E3泛素連接酶和小泛素蛋白樣修飾蛋白在子癇前期發病機制中的研究進展

周天凡， 姚莉萍， 顧盛奕， 花曉琳

(1. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院產科，上海 201204； 2. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院超聲科，上海 201204)

子癇前期(pre-eclampsia, PE)是妊娠中晚期出現的、一種以廣泛血管內皮損傷為特點的妊娠期特有疾病。多項研究表明其病因和發病機制可能與各種高危因素引起的子宮螺旋小動脈重塑不足有關[1]，導致滋養細胞和蛻膜病變引起胎盤低灌注，使得胎盤因子進入母體循環，從而引起內皮損傷以及系統性炎癥反應的激活，最終導致PE。

1 泛素化修飾與PE

1.1 泛素化修飾概述

蛋白質泛素化修飾是指一個或多個泛素分子在一系列酶的作用下與底物蛋白質共價結合的修飾過程。一般泛素化修飾的底物蛋白會被泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system, UPS)識別并降解，是下調蛋白表達的主要機制。UPS參與體內多種生理過程，包括轉錄調控、細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復及代謝、免疫和炎癥等。在人類細胞中有超過1 000種蛋白質調節泛素化[3]，泛素化失調能夠導致多種疾病，例如腫瘤、神經退行性疾病、肝臟疾病等。

整個泛素化過程可概括如下[4]: (1) E1泛素激活酶(E1)激活ATP和泛素；(2) E1將激活的泛素傳遞給E2泛素結合酶(E2)，形成E2-泛素中間產物；(3) E3泛素連接酶(E3)同時結合E2與底物蛋白，并促使E2泛素分子轉移到底物蛋白上[5]；(4) 上 述過程不斷重復，直到蛋白質上連接的多個泛素形成一條泛素鏈；(5) 真核生物體內負責降解蛋白質的26 s蛋白酶體識別被泛素化的底物蛋白并將其降解；(6) 去泛素化酶(deubiquitinase, DUBs)可逆地將蛋白從泛素分子上分離，避免蛋白過度降解并重新釋放出泛素單體，使泛素重新進入泛素蛋白酶體的循環，從而調節生物體內蛋白的平衡，見圖1。

圖1 泛素-蛋白酶體系統[6]Fig.1 Ubiquitin-proteasome system[6]

在泛素化修飾過程中，E3泛素連接酶通過特異性地識別并結合底物蛋白發揮了最為關鍵的作用。目前已知人類基因組中有多達600多種的特異性E3泛素連接酶。E3根據其生化和結構特點主要分為兩大家族: RING結構域家族和HECT結構域家族。RING家族的E3泛素連接酶可以促進泛素從E2直接轉移到底物蛋白，而HECT家族的E3泛素連接酶與同源的E2相互作用，然后與泛素形成硫酸鹽連接，隨后將泛素轉移至底物蛋白[7]。本文將著重探討E3泛素連接酶在PE發病機制中的作用。下面將闡述參與PE發病機制泛素化修飾的E3泛素連接酶。

1.1.2 SCFFBW2介導GCM1泛素化降解 SCF(skp1-cullin1-F-box)復合體屬于RING家族的E3泛素連接酶，主要由SKP1(S-phase kinase-associated protein 1)、CUL1(cullin-1)、F-box蛋白組成。SCF復合體中由F-box蛋白特異性識別底物并針對底物進行泛素化，隨后調節細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡、血管生成和轉移等過程。F-box蛋白有3個主要的亞家族: FBXW、FBXL和FBXO亞家族[8]。

