生的調控

隨著高通量測序技術的發展和應用，在多種哺乳動物中成功構建了miRNA譜，發現不同物種之間的miRNA存在表達特異性。Hossain等[30]發現在多個物種的卵巢中存在miRNA群，如miR-21，miR-126，miR-143等，這些miRNA可以通過調控激素合成影響卵泡發育，例如，在豬卵泡顆粒細胞中過表達miR-375后雌二醇的合成降低。另外，Xu等[31]發現在卵丘細胞中miR-378通過抑制芳香化酶表達使雌二醇的生成降低，過表達miR-378后，卵丘細胞的增殖受到阻礙，與增殖相關的基因(hyaluronate synthase 2、prostaglandin-endoperoxide synthase 2)和與卵母細胞成熟相關的基因(connexin 43、serum pepsinogen ratio)的表達降低。此外，miRNA的表達會影響卵母細胞發育。Lei等[32]發現將小鼠合成miRNA的關鍵基因Dicer敲除后，miRNA的表達受到限制，卵母細胞發育停滯。上述研究表明miRNA在卵巢中表達，可以通過調控激素合成間接調控卵泡發育，miRNA的表達對卵母細胞的正常發育是非常重要的。

3.3 piRNA對卵子發生的影響

piRNA最早在果蠅中發現，隨后在線蟲、斑馬魚、小鼠等動物中研究了它的生物學功能。AKKOUCHE等[33]敲除果蠅胚胎發育時期的piwi蛋白后發現卵巢中與piwi簇轉錄作用有關的組蛋白H3第9位賴氨酸二甲基化(H3K9me3)減少，piRNA的形成受阻，導致卵子發生過程受阻。另外，Gou等[34]研究發現piRNA對果蠅卵泡中的fascilins基因有沉默作用，可以抑制它的表達，使得卵巢中生殖細胞和體細胞間的異常粘結恢復到正常水平。另外，piRNA蛋白可以促進雌性生殖細胞發育。Kowalczykiewicz等[35]發現在性成熟母豬的生殖細胞中有piRNA蛋白表達，并與piRNA特異性結合抑制轉錄子活性。此外，Huntriss等[36]對女性生殖細胞中piRNA途徑反轉錄轉座子沉默的關鍵基因人配子體特異性因子1(GTSF1)進行追蹤研究，發現GTSF1的表達在妊娠第8～21周時明顯增加，卵原細胞進入減數分裂原始卵泡形成的第一階段。上述研究表明piRNA參與了卵子發生過程并對該過程起重要調控作用。

3.4 其他ncRNA對卵子發生的調控

circRNA是一種新型RNA，它不同于傳統的線性RNA，它是由基因內反向剪切作用形成的，大多數circRNA由外顯子形成，少數circRNA來源于內含子及其片段。circRNA可以與miRNA競爭性結合，調控下游基因的表達。Tao等[37]在母山羊的卵泡中發現了1個新的circRNA，將其命名為circRNA_0008219，研究發現它參與了1個circRNA-miRNA-mRNA共表達調控網絡，通過熒光素酶活性測定顯示它與3個卵泡相關的miRNA作用來調節卵泡發育?，F目前關于circRNA在卵子發生領域的研究較少，深度挖掘circRNA對卵子發生的作用有很大的發展前景。

4 與早期胚胎發育相關的ncRNA

受精卵發育生長后進行卵裂，經過桑椹胚期、囊胚期、原腸胚期形成早期胚胎細胞。在哺乳動物的早期胚胎發育過程中不同作用的基因和調控因子共同參與調控胚胎的生長發育。研究發現，ncRNA可以參與調控胚胎干細胞的自我更新、分化等過程以及調控不育癥相關疾病的發生(表4)。

表4 ncRNA調控早期胚胎發育及不育癥相關疾病Table 4 ncRNA regulates early embryonic development and infertility related diseases

