大腸桿菌脂多糖體外誘導羔羊外周血單個核細胞炎癥模型的建立

董 寧，郭洪冉，王志超，楊雨鑫

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

大腸桿菌學名是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli)，是革蘭氏陰性菌中最為熟知的菌種，盡管在健康的腸道中低豐度，卻在動物腸道內普遍存在。大多數大腸桿菌菌株不會造成疾病，但是感染致病性大腸桿菌則會導致腹瀉、出血性腸炎，嚴重的時候會造成組織壞死和腸道穿孔，進而引發溶血性尿毒癥綜合征、腹膜炎、革蘭氏陰性肺炎和敗血癥等疾病[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁中的主要成分，是一種可以引起機體免疫細胞炎癥反應的內毒素，在大腸桿菌感染性疾病中起到重要的調節作用。LPS可以與細胞膜表面Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)結合，通過NF-κB和MAP激酶相關信號通路途徑，誘導多種促炎癥因子(IL-1、IL-6和TNF-α等)的表達和分泌，引起炎癥反應，清除病原體[2]。

在動物營養免疫學中，研究者通常采用LPS構建動物體內和體外急性應激模型來研究動物機體免疫功能，檢測藥物或天然植物提取物質的抗炎癥治療效果。通過腹腔或靜脈注射LPS溶液構建小鼠全身炎癥模型可以有效地研究藥物對敗血癥[3]、過敏性肺部損傷[4]、感染性急性腎衰竭[5]以及類風濕性關節炎[6]等伴隨著機體炎癥疾病的治療效果。LPS在體外細胞炎癥模型建立試驗中應用也十分廣泛。Soares等[7]使用LPS構建體外牙髓細胞炎癥模型探討辛伐他汀與納米纖維聚l-乳酸復合支架對牙髓細胞(DPCs)的抗炎、牙源性和促血管生成作用。Zhao等[8]采用LPS構建體外RAW264.7巨噬細胞炎癥模型探究雞腿菇和羊肚菌發酵液中總黃酮的抗炎作用。申靜[9]采用LPS構建雞外周血單個核細胞探究蛋氨酸和葉酸對炎性細胞因子轉錄表觀遺傳機制的調控作用。

外周血單個核細胞由于來源簡單易行，含有單核細胞和淋巴細胞多種免疫細胞，是一類重要的免疫細胞，擔負著炎癥介導和病原體清楚的重要工作，因此被廣泛應用于疾病治療方面的研究。陳瀚文[10]研究表明，外周血單個核細胞中的miRNA可以作為驗證性腸病診斷和活動度監測的生物標記物。蔣俊艷等[11]通過研究炎癥性腸病患者外周血單個核細胞LncRNA表達譜，發現明顯上調與炎癥指標、病情活動度密切相關的表達物，有助于炎癥性腸病的早期診斷。在槲皮素抗炎效果[12]、殼寡糖抗氧化應激[13]、多種中草藥對免疫細胞的增殖[14]等研究中，外周血單個核細胞構建的體外模型發揮著重要的作用。

本試驗探究了不同作用時間和濃度的大腸桿菌LPS溶液對羔羊外周血單個核細胞活力和炎癥因子表達量的影響，篩選出最適的LPS作用濃度和時間建立體外羔羊外周血單個核細胞炎癥模型，為后續天然植物型飼料抗炎癥效果的探究奠定細胞試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要溶液配制

脂多糖、羊外周血單個核細胞分離試劑盒、RPMI 1640培養基、10×PBS、100×青霉素鏈霉素混合液、標準胎牛血清、0.4%臺盼藍染色液、Trizol細胞裂解液(Solarbio，中國北京)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天，中國上海)；反轉錄試劑盒(艾科瑞生物，中國湖南)；熒光定量PCR預混Mix(全式金，中國北京)。

1×PBS：用高溫滅菌后的超純水將10×PBS稀釋10倍，每100 mL的PBS加入1 mL的100×青霉素鏈霉素混合液，4 ℃封口備用。

LPS處理液：用1×PBS將LPS配制成1 mg/mL的母液，于-20 ℃分裝保存。用不加胎牛血清的RPMI 1640培養基將LPS母液稀釋為不同濃度的處理液，用于后續試驗。

