三維多細胞球體在牙周組織再生中的研究進展

雷笑霄， 閆香珍， 羅禮君

(同濟大學附屬口腔醫院牙周病科，上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，上海 200072)

牙周炎是牙周組織慢性炎癥性疾病，其特征是牙齦的反復炎癥，牙槽骨、牙周膜等牙周組織被破壞。如不及時治療，牙周炎將引起牙周附著喪失，形成牙周組織缺損，最終牙齒松動脫落。目前牙周炎的常規治療包括牙周非手術治療和手術治療。這些治療方法通?？梢詼p緩或阻止疾病進一步發展，但獲得牙周組織再生仍是臨床難點。新的治療方法包括引導組織再生術以及各種基于生長因子的療法等[1]。當牙周缺損較大時，牙周組織再生受限，這可能與牙周組織中干細胞數量減少、功能受損等有關。隨著組織工程和干細胞治療技術的發展，通過干細胞移植促進牙周組織再生，成為新的研究方向，以克服現有療法的局限性[2]?；诩毎难乐芙M織再生策略需要大量種子細胞，傳統的二維培養環境異于細胞體內生長環境，所得產物也不同于體內生長細胞，使其難以實際應用于牙周組織再生。近年來研究發現，三維多細胞球體不僅增強了細胞多向分化潛能，還有較強的抗炎能力。由此推測，將牙周再生細胞進行三維培養可提升其干性并促進其在炎癥微環境下的牙周再生。

1 干細胞在牙周組織再生中的應用

1.1 牙周組織再生中干細胞的作用

干細胞是牙周組織再生的一個關鍵因素，在維持牙齒生理功能及牙周組織更新中起到了重要的作用[1]。

理想的干細胞增殖、傳代能力強，具有特定的分化潛能或表型；來源可靠，取材簡便，性能穩定，能適應受植區的環境，對機體損傷小，無免疫排斥反應等[3]。目前，用于牙周組織再生的細胞有胚胎干細胞和成體干細胞，其中對成體干細胞研究較多。

應用于牙齒再生和牙周修復的干細胞包括: 牙髓干細胞、脫落乳牙干細胞、根尖牙乳頭干細胞、牙囊祖細胞(dental follicle cells, DFC)、牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)、口腔上皮干細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)、脂肪干細胞、胚胎干細胞和誘導多能性干細胞等[4-5]。不同干細胞對于牙周組織再生的效果不盡相同，研究表明，牙源性干細胞效果優于非牙源性干細胞，而牙髓干細胞與PDLSC效果相當[4]。

為了明確細胞對牙周組織再生的效能，Yan等[6]對基于細胞治療策略的牙周組織再生動物實驗進行了系統評價，結果表明細胞對牙周組織再生的確有積極作用，其中PDLSC及MSC應用最多，然而只有PDLSC能同時促進牙周膜、牙骨質與牙槽骨的再生。這可能是由于PDLSC中具有多種亞群細胞，而每種細胞亞群保留了不同的特定分化潛能，能夠共同促進牙周軟硬組織生成。其他研究也發現，PDLSC可通過影響巨噬細胞向M2型極化，促進牙周組織再生[7]；PDLSC在體外表現出血管生成，免疫調節和多系分化能力，是牙周再生理想的候選者[8]。

1.2 細胞應用種類和方式及其優缺點

目前，體外擴增細胞的標準技術是傳統的二維貼壁培養。這種培養環境與體內生存環境差距大，培養的細胞生物性能等方面異于體內細胞。首先，在二位環境中細胞被拉伸，缺乏細胞-細胞和細胞-基質相互作用。此外，二維培養的細胞骨架重排，獲得人工極性，導致正常生理行為改變。二維培養數次傳代后，細胞干性降低[9]。最終細胞的生長趨于單一化，許多生物學性狀難以維持，形態和功能發生改變，衰老、多能性降低以及旁分泌能力受損等，難以發揮治療潛能。故傳統體外培養的細胞無法與體內的細胞完全等同。