FBW2(F-box and WD repeat domain containing 2 protein)屬于FBXW家族。Yung等[9]研究發現，FBW2介導的泛素化促進膠質細胞缺失因子1(Glial cells missing homolog 1, GCM1)降解。GCM1是胎盤發育中重要的轉錄因子，通過調節胎盤生長因子、人合胞素1以及HtrA絲氨酸肽酶4的表達，在介導滋養層細胞分化中起關鍵作用。Chiang等[10]研究顯示，低氧通過抑制磷脂酰肌醇3激酶-(phosphoinositide 3-kinases, PI3K)-蛋白激酶B(proteinkinase B, AKT)信號通路，激活下游的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)，這是參與胎盤植入過程的重要信號通路之一[11]。被激活的GSK-3β對GCM1蛋白322位點的絲氨酸磷酸化修飾，進而招募FBW2，介導GCM1泛素化降解。因此在低氧情況下，胎盤中GCM1及其靶基因胎盤生長因子、人合胞素1的表達減少，而HtrA絲氨酸肽酶4表達增加，影響滋養細胞融合和胎盤血管生成，導致胎盤發育異常從而引起PE[12]。而GSK-3β的抑制劑LiCl可減少缺氧誘導的SCFFBW2介導的GCM1 泛素化降解，提示靶向PI3K-AKT-GSK-3β對于治療PE潛在作用的相關機制。

1.1.3 SCFβ-TrCP介導Snail泛素化降解 β-轉錄重復包含蛋白(beta-transducin repeat-containing pro-teins, β-TrCP)也稱為FWD1，屬于FBXW蛋白家族。通過調節底物蛋白的降解，β-TrCP參與各種細胞過程，包括細胞遷移和侵襲。

上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transi-tion, EMT)是絨毛外滋養細胞獲得遷移和浸潤能力的重要過程，而轉錄因子Snail通過抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達來促進EMT，與胚胎發育和腫瘤侵襲密切相關[13]。研究發現β-TrCP表達在PE中增加，介導其下游底物Snail發生泛素化降解，抑制滋養細胞的EMT過程使其浸潤不足，導致胎盤淺著床并促進PE的發展。

另外，Wu等[14]的研究顯示，β-TrCP過表達還可能通過泛素化降解NF-κB的抑制蛋白IκB以及β-連環蛋白來抑制血管內皮細胞生長因子受體2的表達。因此，β-TrCP表達升高不僅能抑制滋養細胞EMT，也可能導致血管生成相關因子缺乏，從而促進PE的發生發展。Wu等[15]的研究顯示，miR-135a-5p通過靶向β-TrCP促進滋養層細胞的遷移和侵襲，提示靶向β-TrCP對于治療PE的潛在機制。

細胞周期蛋白G2(cyclin G2 protein, CCNG2)通過誘導G1/S期停滯對細胞周期進程有明顯的負性調控作用，過去有很多研究顯示CCNG2可能與惡性腫瘤和糖尿病腎病等疾病有關。而近年來的研究顯示，在PE胎盤中，CCNG2的表達增加并且與滋養細胞功能障礙有關。Sun等[16]的研究表明，PE中CCNG2過表達使得RNF123的水平增加，并且加強了RNF123與蓬亂蛋白2(dishevelled segment polarity protein 2, Dvl2)的結合，通過UPS誘導Dvl2過度降解。Dvl2是Wnt信號通路的轉導樞紐，而Wnt信號通路對于調節凋亡、侵襲及氧化應激反應起著重要作用。因此Dvl2表達減少抑制了非經典Wnt/PCP-JNK信號通路及其下游效應物，包括EMT相關蛋白，因而導致滋養細胞浸潤不足促進PE的發展。CCNG2/RNF123/Dvl2/JNK軸可能通過滋養細胞功能調節參與PE的發病機制和進展，從而可能為治療PE提供新的靶點和治療策略。

1.1.5 Cbl介導Met泛素化降解 Cbl(casitas B-lineage lymphoma, Cbl)屬于RING家族E3 泛素連接酶，通過介導多種受體的泛素化和降解參與免疫調節[17]、Wnt/β-catenin信號轉導[18]或血管內皮生長因子信號轉導[19]等細胞生命過程。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是胎盤發育的重要調節因子。一旦配體HGF與其受體Met結合，就會發生二聚化和磷酸化，激活MEK/Erk、PI3K等多種下游信號通路，通過影響滋養細胞遷移、侵襲和血管重塑，調節滋養層功能[20]。Li等[21]的研究顯示，HGF與Met的結合觸發了Met的磷酸化和下游的Erk信號級聯，并啟動了窖蛋白-1(Caveolin-1, CAV-1)耦合的內吞作用以及Cbl介導的Met的泛素化降解，從而調控滋養細胞的分化。而滋養細胞長期缺氧會誘導Met通過CAV-1耦合作用導致過度內吞，并阻礙Met的蛋白酶體降解，共同導致Met蛋白在細胞內的累積增加，使得HGF/Met信號無法調節滋養細胞侵襲，進一步由于滋養細胞對子宮螺旋動脈的重塑受限而加劇胎盤缺氧，從而形成惡性循環，最終可能導致早發型PE的發生。Rahman等[22]的研究設計了一種新型串聯泛素結合模體(ubiquitin-interaction motif, UIM)肽，通過競爭性抑制內吞作用相關蛋白epsin與血管內皮生長因子受體2的UIM結構域依賴性結合，促進了c-Cbl介導的epsin泛素化，在調節血管生成障礙性疾病的治療中發揮作用，為治療PE提供了潛在靶點。