RPMI 1640完全培養基：向90 mL的RPMI 1640培養基中加入10 mL胎牛血清，配制含10%FBS的RPMI 1640完全培養基，4 ℃封口備用。

1.2 細胞分離及培養

1.2.1 細胞來源 試驗選取5只常規方法飼養的6～8月齡健康陜北白絨山羊，靜脈采血置于肝素抗凝采血管中，并于采血后1～2 h內帶回實驗室細胞間進行絨山羊外周血單個核細胞分離試驗。

1.2.2 細胞分離方法 用等體積的全血及組織稀釋液稀釋抗凝血，用移液槍輕柔吹打混勻得到稀釋全血；向15 mL離心管中加入5 mL絨山羊外周血單個核細胞分離液，取等體積的稀釋全血加于分離液面上，保持分離液和稀釋全血之間界限分明，兩者總體積不超過離心管體積的1/3；2 500 r/min室溫水平離心25 min，液體出現明顯的分層，吸取云霧狀外周血單個核細胞層的細胞(不超過2 mL)于高溫滅菌的10 mL離心管中，加入5 mL細胞洗滌液，輕柔吹打混勻，1 200 r/min室溫水平離心10 min；棄上清液，保留細胞沉淀，再向離心管中加入5 mL的細胞洗滌液，輕柔吹散細胞沉淀，1 200 r/min室溫水平離心7 min；棄上清液，加入1 mL的RPMI完全培養基重懸細胞沉淀，0.4%臺盼藍染液染色后，用牛鮑計數板計數，計算細胞懸液密度，調整密度為5×106個/mL，用于后續培養及試驗。

1.3 MTT檢測脂多糖對PBMC活力的影響

將剛分離出來的外周血單個核細胞懸液調整密度為1×106個/mL，向96孔細胞培養板每孔加入100 μL細胞懸液，最外圍一圈培養孔用PBS填充，37 ℃、5%CO2培養25 h，在終止培養前3 h、6 h、12 h每孔加入20 μL不同濃度的LPS處理液，使得LPS在培養基中的終濃度為0、0.016、0.08、0.2、0.4、1、2、4、6、8、10、50 μg/mL，每個濃度設置5個復孔，2個空白對照孔(將100 μL細胞懸液換為不添加血清的RPMI 1640培養基)。終止培養后每孔加入10 μL MTT溶液，37 ℃、5%CO2孵育4 h，之后每孔加入Formazan溶解液100 μL繼續在培養箱中孵育3 h，在光學顯微鏡下觀察紫色結晶全部溶解后，用酶標儀在570 nm波長下測定吸光度值。

1.4 熒光定量PCR檢測炎癥因子

將密度為5×106個/mL的羊外周血單個核細胞懸液接種于6孔板中，每孔1.6 個/mL，37 ℃、5%CO2培養26 h，在終止培養前3 h、6 h、12 h、24 h分別向每孔加入0.4 mL不同濃度的LPS處理液(終濃度為0、0.4、1、2、4、6、8、10 μg/mL)，每個處理設置6個重復。結束培養后1 000 r/min收集細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，使用核酸定量儀檢測RNA質量和濃度，每個樣本吸取含量為1 μg的RNA溶解液按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，采用20 μL的熒光定量PCR反應體系：cDNA模板1.5 μL、上下游引物各0.4 μL、Green qPCR SuperMix 10 μL、無酶水補足體系。采用兩步法進行熒光信號采集：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個循環。選取β-actin作為內參基因，檢測各處理組中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α基因相對表達量，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 統計學分析

所有數據經過Excel 2016軟件初步處理整合后，使用SPSS 25.0統計軟件進行方差分析，使用繪圖軟件Graphpad 9進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 PBMCs形態學觀察

新分離出的原代羊外周血單個核細胞在培養基中懸浮生長，少量巨噬細胞貼壁生長。在光學顯微鏡下觀察呈球形，折光率較強。隨著培養時間的增加，外周血單個核細胞出現抱團生長的現象，細胞折光率降低，細胞形態開始出現不規則變化，甚至有細胞出現凋亡和破裂(圖1)。

