微RNA與食管癌順鉑耐藥

鐘 譽，陳 揚，吳靈飛

(汕頭大學醫學院第二附屬醫院消化內科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。最新數據顯示，2020年全球新發食管癌約60.4萬例，食管癌死亡病例約54.4萬例，食管癌患病率居所有惡性腫瘤第7位，病死率居第6位[1]；我國每年因食管癌死亡的患者人數居惡性腫瘤的第4位[2]。食管癌分為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌兩種類型。食管鱗狀細胞癌約占所有食管癌病例的90%，是最常見的組織學類型。大部分食管癌早期臨床癥狀不明顯，就診時多數已為中晚期。食管癌的治療以手術及放化療為主，順鉑是治療局部進展期及轉移性食管癌的一線藥物，病人早期治療效果明顯，但其耐藥性是導致治療失敗的重要原因[3]。美國癌癥協會研究表明，90%以上的腫瘤患者會不同程度地受到所用化療藥物的耐藥性影響[4]。因此，研究耐藥的機制及尋求耐藥逆轉的有效方法成為新近研究的熱點。Guo 等[5]首次發現，miRNA在食管癌組織中存在差異表達譜，越來越多研究證實，miRNA在食管癌中存在差異表達，調控癌基因調控水平進而影響食管癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物學行為，從而影響食管癌細胞對順鉑的敏感性。本文就miRNA在食管癌順鉑耐藥中的研究進展作一綜述。

1 順鉑耐藥的機制

順鉑主要通過與腫瘤細胞DNA 結合形成Pt-DNA 加合物，導致DNA 結構改變，DNA 復制、轉錄障礙，造成腫瘤細胞死亡。然而，在此過程中常出現內源性耐藥或獲得性耐藥，即腫瘤本身內在的和因基因突變或獲得外源性耐藥基因所導致的耐藥性。其主要機制包括促進藥物排出胞內和減少藥物蓄積、增強藥物滅活及DNA修復、產生保護性自噬、抑制凋亡信號傳導和間接調控因子的改變等。具體見圖1。

圖1 miRNA參與順鉑耐藥機制的調控

1.1 減少順鉑攝取

鉑類藥物發揮細胞毒作用的第一步是進入細胞。此過程較復雜，尚未完全揭示清楚。目前認為，順鉑的攝取主要是由哺乳動物中的銅轉運蛋白介導。順鉑可引發銅轉運蛋白快速降解而導致順鉑攝入減少，導致順鉑耐藥[6]。鈉泵、有機陽離子轉運蛋白2、P 型ATP 酶轉運蛋白的表達亦影響鉑類藥物的入胞過程。此外，內吞作用也是鉑類入胞的另一種機制，內吞作用降低可導致順鉑耐藥[7]。

1.2 加速順鉑外排

鉑類藥物進入細胞后，通過轉運體出胞是導致藥物在胞內濃度降低的另一個原因。P 型ATP 酶轉運蛋白和ABC轉運蛋白是參與順鉑外排的兩種主要轉運蛋白。順鉑通過激活P型ATP酶轉運蛋白的催化循環，使其N端金屬結合結構域的半胱氨酸殘基處結合順鉑，形成穩定的Pt2+-S鍵。該反應將鉑類藥物螯合到分泌途徑的囊泡中，加速順鉑外排，導致胞內藥物毒性降低[8]。ABC轉運蛋白家族有7個亞家族成員（從ABCA到ABCG），其中多種藥物耐藥相關基因 （MRP） 組 成 的 C 亞 家 族 （ABCB1/PGP、 ABCC1/MRP1、 ABCC2/MRP2、 ABCC3/MRP3、 ABCC4/ MRP4 和ABCC5/MRP5）成員參與了順鉑耐藥的調控[9]。

1.3 加速胞漿內失活

順鉑進入細胞后，可因細胞解毒機制在漿內失活而產生耐藥。其胞漿失活的主要形式是：谷胱甘肽和金屬硫蛋白通過硫醇基團配位與順鉑結合，抑制氧化應激、保護細胞免受自由基損傷而降低順鉑毒性。另外，與順鉑結合的谷胱甘肽更容易通過轉運蛋白出胞而減少藥物在細胞內累積，從而減少了順鉑的抗癌效果[10]。