1.1.6 CRL3介導底物蛋白泛素化 Cullin3-RING連接酶(Cullin3-RING ligase, CRL3)屬于Cullin-RING連接酶超家族，是最常見的一類E3泛素連接酶[23]，包含Cullin3支架蛋白、RBX1環指蛋白和含有BTB結構域的底物適配蛋白，識別并招募底物蛋白參與泛素化降解過程[24]。Zhang等[25]的研究發現，CUL3的豐度和nedd化水平，以及RhoBTB1、KLHL2等CUL3的底物適配蛋白在PE胎盤螺旋動脈中表達明顯減少；而CRL3的底物，包括PDE5、WNK3和RhoA表達增加。其中，PDE5的累積損害血管舒張；而RhoA與WNK3和WNK1共同作用，促進血管收縮并誘導血管平滑肌細胞的增殖[26]。表明CUL3-KLHL2-WNK3/WNK1和CUL3-Rho-BTB1-PDE5信號的功能障礙破壞了血管收縮和血管擴張的平衡，導致PE胎盤螺旋動脈的異常重塑，從而引起胎盤血流減少、促進胎盤缺血缺氧，促進了PE患者的進行性高血壓。

臨床研究表明，PE患者易出現水鈉潴留[27]，表明腎小管功能障礙可能促進PE中高血壓的發展。Zhang等[25]的進一步研究發現，PE小鼠腎臟中CUL3的豐度和nedd化水平下降，其在腎臟表達的特異性底物適配蛋白KLHL3水平同樣降低。升高的底物蛋白WNK4、WNK1磷酸化并激活下游SPAK/OSR1和噻嗪類敏感的Na-Cl協同轉運蛋白(NCC)并且損害血管舒張功能，證明遠端腎小管的WNK激酶激活同樣促進PE的高血壓，而血管和腎臟遠曲小管結構重塑可能有助于解釋為什么PE患者遠期較大的心血管疾病和腎臟疾病風險[28]。而質子泵抑制劑治療可以部分減少PE小鼠模型中PDE5、WNK激酶和RhoA/ROCK活性的積累，強調了質子泵抑制劑治療PE的可能機制以及應用前景。

1.1.7 MULE介導p53、Mcl-1泛素化降解MULE(Mcl-1 ubiquitin ligases E3)是一個特異性調節髓細胞白血病因子1(myeloid cell leukemia sequence 1, Mcl-1)蛋白穩定性的E3泛素連接酶，屬于HECT家族E3泛素連接酶。

Mcl-1是B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)家族蛋白中重要的抗凋亡蛋白成員，在多種惡性腫瘤(急性細胞性白血病、多發性骨髓瘤等)中呈高表達，通過與p53等促凋亡蛋白相互作用，抑制腫瘤細胞凋亡。而在PE中，缺氧環境使得MULE表達受到低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)和轉化生長因子-β3影響而增加，上調的MULE優先結合并降解p53。由于p53可通過Bcl-2家族蛋白影響凋亡，因此p53表達減少引起促凋亡的Mcl-1可變剪接體Mcl-1c表達增加[29]，導致滋養細胞過度凋亡而使滋養細胞浸潤能力減弱，引起胎盤淺著床和血管重塑障礙，繼而促進PE的發生。