圖1 羔羊外周血單個細胞體外培養Fig.1 In vitro culture of lamb PBMC

2.2 LPS對羊外周血單個核細胞活力的影響

如圖2所示，在相同時間內，隨著LPS處理濃度的升高，外周血單個核細胞的相對活性呈現先升高后降低的趨勢，但是與對照組相比均差異不顯著。在處理3 h時，濃度為0.4、2 μg/mL時細胞相對活性達到峰值；在處理6 h時，濃度為0.2 μg/mL時細胞相對活性達到峰值；在處理12 h時，濃度為0.4 μg/mL時細胞相對活性達到峰值。

圖2 不同LPS處理時間外周血單個核細胞相對活性柱上標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同Fig.2 Relative activity of PBMCs at different timestreated with LPSThe same or the absence of letters above columns indicateinsignificant difference(P>0.05),different lowercase lettersindicate significant difference(P<0.05),different capitalletters indicate highly significant difference(P<0.01).The same below

2.3 LPS對羊外周血單個核細胞炎癥因子表達量的影響

LPS處理后羊外周血單個核細胞炎癥因子表達量見圖3。

由圖3A可見，IL-1β處理3 h，各處理組之間IL-1β基因相對表達含量差異不顯著(P>0.05)；處理6 h時，2、4、6、8、10 μg/mL濃度處理組IL-1β基因相對表達量較對照組均極顯著升高(P<0.01)，1 μg/mL濃度處理組IL-1β基因相對表達量較對照組顯著升高(P<0.05)，除0.4 μg/mL以外其他濃度處理組IL-1β基因相對表達量較3 h和12 h均有所升高；處理12 h，濃度為2 μg/mL時相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。處理6 h、處理濃度為10 μg/mL時，IL-1β的相對表達量達到峰值。

IL-6的表達量如圖3B所示，LPS處理3 h，濃度為6、10 μg/mL相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)；LPS處理6 h，濃度為6、8、10 μg/mL處理組的IL-6相對表達量極顯著高于其他各組(P<0.01)，并且在8 μg/mL時達到峰值；處理12 h，濃度為6 μg/mL處理組相對表達量極顯著高于其他各組(P<0.01)。當處理時間為3 h、處理濃度為6 μg/mL時，IL-6的相對表達量達到峰值。

如圖3C所示，LPS處理3 h，濃度為1、2、4、6、8 μg/mL時IL-10基因相對表達量與對照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)；處理6 h，濃度4 μg/mL組相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，濃度2、6 μg/mL組顯著高于對照組(P<0.05)；處理12 h，濃度1、4 μg/mL組相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。處理6 h、處理濃度為4 μg/mL時，IL-10的相對表達量達到峰值。

如圖3D所示，LPS處理3 h，濃度為4、6 μg/mL處理組TNF-α基因相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)；處理6 h，1、4 μg/mL處理組與對照組差異顯著(P<0.05)；處理12 h，2、4、6 μg/mL處理組與對照組差異極顯著(P<0.01)。處理6 h、濃度為1 μg/mL時，TNF-α的相對表達量達到峰值。

圖3 LPS對外周血單個核細胞炎癥因子相對表達量的影響Fig.3 Effects of LPS on the relative expression of inflammatory factors in PBMC

綜上所述，LPS處理時間為6 h時，各細胞炎癥因子表達量普遍達到峰值。結合細胞相對活力結果，應選取濃度為4 μg/mL、處理時間為6 h建立LPS體外誘導的羔羊外周血單個核細胞炎癥模型，用于后續試驗。

