野生酵母商業化研究的綜合因素分析

王春曉，陳玉婷，楊金仙,2，陳秋竹，韋旭衛

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(共青科技職業學院，江西 九江，332020)

中國葡萄酒產業因地理位置和氣候條件差異，目前已經形成了東北產區、山東產區、京津冀產區、新疆產區、河西走廊產區等十一大葡萄酒產區[1]，不同產區的風土條件與所釀造葡萄酒的區域特色息息相關[2]。作為風土條件之一的微生物風土近年來受到越來越多研究者的重視[3-4]，中國不同產區均開展了野生酵母資源的調查分析，并研究篩選優秀酵母菌株用于提升葡萄酒的風味特色[3,5-8]。目前已經商業化應用的中國本土野生釀酒酵母為CEC01和CECA，由劉延琳課題組篩選自寧夏和新疆葡萄酒產區。在產區野生酵母資源調查的基礎上，進一步開發不同野生酵母資源對釀造中國不同產區特色葡萄酒具有重要意義。野生酵母資源商業化始于野生酵母資源的分離鑒定，需要全面分析其發酵特性(如糖代謝、乙醇代謝、絮凝性、嗜殺性和耐受性等)和釀造特色(如影響葡萄酒口感、香氣、不良風味和安全性等的物質代謝)，而優選的野生酵母完成商業化的最終分析因素為商業菌劑的加工研究[9-10]，本文主要綜述了野生酵母商業化研究需要分析的4個主要研究內容(圖1)，為中國優選野生酵母菌的商業化應用提供理論參考。

1 野生酵母的分離鑒定研究

葡萄酒野生酵母大多分離自成熟葡萄果實或葡萄醪自然發酵過程中(圖1)，通過依賴于培養的分子鑒定技術可將分離出的野生酵母菌鑒定至菌種水平[3](如用WL培養基分離和初步鑒定酵母菌，并進一步采用26S rRNA基因序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析開展菌種水平分子鑒定)，通過不依賴于培養的高通量測序技術或實時定量PCR技術可快速獲知不同酵母菌種(屬)的相對豐度或菌群濃度[11]。部分研究采用特定篩選培養基分離獲取目的野生酵母菌，如采用高乙醇培養基獲取耐乙醇的釀酒酵母等。目前大部分野生酵母的顯微形態和生理特征(主要指碳源同化和發酵能力、部分氮源同化和發酵能力、適宜培養溫度等)已得到系統研究，分類鑒定序列特征(主要指26S rRNA的D1/D2基因序列和5.8S rRNA的ITS基因序列)較為清晰，倍性特征僅局限于酵母屬酵母，非酵母屬酵母的有性生殖數據相對較少[12-13]。依賴于培養的野生酵母分離鑒定研究是優良酵母菌商業化研究的首要步驟，為進一步篩選具有優良發酵特性和釀酒特色的野生酵母菌提供了豐富的酵母菌資源。

2 野生酵母的發酵特性研究

野生酵母的糖代謝能力和產酒精能力是其良好發酵力的保證，也是發酵特性研究中必要的篩選因素，而對嗜殺性和絮凝性等性能的研究有利于葡萄酒發酵過程中對不良微生物的控制以及葡萄酒的澄清，是滿足葡萄酒質量的基本保證[14]。葡萄酒酒精發酵初期環境為高糖環境且大多進行了一定濃度的SO2處理，隨著發酵的進行乙醇濃度逐漸提升，因此酒精發酵并非酵母菌最適宜的生長環境，具有優良發酵特性的酵母菌還需具備一定的發酵環境耐受性，從而更好地在發酵過程中發揮作用[15]。

2.1 糖代謝和產酒精能力研究

酵母菌的發酵力主要表征為糖代謝能力和產酒精能力，釀酒酵母主要將糖轉化為乙醇，因此其糖代謝能力和產酒精能力相對一致，但對于非酵母屬酵母而言，發酵完全主要表征為可將還原糖代謝至4 g/L以下，較高代謝副產物的生成導致其產酒精能力弱于釀酒酵母。

乙醇是葡萄酒中的重要成分，品嘗時會帶來灼熱感，乙醇過高會掩蓋葡萄酒的果香味，增強葡萄酒的干燥和粗糙感，乙醇過低則會使葡萄酒的口味不足，因此乙醇含量直接影響葡萄酒酒體結構的平衡。酵母菌產酒精能力可通過TTC培養基進行初步評價[14]，大多數研究采用直接發酵并測量葡萄酒發酵液中乙醇含量的方式篩選具有優良產酒能力的酵母菌(密度瓶法、氣相色譜法、酒精計法，GB 5009.225—2016)[16]。生物量生成、物質消耗和乙醇生成過程中熱動力學參數的分析可為糖代謝和產酒精能力的評價提供定量化監測指標[17]。