1.2 其他參與PE發病機制泛素化修飾的分子

由于E3泛素連接酶在PE發病機制中作用的研究尚處于早期階段，目前的研究提出了一些可能影響PE發病機制的泛素化途徑。Yuan等[30]的研究表明，缺氧時HIF-1α表達增加導致E3泛素連接酶斑點型鋅指結構蛋白表達增加，可能通過靶向PI3K/AKT/GSK-3β通路抑制滋養細胞的浸潤，從而導致PE的發生；Zhao等[31]的研究假設，PE胎盤中泛素特異性蛋白14的上調可能通過去泛素化過程激活NF-κB，從而上調胎盤中促炎癥細胞因子的表達，通過調節炎癥反應來促進PE的進展；Li等[32]的研究發現，PE胎盤滋養細胞中泛素特異性蛋白5呈現低表達，下調了β-catenin及其下游信號c-Myc和Cyclin D1的表達從而抑制滋養細胞的增殖；Yang等[33]的研究發現，PE胎盤中單克隆非特異性抑制因子β表達減少，通過蛋白酶體降解胰島素樣生長因子2抑制滋養細胞侵襲[33]。

2 小泛素樣修飾與PE發病機制

2.1 小泛素樣修飾概述

各種PTM并不是孤立的，彼此之間存在交互應答和相互作用，其中泛素化修飾與類泛素化修飾之間關系密切。小泛素蛋白樣修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier proteins, SUMO)作為其中一種類泛素修飾因子，與泛素分子的二、三級結構以及酶級聯的修飾過程極其相似，但兩者的作用不盡相同。泛素化修飾主要介導底物蛋白降解，而SUMO化、去SUMO化修飾則主要在SUMO分子以及SUMO特異性蛋白(sentrin specific protease, SENPs)的調節下[34]，通過增強底物蛋白的穩定性，在蛋白質相互作用等方面參與細胞生命過程的調控[35]。哺乳動物表達SUMO1-4這4種SUMO蛋白同種型，其中SUMO-2和SUMO-3由于高序列相似性(97%)而經常被描述為SUMO-2/3。

2.2 PE胎盤中SUMO化修飾水平增加

分子機制導致滋養細胞發育異常引起胎盤功能障礙與產科并發癥有關[36]。研究顯示，通過影響蛋白質穩定性、活性和細胞內定位，SUMO化修飾通過引起胎盤轉錄因子GCM1[37]、下游調控元件拮抗分子[38]、p53[39]以及HIF-1α[40]等的表達變化調節滋養細胞分化，而這些轉錄因子經證明與PE的發病機制密切相關[41-43]。

Baczyk等[44]的研究發現，胎盤中SUMO蛋白的表達呈現出時空差異。SUMO-1和SUMO-4在孕早期定位于細胞滋養層，并隨著妊娠的發展遷移至合體滋養層；相反，SUMO-2/3在整個妊娠期間均勻分布在整個細胞滋養層和合體滋養層中。而在模擬PE胎盤的氧化應激條件下，SUMO-1和SUMO-4的SUMO化水平顯著增加、并且細胞質中SUMO-1和SUMO-4蛋白的表達增加；而SUMO-2/3則易位到細胞核，其生物利用度和轉錄活性受到抑制。Baczyk等[42,45]的研究結果證明SUMO化修飾在正常人類胎盤發育起著重要作用，而各種細胞應激源能夠在胎盤中誘導SUMO蛋白在細胞內、外的差異分布，導致PE胎盤表現出過度SUMO化，從而表明了SUMO化修飾的動態調節與PE等疾病呈現的胎盤功能障礙密切相關。下面將闡述參與PE發病機制SUMO化修飾的具體分子。

2.2.1 Ct-7的SUMO化修飾 Snider等[46]的研究表明特別是在氧化應激的環境下，SUMO化修飾在調節細胞骨架蛋白中起著非常重要的作用。而Baczyk等[44]通過質譜分析發現，人胎盤JAR細胞中最豐富的SUMO化靶標屬于角蛋白家族。在進一步分析蛋白質相互作用的研究中證實，相對于SUMO-2/3而言，人胎盤JAR細胞在氧化應激以及炎癥情況下，SUMO-1、SUMO-4與細胞角蛋白-7(cytokeratin-7, Ct-7)之間的相互作用明顯增加，進一步證實了Ct-7是胎盤SUMO化修飾的靶標。