3 討 論

本試驗采用LPS構建羔羊外周血單個核細胞炎癥模型，探究了不同作用濃度和時間，羔羊外周血單個核細胞相對細胞活力、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α炎癥因子的表達量，研究發現當LPS濃度高于6 μg/mL時，細胞活性低于對照組。在相同處理時間條件下，隨著處理濃度的升高，細胞相對活性呈現先升高后降低的趨勢，各處理組之間差異不顯著。在處理濃度小于6 μg/mL，處理時間在12 h之內細胞活性沒有顯著性變化。LPS對羔羊外周血單個核細胞活力變化趨勢的影響與吳華[15]研究中細胞活性的變化趨勢一致，但是不同動物的外周血單個核細胞對LPS溶液具有不同的耐受程度，本試驗中建立的外周血單個核細胞炎癥模型，LPS的處理濃度應小于6 μg/mL。羔羊外周血單個核細胞在體外未加刺激時存活時間較短，在培養24 h后出現大量細胞團，細胞活性逐漸受到抑制，因此本試驗選取3 h、6 h和12 h 3個時間節點檢測LPS對細胞活性和炎癥因子表達量的影響。

外周血單個核細胞體外疾病模型被廣泛運用于各種藥物作用效果的研究中。Du等[16]采用LPS構建人外周血單個核細胞體外炎癥模型探究異佛司可林和佛司可林對炎癥的抑制作用；Yu等[17]通過外周血單個核細胞體外模型探究人絨毛膜促性腺激素對細胞因子分泌的影響；Garcia-Campos等[18]通過轉錄組學的方法探究綿羊和牛感染肝片吸蟲后外周血單個核細胞中基因表達的差異變化，以求尋找新的預防和治療方法，包括新的活性化合物和疫苗。因此探究羔羊外周血單個核細胞體外培養條件，構建LPS誘導的羔羊外周血單個核細胞炎癥模型，可為新型植物提取物的抗炎作用的探究提供便利和細胞學基礎。

IL-1β、IL-6和TNF-α是內源性致熱源，可引起機體發熱以及組織細胞、上皮細胞以及其他免疫細胞的炎癥反應，釋放一系列炎性介質，引發組織損傷。IL-1β和IL-6最初被發現作用于白細胞之間因此被稱為白細胞介素[19]。IL-1β出現各種能夠引起炎癥反應的疾病中，可以促進Th1對疾病的應答，同時可促進NLRP3炎癥小體的產生，進而加重疾病造成的炎癥反應[20]。IL-6可由多種免疫細胞分泌，既可以促炎又可以抗炎，可以刺激Th17細胞的產生，分泌IL-17和IL-10細胞因子，抑制Th17細胞的致病功能[21]。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產生，在調節免疫應答和誘導細胞凋亡等過程中發揮重要作用[22]。IL-10可拮抗炎癥介質，通過控制炎癥反應，避免組織過度損傷[23]。本試驗中，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的表達量隨著LPS處理濃度的升高呈現先升高后降低的趨勢，這可能是由于LPS濃度過高抑制了外周血單個核細胞的活性，從而降低了炎癥因子的分泌量。隨著處理時間的增加，炎癥因子表達量也呈現先升高后降低的趨勢，但是IL-1β的相對表達量在處理時間為6 h時，除了0.4 μg/mL處理組外其余各濃度處理組均高于3 h和12 h，其他炎癥因子在時間維度的變化趨勢并不顯著。整體來說，處理時間為6 h時，各炎癥因子表達量達到峰值。因處理濃度高于6 μg/mL時細胞活性低于對照組，所以選取處理濃度為4 μg/mL建立體外炎癥模型。

4 結 論

本試驗中，LPS處理濃度和處理時間對細胞相對活性沒有顯著影響。IL-1β的相對表達量在LPS處理6 h、處理濃度為10 μg/mL時達到峰值，且除0.4 μg/mL以外，其余各濃度處理組均顯著高于對照組。IL-6的相對表達量在處理3 h、處理濃度為6 μg/mL時達到峰值。IL-10的相對表達量在處理6 h、處理濃度為4 μg/mL時達到峰值。TNF-α的相對表達量在處理6 h、處理濃度為1 μg/mL時達到峰值。建議以處理時間為6 h、處理濃度為4 μg/mL建立LPS體外誘導的羔羊外周血單個核細胞炎癥模型，可以在保證細胞相對活力不受影響的同時提高炎癥因子表達量。