4.1 lncRNA調控早期胚胎發育

lncRNA參與了多個生物學過程，顯示出更多的組織或細胞類型特異性表達模式。目前，lncRNA對早期胚胎發育的調控主要體現在胚胎干細胞的分化和自我更新層面。胚胎干細胞中存在大量的lncRNA，大部分都可以調控胚胎干細胞的基因表達。Karlic等[38]發現在小鼠卵母細胞向胚胎發育過渡的過程中一些lncRNA發生了動態變化，大部分母源性lncRNA在合子基因激活之前被降解，一部分lncRNA在調節胚胎發育過程中起積極作用，一些lncRNA是哺乳動物早期胚胎發育的必要調節因子。lncRNA可以調控胚胎干細胞的自我更新、維持多能性。Lu等[39]發現在小鼠中敲低lncRNA SNHG3(Small Nucleolar RNA Host Gene 3)后，小鼠的胚胎發育受到影響。另外，Mo等[40]研究發現,DLK1-DIO3印跡位點lncRNA表達缺失與人胚胎干細胞神經分化潛能降低有關，當印跡位點的lncRNA正確表達時，胚胎干細胞才具有全能性。lncRNA Gtl2(gene trap locus 2)位于該印跡區域，僅在早期胚胎發育的桑椹胚期和囊胚期表達，Han等[41]研究發現,Gtl2最早在桑椹胚期表達，并隨著胚胎分化為囊胚而逐漸局限于內細胞團，且在囊胚中敲低干細胞多能因子Oct4(octamer binding transcription factor 4)和Sox2(SRY-related high mobility group-box 2)后Gtl2的表達降低，表明Gtl2在早期胚胎發育和細胞分化中具有重要的調控作用。此外，lncRNA還可以調控胚胎干細胞的分化。Yin等[42]研究發現,在小鼠中lncRNA Haunt通過RA通路和HOXA通路調控胚胎干細胞分化的正常進行。這提示我們lncRNA對早期胚胎發育具有重要調控作用。

4.2 miRNA調控早期胚胎發育

大多數母源性基因都會受到miRNA的調控從而影響早期胚胎發育。Wang等[43]在小鼠中敲低Dgcr8酶后發現miRNA的產生受到阻礙，胚胎干細胞發育受到抑制，表明Dgcr8酶是對miRNA的產生必不可少的調控轉錄本。另外，miRNA可以參與調控受精卵的發育。Giraldez等[44]發現產生了1個母系合子突變體阻斷了斑馬魚中所有miRNA的形成，通過體外注射預處理的miRNA恢復基因沉默，發現Dicer酶突變引發的卵母細胞和受精卵在胚胎發育過程中出現的缺陷得到恢復，說明了miRNA對早期胚胎的正常發育具有重要作用。此外，miR-135a可以直接擾亂受精卵的增殖，導致不能形成胚胎干細胞，早期胚胎發育停滯。miRNA可以促進胚胎干細胞增殖和自我更新。Card等[45]發現miR-302在人胚胎干細胞中高表達，其在原代和轉化細胞系中通過靶向Oct4和Sox2促進S期細胞增加，而G1期細胞減少。這提示我們miRNA對早期胚胎發育有積極的調控作用。

4.3 其他ncRNA調控早期胚胎發育

tsRNA來源于成熟tRNA或tRNA前體，是一類非編碼小RNA，它的表達和修飾具有組織和細胞特異性。tsRNA能夠作為表觀遺傳因子，調控子代發育。Sharma等[46]發現在小鼠中tRNA-甘氨酸-GCC來源的tsRNA在胚胎干細胞和胚胎中抑制與內源性逆轉錄元件MERVL相關的基因，從而調控胚胎干細胞和胚胎中基因的表達。

許多研究發現，在精子發生和卵子發生過程中，ncRNA的異常表達與不育癥相關疾病的發生有關。ncRNA對雄性不育癥的調控作用主要是通過調控精子發生過程，對雌性不育癥的調控作用主要是通過調控卵巢的功能。在畜牧業中，不育癥的發生嚴重影響動物的后代產生以及行業的經濟效益。在人類中，不育癥也是一類很常見的疾病，關乎人類的健康和發展。因此，對配子發生相關疾病的深入研究具有重要意義，進一步研究ncRNA對這些疾病發生的調控作用有利于為不育癥疾病的診斷和治療提供新的思路和方法。

5 展 望

ncRNA是近年來的一個研究熱點，研究發現其在多種生物學過程中發揮調控作用。目前針對與配子發生相關ncRNA的大量研究發現其在配子發生和早期胚胎發育過程中發揮重要的調控作用，其異常表達會引發多種危害生殖健康的疾病，展現了其在精子發生、卵子發生以及早期胚胎發育過程中的重要性和調控機制的復雜性。目前的研究表明ncRNA可以通過調控生殖細胞的增殖、分化等過程發揮調控作用，越來越多的研究者開始關注ncRNA在生殖健康領域的調控機制和發揮的作用，這對更好的理解配子發生過程、對不育癥相關生殖疾病的診斷和治療具有重要意義。