于是，學者提出三維細胞培養技術。三維培養技術包括將細胞嵌入到生物支架材料中和細胞本身聚集形成多細胞球體[10]。

三維培養的細胞具備以下幾點優勢: 三維微環境更能保留細胞的生理表型；細胞-細胞產生更好的接觸作用；細胞外基質充斥在細胞周圍，有利于細胞局部停留；核心部分相對低氧的環境有利于分泌營養因子[11]。但是，三維培養無法對良莠不齊的細胞進行質量異質性篩選。且在尺寸不可控的三維細胞球中，不同部位的細胞營養不均衡，如在細胞球中心的細胞，因缺少營養、低氧和失巢凋亡而衰老、凋亡或變異等。

二維培養與三維培養主要特點比較見表1。

表1 二維培養與三維培養主要特點比較Tab.1 Comparison of the main characteristics of two-dimensional culture and three-dimensional culture

2 三維培養技術

2.1 現有三維培養體系及其局限性

細胞三維培養方法有懸滴法[12]、基于光刻和微圖案化技術法[13]、低黏附培養皿法[14]、生物反應器動態懸浮法[15]、微流體法[16]、殼聚糖膜培養法[17]、微孔芯片法[18]等。

盡管上述方法可獲得三維多細胞球體，但仍存在局限性。如懸滴法可收獲大小均勻的球體，但體積調節受限，平均尺寸相對較小[19]，且產量低；懸浮法雖產量大，并可以控制大小[20]，但是此方法需特殊設備，混合產生的剪切流會損壞細胞；低黏附培養皿法無法控制球體大??；微流體法產生的球體很難收集并進一步分析[21]。未來應尋求一種操作簡單、成球效率高、成本低，易于推廣的三維多細胞成球法。

微孔芯片法和殼聚糖膜培養法是目前較新的2種三維培養方法。微孔芯片法可以獲得均勻并且可控大小的多細胞球體[18]。殼聚糖膜培養法簡單易行，無需特殊設備。細胞在殼聚糖膜上先黏附，殼聚糖中的氨基螯合Ca2+，將其表面的鈣轉移到細胞中，導致細胞運動活躍，細胞-殼聚糖黏附力小于細胞-細胞黏附力，最后細胞自組裝成多細胞球體[22-23]。

2.2 殼聚糖的性能及其應用

殼聚糖無毒且可降解，具有獨特而有利的特性，如抗微生物[24]、抗腫瘤[25]、抗氧化[24]和止血[26]。殼聚糖用于組織修復或再生的另一優勢是易于加工成多種形式，如薄膜，海綿和水凝膠。且其與細胞外基質多糖成分結構相似故具有高度生物相容性。另外，殼聚糖上參與球體形成過程的鈣信號相關基因的表達高于非黏附表面上的表達[27]。

3 三維多細胞球體在牙周組織再生中的應用研究

用聚乙二醇標記的微孔芯片培養PDLSC球體，發現其表達MSC標志物，這與單層培養PDLSC相似。與后者相比，PDLSC球體中干性相關因子的表達顯著增加；經成骨誘導培養后礦化結節形成能力、堿性磷酸酶活性和成骨相關基因的表達增強。動物模型中也有同樣的結果，PDLSC球體處理顯著增強小鼠顱骨缺損模型中新骨形成[28]。將人PDLSC和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)或共培養物接種到熱敏培養皿上制作細胞片。細胞片以3種不同的組合包裹在制備的人牙根片周圍，并將其植入小鼠體內。結果顯示，與對照組相比，在術后2、4和8周，實驗組出現牙周膜樣組織排列，在含HUVEC組中觀察到血管腔；且牙周膜再生、牙骨質形成和成骨在第4周和第8周時明顯增強[29]。在聚丙烯管中沉淀培養PDLSC球體，與二維培養相比，球體培養顯著增加PDLSC抗炎效應和血管生成能力[30]。

本課題組前期用殼聚糖膜法成功培養出PDLSC多細胞球體，細胞在球體內具有良好活性，且該方法具有以下優勢: (1) 技術簡單，成球效率高，重復性好；(2) 更高的多能性相關基因的表達；(3) 增殖、克隆形成和成骨分化能力增強[31]。因此，這些多細胞球體更適用于組織工程。