全球氣候變暖使部分產區成熟葡萄中糖含量升高，最終會導致葡萄酒中乙醇含量的提升，健康的生活理念以及某些國家以乙醇含量來定稅使得葡萄酒降醇逐漸成為當今的研究熱點。降醇策略一方面圍繞釀酒酵母展開，通過篩選低產乙醇釀酒酵母(可降低1%vol及以上)或采用降低乙醇的發酵工藝如發酵初期通過短期通風促進釀酒酵母有氧呼吸作用等[18]。另一方面圍繞非酵母屬酵母展開，非酵母屬酵母通過產生大量次級代謝產物和呼吸作用來降低葡萄酒中的乙醇含量[19]，將非釀酒酵母與釀酒酵母共同接種發酵(同時接種或順序接種)降低葡萄酒中乙醇的含量已成為一種戰略性降醇手段[2]。

2.2 與發酵特性相關的絮凝性和嗜殺性等研究

1963年MAKOWER和BEVAN首次在釀酒酵母中發現了嗜殺因子，嗜殺因子是酵母菌分泌的蛋白質類抗菌化合物，可在發酵過程中部分代替SO2控制不良雜菌的生長。不同酵母菌分泌酵母毒素不同，因此對野生酵母的抑制具有菌株特異性[20]，釀酒酵母嗜殺性多指其在美藍培養基上表現出的對其他釀酒酵母產生的抑菌圈，近年來釀酒酵母還展現了其所產毒素對非酵母屬酵母的生存抑制作用，但在美藍培養基上釀酒酵母對非酵母屬酵母大多不產生抑菌圈[20]。非酵母屬酵母也可分泌毒素如假絲酵母中分離的CpKT1和CpKT2可抑制酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)的生長，但不影響釀酒酵母和乳酸菌的生長代謝[21]。酵母菌之間的相互抑制作用研究，有利于降低發酵過程中抑制雜菌所用SO2的添加量，從而促進健康、綠色葡萄酒的生產。

酵母菌在發酵中存在絮凝現象，主要是由酵母細胞表面存在的絮凝素與鄰近酵母細胞壁上的甘露糖蛋白相互作用使細胞聚集造成的。具有絮凝性的酵母會在葡萄酒發酵過程中黏附成團沉降，絮凝性過高過早出現，會導致酵母菌因分散性差造成的發酵性能降低、糖消耗不完全和發酵時間延長等[22]；絮凝性過低會導致發酵后期酵母細胞凝聚緩慢，不利于葡萄酒的過濾和澄清。酵母菌絮凝程度評價常根據Flo值的不同進行劃分，當Flo在70%～100%時為低絮凝性，30%～70%屬中絮凝性，而0～30%屬高絮凝性，因此，具有合適絮凝性的優選酵母菌有利于葡萄酒酒精發酵的進行。

2.3 發酵環境耐受性研究

酵母菌在葡萄酒發酵過程中常需面對高糖、高乙醇、高SO2的環境挑戰[23]，如過高的糖濃度會抑制酵母菌的生長，且高滲環境會使細胞脫水[22]，高酒精濃度會影響酵母菌的活性、發酵力和增殖速度等。酵母菌在脅迫環境下的生存能力和發酵力具有菌株差異，為保證葡萄酒發酵的順利進行，常需篩選具有優良耐受性的酵母菌作為潛在商業酵母進行后續研究[15]。

葡萄醪中過高的糖濃度會通過阻遏作用抑制酵母菌生長，此外糖濃度較高時發酵液黏度較大，不利于CO2釋放。目前研究報道中釀酒酵母具有較強的高糖耐受性，最高可耐受400～650 g/L的糖質量濃度。酵母的高糖耐受性研究主要通過檢查含有不同葡萄糖濃度的YPD固體培養基上菌落生長情況、含有不同葡萄糖濃度的YPD液體培養基中細胞生長引起的OD值變化、或杜氏小管的產氣量等方式開展[16]。目前暫未發現關于非酵母屬酵母的高糖耐受性研究報道，但自然發酵初期的葡萄醪中往往存在大量的非酵母屬酵母，間接證實了其高糖耐受性。