1.4 促進DNA修復

Pt-DNA 加合物修復系統被認為是順鉑耐藥的主要機制，順鉑誘導的DNA加合物能夠阻斷轉錄和DNA合成，進而觸發復雜的細胞內信號轉導級聯反應。在修復受損或過度損傷的情況下，細胞發生凋亡。為了抵制順鉑引起的大量細胞死亡，細胞會啟動一系列DNA修復系統，包括核苷酸切除修復、錯配修復、同源重組和非同源末端連接等[11]。

1.5 跨損傷DNA合成

當DNA 損傷無法修復時，細胞可以利用跨損傷DNA合成提高其對DNA 損傷的耐受性?？鐡p傷DNA 合成由具有廣泛催化位點且缺乏校對活性的Y 家庭聚合酶（Polη、Polι、Polκ和Rev1）和B家族聚合酶執行[12]，使細胞通過加合物復制DNA，避免復制叉崩潰和死亡信號，造成腫瘤細胞對鉑類藥物誘導DNA損傷的耐受性[13]。

1.6 改變細胞存活途徑

當細胞暴露于順鉑等鉑類藥物后，促細胞生存和凋亡信號通路會被同時觸發。細胞的最終命運取決于這些相反信號的相對強度和持續時間。MAPK 通路（包括ERK、p38和JNK）是抑制細胞凋亡的通路，研究表明，MAPK通路激活與順鉑耐藥有關[14]。TP53可以根據細胞環境觸發促生存或促凋亡信號。研究表明，順鉑耐藥與TP53功能缺陷有關。Timmerman 等[15]研究發現，TP53缺失可促進縱隔來源的生殖細胞腫瘤對順鉑耐藥。除此之外，順鉑治療過程中會增加活性氧水平，導致DNA損傷、細胞器斷裂、線粒體功能破壞和ATP 耗竭，促進細胞凋亡。Pan 等[16]報道，自噬途徑亦與順鉑耐藥性相關。自噬是一種分解代謝途徑，根據應激條件回收必需成分。順鉑可誘導細胞自噬，并通過減少凋亡及增強DNA修復而介導耐藥[17]。

1.7 改變生物信息傳導通路

研究發現實體瘤細胞在缺氧條件下會誘導順鉑耐藥。缺氧轉錄程序主要由HIF 轉錄因子激活。HIF 轉錄因子可以調節多達2%的人類基因組的轉錄，從而影響細胞凋亡或細胞存活[18]。順鉑進入細胞后，會導致內質網應激，觸發未折疊蛋白反應。大量研究表明，內質網應激誘導的分子伴侶活性增加與順鉑耐藥相關[19]。此外DNA甲基化表觀遺傳學改變[20]，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[21]以及 MYC、TGFβ、MYC、RTK 等[13]信號通路改變均參與了順鉑耐藥的調控。

2 miRNA

miRNA 是一類豐富的調節性非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于真核生物中，長度約為19～23個核苷酸，這是一類在動植物中新發現的基因表達調控因子，它們通過靶向mRNA、誘導翻譯抑制和mRNA 降解來調節基因表達[22]。最初發現miRNA時研究人員并沒有意識到它們的重要性。第一個被確認的miRNA 是在線蟲體內發現的lin-4基因，并且認為是線蟲獨有的。然而，通過傳統的克隆方法和生物信息學手段發現在線蟲、果蠅、哺乳動物中存在著數百個miRNA，這引起了各領域科學家的重視。據估計，在人類基因組中至少存在300～1 000 個miRNA，miRNA已成為最大的一類基因表達調控因子[23-25]。

雖然目前已揭示出miRNA的生物學功能，但如何精確地鑒定miRNA所靶向的基因仍是一項嚴峻的挑戰。多項研究發現，1 個miRNA 可以結合多達200 個靶基因，而這些靶基因可以行使不同的功能，包括受體、分泌蛋白、轉運蛋白及轉錄因子[26]。初步推算，miRNA 可能參與人類1/3基因的調控，其中包括與癌癥相關的基因表達[27]。研究表明，miRNA 通過調控癌基因表達發揮促癌或抑癌作用[28]。miRNA通過調節細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關的靶基因而導致細胞生物性狀的改變，進而影響腫瘤的進展[29]。miR-34 是第一個被證明受腫瘤抑制基因p53直接調節的miRNA[30]，其與腫瘤的發生及進展有關。