4 三維培養細胞促進組織再生機制

基于PDLSC牙周組織再生的一個主要問題是原代培養只產生少量的細胞，在臨床應用前需大量擴增。而PDLSC在體外擴增極易老化，且牙周炎癥微環境抑制PDLSC增殖和分化，從而降低PDLSC牙周再生能力。牙周再生另一重要因素是血凝塊的穩定[32]，血小板合成并釋放多種細胞因子和生長因子，如堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和內皮生長因子等[33-34]。

轉錄因子 Oct4、Sox2和Nanog對維持多能胚胎干細胞分化潛能至關重要[35]，這些干性標志物基因同樣存在于成體干細胞中[36]。與單層培養人DFC相比，DFC球體中Sox2、Oct4和Nanog表達顯著增加[37]。同時，研究[31]也發現PDLSC球體中Oct4、Sox2和Nanog的表達上升。另有研究表明，三維培養的牙髓干細胞具有優異的多向分化能力[38]。以上結果均證明三維成球培養可增強細胞的多向分化潛能。

此外，多細胞球體可提升抗炎能力[39]，因此更加適合應用于牙周炎癥微環境。研究發現，Wnt3a可促進PDLSC的增殖、遷移和成骨分化及牙槽骨再生[40]。與單層培養PDLSC相比，PDLSC球體抗炎相關基因腫瘤壞死因子α誘導蛋白6(tumor necrosis factor α-induced protein 6, TSG6)、環氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)表達顯著上調[39]。研究發現TSG6與細胞干性及Wnt通路相關: (1) 外源性應用TSG6可以顯著提高肝星狀細胞干性相關基因的表達[41]；(2) TSG6敲除的MSC增殖能力下降，多向分化能力喪失，Wnt通路受到抑制[42]。MSC球體分泌更多數量和類型除白介素和干擾素外的細胞因子。此外，MSC球體有助于分泌免疫反應相關的蛋白質，包括補體、免疫球蛋白和免疫細胞的眾多細胞表面分子，進一步分析發現，MSC球體激活神經活性配體-受體相互作用，觸發下游PI3K-Akt信號通路，抑制炎癥反應[43]。

多細胞球體血管生成相關基因的表達水平也有提高。PDLSC球體血管生成相關基因(VEGF、bFGF)表達水平較單層培養PDLSC提高[39]。與單層培養PDLSC相比，PDLSC球體和PDLSC與血管內皮細胞共培養球體中VEGF的表達都有所增高[44]。

已有多項研究發現PDLSC球體成骨分化潛能增強。PDLSC球體成骨潛力的增強通過一種Wnt信號通路拮抗劑SFRP3(secreted frizzled-related protein 3)介導的堿性磷酸酶激活來調節[28]；三維培養特異性激活了MAPK和NF-κB信號通路并改善了細胞凋亡效應，以促進MSC的再生潛力[45]。

綜上所述，三維培養可以激活Wnt、PI3K-Akt、MAPK和NF-κB通路相關基因，增強細胞干性、多向分化潛能、提升其抗炎能力，并上調多種生長因子和細胞因子。據此推測，三維培養可促進組織再生。

5 展 望

迄今為止，學者們為尋求一種理想的方法來促進牙周組織再生進行了大量的研究。三維多細胞球體有望成為促進牙周組織再生的可行性方法，但目前基于干細胞的牙周再生策略存在瓶頸: (1) 細胞在體外擴增過程中干性衰退，牙周再生能力降低，使其難以在臨床推廣應用；(2) 牙周炎癥微環境會降低PDLSC干性，抑制PDLSC增殖和分化，降低牙周再生能力。近年來研究發現三維多細胞球體不僅增強了細胞多向分化潛能，還提升了抗炎能力。因此，進一步研究PDLSC球體的干性維持、抗炎及免疫調控效應促進牙周組織再生，并探索相關機制，有望為炎癥微環境下牙周再生治療提供新的思路和策略。最后，PDLSC球體應用于牙周再生的安全性及可靠性還需大量動物模型研究和臨床試驗來證明。