乙醇通過影響酵母細胞膜的流動性和對膜蛋白的毒性作用抑制酵母菌的發酵和生存[24]，而在葡萄醪發酵過程中，乙醇濃度隨發酵進行逐漸升高，因此優良酵母菌需具備一定濃度的乙醇耐受性。酵母菌的乙醇耐受性研究主要通過檢查酵母菌在含有不同濃度乙醇的YPD液體培養基中的生長情況開展，通常認為在≥16%vol環境下能生存的菌株為乙醇耐受性良好的酵母菌。釀酒酵母的乙醇耐受性優于大部分非酵母屬酵母，研究發現自然發酵早期存在的大部分非酵母屬酵母具有較差的乙醇耐受性(<10%vol)。酵母菌的乙醇耐受性可通過環境適應性而增強，因此在篩選中若模擬酒精發酵過程逐漸增加乙醇濃度，非酵母屬酵母可耐更高濃度的乙醇[25]。

在葡萄酒發酵過程中添加適量的SO2可起到抑菌、抗氧化、保護葡萄酒顏色等作用，其用量根據葡萄原料質量和所釀造葡萄酒類型而不同，葡萄質量較好時，添加量常為20～110 mg/L，葡萄質量較差時，添加量為70～150 mg/L。作為抑菌劑，一定濃度的SO2可殺死細菌和酵母菌等微生物，其中細菌對SO2最為敏感，其次是檸檬形克勒克酵母，抗性最強的為釀酒酵母[26]。目前報道的優良釀酒酵母對SO2耐受性高達300 mg/L[4]。

3 野生酵母的葡萄酒釀造特色研究

酵母菌通過對葡萄汁中主要營養成分(如糖和氮化合物)的代謝產生葡萄酒中豐富的風味物質(如高級醇、酯、有機酸、甘油、酮、硫揮發物等)，影響葡萄酒的品質風格[7,9]。近年來非酵母屬酵母對葡萄酒釀造特色塑造的積極作用逐漸被人們發掘和關注，通過控制釀酒酵母與非酵母屬酵母的接種比例和接種順序，驗證了非酵母屬酵母的葡萄酒釀造特色，如高產甘油、降低蘋果酸等口感特性提升，增加香氣復雜性，降低負面風味物質和有毒物質的生成等[2,27]。

3.1 口感特性研究

甘油是酵母菌酒精發酵的主要副產物之一，在葡萄酒中的含量為1～15 g/L，甜味閾值為5.2 g/L，研究表明甘油可改善葡萄酒的風味強度，增加黏度，抑制高乙醇含量帶來的苦味、辣感和粗糙感，適當提高葡萄酒的甘油含量可使葡萄酒口感圓潤，并增加口感復雜性[26]。甘油主要產生于酒精發酵前期，甘油的產生可平衡酵母細胞內的氧化還原電勢，緩解高糖環境產生的滲透脅迫作用。目前酵母菌的產甘油能力研究主要通過檢測發酵液中甘油含量的方式進行，甘油含量可通過試劑盒[28]、高錳酸鉀褪色光度法、氣相色譜法、變色酸法[29]、酶法、高效液相色譜法等方法檢測。高產甘油的酵母菌發酵液中甘油含量應≥6 g/L[30]，大部分酵母菌甘油產量隨發酵溫度升高而增加，因此進行甘油產量評價時需考慮不同發酵溫度帶來的影響[28]。

葡萄酒中主要的有機酸為酒石酸和蘋果酸，來源于葡萄原料。葡萄酒酸度過低(<4.59 g/L，以酒石酸計)，會使葡萄酒不清爽、不厚實、不穩定，且口感復雜性低等[31]。葡萄原料含酸量過低可選擇產酸能力較好的酵母菌進行酒精發酵，馬文瑞等[32]篩選出高產酸酵母菌Y6，酒精發酵過程中平均產酸量為1.69 g/L(以酒石酸計)，主要產生的酸為酒石酸和蘋果酸，可緩解新疆等產區葡萄原料高糖低酸的情況。葡萄酒酸度過高(主要是蘋果酸含量過高)，會帶來酸澀、粗糙的不良口感，且蘋果酸易被微生物利用，不利于葡萄酒穩定。裂殖酵母等降酸酵母可通過蘋果酸酒精發酵分解75%～100%左右的蘋果酸[33]。通過選擇合適的酵母菌來釀葡萄酒，可適當增加或者降低葡萄酒的酸度。