Riquelme等[47]的研究顯示，人PE胎盤顯示出50%的Ct-7表達下調，認為PE胎盤中Ct-7表達水平下調引起滋養層細胞骨架變弱，從而導致滋養層碎片更多進入母體循環中，顯示出PE胎盤滋養細胞凋亡和壞死物質脫落增加的特點。而Baczyk等[44]的研究數據表明，在人類胎盤中，Ct-7的SUMO化修飾損害細胞骨架絲的穩定性，可能與滋養層細胞骨架重塑有關，表明Ct-7的SUMO化修飾與PE胎盤功能障礙相關。

2.2.2 HIF-1α的SUMO化修飾 HIF-1α作為缺氧敏感調節因子，通過調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor-A, VEGF)、可溶性血管內皮細胞生長因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1, sFlt-1)等靶基因的表達，在PE胎盤中表達異常升高并抑制滋養細胞增殖和浸潤能力，導致胎盤淺著床、血管重塑障礙而引起PE。Bhattacharjee等[48]的研究證明，PE胎盤缺氧、氧化應激的環境使得HIF-1α在常氧情況下經SUMO化而發生的羥化以及泛素化降解受到抑制，同時SENP3轉位激活并介導HIF-1α進行去SUMO化，使HIF-1α在PE胎盤中呈現穩定性高表達，進一步調控VEGF、sFlt-1的表達并形成惡性循環，引起一系列PE的相關癥狀。

2.2.3 SATB1的SUMO化修飾 特異AT序列結合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein 1, SATB1)已經被證實可促進多種惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移[49]，最近的研究還表明SATB1參與了胚胎的分化和發育。Rao等[50]的研究發現，從妊娠早期開始SATB1在胎盤的高侵襲性滋養層中呈高表達，并隨著妊娠的進展逐漸減少，提示SATB1與滋養層功能的調節之間存在相關性。此外在PE胎盤中滋養細胞的遷移和侵襲潛能明顯降低，并伴有SATB1的表達顯著下降，證實了下調的SATB1表達與滋養層功能受損有關。

以往的研究表明SATB1蛋白的生物學功能影響Wnt/β-catenin信號通路[51]。Wnt/β-catenin信號通路已被證明參與調控滋養細胞的功能，其中β-catenin的表達在PE胎盤中顯著降低。Rao等[52]的研究發現，氧化應激誘導SATB1在lysine-744處的SUMO化修飾并降低了SATB1的蛋白水平及其穩定性；而較高的SATB1水平則增加了β-catenin水平，減少了活性氧(ROS)累積以及細胞凋亡，同時促進了滋養細胞遷移和侵襲。證實了PE胎盤氧化應激的情況誘導了SATB1蛋白的SUMO化修飾，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路損害滋養細胞遷移和侵襲能力。其中，使用WNT/β-catenin信號通路特異性抑制劑DKK1減弱了上調的SATB1表達對受損滋養細胞的恢復作用，提示靶向SATB1和Wnt/β-catenin信號通路對于治療PE的潛在機制。

3 結 語

PE是妊娠期特有的常見并發癥，泛素化修飾和類泛素化修飾中的小泛素樣修飾在PE的發病機制中起重要作用。作為泛素化修飾的重要酶，包括RING家族的SCFFBW2、SCFβ-TrCP、CCNG2、Cbl、CRL3以及HECT家族的MULE等在內的E3泛素連接酶在不同方面影響PE發病機制；而類泛素化修飾中的小泛素樣修飾則主要通過Ct-7、HIF-1α、SATB1等蛋白經SUMO化、去SUMO化修飾影響PE發病機制的進展，并為PE治療提供了潛在靶點和治療策略。目前泛素化修飾與類泛素化修飾在PE發病機制中的研究尚處于早期階段，有待進一步對于參與PE發病機制的泛素化和類泛素化分子進行研究，并且利用相關分子的修飾機制開發針對修復滋養細胞損傷的小分子藥物治療PE。