3.2 香氣復雜性研究

近年來相關研究表明釀酒酵母與非酵母屬酵母的混合發酵可增加葡萄酒的香氣復雜性，尤其是果味的增加，而與葡萄酒果味相關的香氣化合物包含酯類、高級醇、揮發性硫醇等[34]。乙酸酯類化合物主要通過乙酰CoA與醇類物質在醇乙?；D移酶的催化下形成，高級醇通過酵母菌的氨基酸代謝(Ehrlich途徑)或糖代謝合成途徑形成。乙酯類化合物主要通過酵母菌脂質代謝形成的中鏈脂肪酰CoA與乙醇在多種?；D移酶的作用下由酶促酯化反應生成。酵母菌的產酯能力可初步通過酯酶培養基評價，但近年來相關研究大多直接研究發酵液中不同酯類物質的含量。由于發酵產生的乙酸乙酯、高級醇等香氣化合物可在葡萄酒陳釀過程中進一步轉化，因此不建議簡單通過發酵液中香氣物質含量篩選產香酵母。酵母菌分泌的酶(如糖苷酶和半胱氨酸裂合酶)還可促進葡萄漿果表皮中芳香前體物質的提取，使中性芳香化合物轉變為活性芳香化合物，從而影響葡萄酒的香氣結構[35]。糖苷酶可破壞萜類物質和葡萄糖間的共價鍵，從而將揮發性萜烯類化合物釋放出來，增加葡萄酒香氣；同樣，半胱氨酸裂合酶將硫醇與半胱氨酸結合的形式中釋放出來，賦予了葡萄酒西柚、柑橘等香氣[9]。酵母菌產酶情況可通過定性和定量培養基進行初步篩選[35]，近年來相關研究關注高產酶非酵母屬酵母通過與釀酒酵母混合發酵對葡萄酒香氣復雜性的影響[10,36]。

酵母自溶出現在發酵末期，是一個緩慢的過程，首先胞內結構發生重組，溶菌酶被激活，細胞的體積減小、黏度下降，然后胞內組分被水解并釋放到胞外[23,37]。在水解酶的作用下，酵母菌的細胞質會釋放出脂肪酸、多肽、氨基酸、核苷酸等物質，細胞壁會釋放出甘露糖蛋白[9,38]。一些陳釀型白葡萄酒會通過酒泥陳釀方式獲取酵母菌自溶釋放的物質成分，從而增加風味復雜度[39]。酵母自溶釋放的物質如多肽會影響起泡葡萄酒第二次發酵過程中的發泡特性，而甘露糖蛋白可抑制單寧的凝集、促進芳香化合物的保留、增加葡萄酒多糖成分、促進乳酸菌生長、抑制醋酸菌的生長、增加抗氧化性等。

3.3 風味缺陷研究

H2S是酒精發酵過程中常見的代謝副產物，在葡萄酒中的含量約為1 μg/L，具有臭雞蛋氣味、揮發性強、閾值低(11～80 μg/L)，因此含量過高會造成葡萄酒風味缺陷[40]，H2S還可衍生為其他揮發性硫化合物如乙硫醇等使葡萄酒呈現腐爛卷心菜、燒焦的橡皮、蒜臭味等其他不良氣味。低產或不產H2S酵母菌可改善酒精發酵過程中硫代謝引起的不良風味。酵母菌的產H2S能力可通過發酵或液體培養中的硫化氫檢測管、醋酸鉛還原法等進行評價，BIGGY培養基也常用于表征酵母菌產H2S的能力[41]。目前研究報道的不產H2S野生釀酒酵母只有1株，為UCD932[40]，因此篩選不產或低產H2S釀酒酵母是葡萄酒釀造酵母商業化應用的主要研究內容之一，目前尚無非酵母屬酵母H2S代謝的相關報道。

3.4 降低毒素等安全研究

酵母菌的精氨酸代謝起始于精氨酸酶將精氨酸水解為尿素和鳥氨酸的過程(圖2)。尿素可與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯，氨基甲酸乙酯為致癌物質，1985年加拿大政府的衛生與福利組織規定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過30 μg/L[42]，2002年聯合國糧食及農業組織規定葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超過20 μg/L，食品中不得超過25 μg/L[43]，中國目前未明確限制葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量，但明確了氨基甲酸乙酯的標準檢測方法(GB 5009.223—2014)。由于尿素是酵母代謝產生氨基甲酸乙酯的主要前體物質[42]，因此低產尿素酵母菌的篩選有益于降低葡萄酒中的氨基甲酸乙酯含量。部分非酵母屬酵母具有脲酶活性，可將精氨酸代謝產生的尿素分解為二氧化碳和氨氣，避免尿素生成氨基甲酸乙酯。研究表明，部分釀酒酵母能夠生產氨基甲酸乙酯水解酶，可將氨基甲酸乙酯水解為乙醇和氨從而降低其含量[44]。由于尿素與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯的過程可在陳釀過程中緩慢進行，因此發酵過程中氨基甲酸乙酯水解酶的作用相較于脲酶降低尿素的作用來說，后者更有利于降低葡萄酒中的氨基甲酸乙酯(圖2)。

葡萄表面受敗壞性真菌侵染會產生赭曲霉毒素等真菌毒素，這些真菌毒素可能伴隨釀造過程進入葡萄酒中，赭曲霉毒素為致癌物質，歐盟委員會提議其在葡萄酒中的含量不應超過2 mg/L。相關研究表明部分酵母菌對赭曲霉毒素具有一定的去除作用，可通過篩選具有良好去除赭曲霉毒素效果的酵母菌作為發酵劑，減少葡萄酒中赭曲霉毒素的含量[42,46]。

4 酵母菌商業化生產的分析因素

野生酵母經分離鑒定、發酵特性分析、釀造特色分析后，所篩選的優良野生酵母還需分析其是否可通過商業菌劑的方式投入葡萄酒工業生產[9]。目前主要應用的商業菌劑為活性干酵母，自1964年起在美國開始應用于葡萄酒工業，80年代初期在中國應用于葡萄酒釀造行業中。加工成型的活性干酵母直徑約為0.5～2 mm，通過真空包裝方式可保持1年以上的酵母活性[47]。酵母菌在活性干酵母制備過程中，所用營養物質常為糖蜜，糖蜜中缺乏氮源和維生素，因此酵母菌需具有較強的營養底物適應性[48]，酵母菌通過逐級擴大培養，最后轉至發酵罐培養，經過離心收集、水洗、擠壓成型、干燥等過程制成活性干酵母，葡萄酒釀造時經活化后應用于葡萄汁的發酵?；钚愿山湍钢谱鬟^程需要酵母菌具有耐干燥(水分含量<5.5%)、耐饑餓、活性強、再吸水活化時發酵力強等特點[9,47]，酵母細胞內碳水化合物(如海藻糖)和蛋白質的含量與酵母菌耐干燥和再吸水活化時的發酵力相關，一般蛋白質含量高則發酵力強，而碳水化合物含量高則耐干燥性能強[47]。研究表明，高溫鈍化培養方案適合活性干酵母的制作，具體指在13 h的培養周期中，從第9 h開始每小時增加2 ℃培養溫度，最終可獲取較高的酵母細胞生物量、干物質含量和胞內海藻糖含量[49]。部分非酵母屬酵母加工耐受性弱于釀酒酵母，因此雖然商業化非酵母屬酵母仍大多加工為活性干酵母，國際酵母市場也出現了膏狀酵母、活性冷凍酵母和膠囊封裝酵母等新型加工菌劑[50]，如意大利BioEnologia公司開發的四種非酵母屬酵母菌種(Starmerellabacillaris、Schizosaccharomycespombe、Pichiakluyveri、Kazachastaniaservazzii)的膏狀酵母、葡萄牙Proenol公司開發的S.pombe膠囊封裝酵母。目前中國葡萄酒釀造市場暫無本土特色非酵母屬酵母商業化產品和新型加工菌劑產品。

5 結語

由于全球氣候變暖對葡萄酒行業的挑戰和消費者觀念的改變，當今葡萄酒更趨向具有區域特色化、風味復雜性、低醇、低硫和健康特色。酵母菌作為葡萄酒釀造風格質量的主導微生物，其代謝特點直接影響所產葡萄酒的風味。因此，篩選中國不同產區特有的釀酒酵母和非酵母屬酵母，并進一步進行釀造特色和商業化菌劑加工因素分析，運用商業化中國特色酵母菌將成為釀造具有中國不同區域特色葡萄酒的主流趨勢。除單一酵母菌種商業化制劑外，優選釀酒酵母與非酵母屬酵母混合加工制劑的開發與應用，將為中國不同區域特色葡萄酒的釀造提供重要的發酵輔料來源。目前具有中國不同產區特色的野生酵母菌資源正在不斷得到研究與挖掘，然而關于商業化菌劑加工的研究較少，膏狀酵母等新型加工菌劑的采用可為更多優質葡萄酒酵母的商業化應用提供新的思路。