3 miRNA參與順鉑耐藥的機制

與化療敏感的食管癌細胞相比，順鉑耐藥的細胞呈現不同程度的miRNA 表達失調。miRNA 主要通過影響細胞生物學行為及相關信號通路參與順鉑耐藥的調控。

3.1 調節細胞增殖與凋亡

Zuo 等[31]證實過表達 miR-153-3p 通過下調 NRF2 來抑制ESCC 細胞增殖并增加順鉑抗癌的敏感性。Liu 等[32]發現，ESCC 細胞中過表達miR-455-3p 可通過激活Wnt/β-catenin 和 TGF-β/Smad 通路誘導 ESCC 呈現腫瘤干細胞特征，促進腫瘤的發生及耐藥性。Zhao 等[33]研究表明，miR-125a-3p 上調可抑制STAT3 信號通路，增加ESCC 細胞凋亡，降低其對順鉑耐藥。miR-10b被證實是多種惡性腫瘤中的癌基因，也參與了介導食管癌順鉑耐藥的調控。Wu 等[34]研究證實過表達miR-10b 介導PPARγ表達下調，激活AKT/mTOR/P70S6K 信號傳導，抑制食管癌細胞凋亡并增強其耐藥。Shi等[35]報道，外泌體過表達miR-193可下調TFAP2C，減少順鉑對食管癌細胞周期蛋白的抑制，促進食管癌細胞分裂增殖而導致耐藥。Zhu 等[36]研究發現ESCC中上調的miR-106b-3p通過與蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶E 3′UTR 序列結合負性調控蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶E 表達而抑制細胞凋亡，誘導ESCC 對順鉑耐藥。Zheng 等[37]報道，過表達miR-145 可通過下調MRP1 和P-gp 蛋白表達抑制AKT3，增強其對順鉑化療的敏感性。失調的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在食管癌順鉑耐藥中亦起著重要作用，miRNAs作為lncRNAs 下游反應物常參與其中。Chang 等[38]研究發現，上調的circ_0007142通過海綿樣吸附miR-494-3p促進LASP1表達從而抑制細胞凋亡，提高食管癌細胞對順鉑的耐受性。Zhu 等[39]研究表明，lncRNA-EMS 通過下調miR-758-3p 促進WTAP 表達，可抑制ESCC 細胞凋亡并促進順鉑耐藥。Liu等[40]證實lncRNA FOXD2-AS1充當競爭性內源性RNAs 靶向吸附miR-195，通過活化AKT/mTOR 信號通路促進ESCC 細胞生長，抑制其凋亡并產生順鉑耐藥。Cheng 等[41]報道，下調miR-873-3p 可激活SOX4/Wnt/β-catenin 信號通路進而促進ESCC 細胞增殖，提高其順鉑耐藥性。Wang 等[42]研究表明，lncRNA-LINC00261 海綿樣吸附miR-545-3p下調MT1M表達以促進ESCC細胞凋亡進而抑制順鉑耐藥。

3.2 影響細胞遷移和侵襲能力

Yan 等[43]研究發現，過表達的miR-624 通過抑制ARRDC3 表達從而上調YAP 表達并激活HIF1α信號通路，促進細胞遷移和侵襲能力，增加ESCC 細胞順鉑耐藥。Yang 等[44]報道，過表達 miR-21 通過下調PDCD4的 mRNA和蛋白水平，增強食管癌細胞的侵襲能力并誘導順鉑耐藥性產生；Wan 等[45]研究證實，miR-21 通過下調PTEN表達促進食管癌細胞順鉑耐藥。Jia 等[46]研究證實lncRNA NORAD 通過海綿樣吸附miR-224-3p，上調異黏蛋白（metadherin，MTDH）表達以促進ESCC 細胞遷移和侵襲，并產生順鉑耐藥。有關mRNA參與食管癌順鉑耐藥調控及其機制詳見表1。

表1 miRNA與食管癌順鉑耐藥的關系

4 小結與展望

總之，作為近年非編碼RNA 家族中的一個新研究熱點，miRNA在食管癌化療耐藥中的作用已得到越來越多研究的證實。miRNA通過調控mRNA，誘導食管癌細胞的發生、發展。在對食管癌進行新輔助化療及姑息治療過程中，miRNA不僅可以作為化療藥物的直接治療靶點，另外由于其具有高度穩定性，易于在外周血、尿液和唾液中被檢測，因此，還可用于腫瘤的診斷、預后和療效的觀察。雖然目前尚無miRNA用于抗癌治療的臨床報道，但是相信在不久的將來，隨著miRNA參與腫瘤發生及耐藥機制更深入的研究，開發針對miRNA的靶向藥物有望在腫瘤治療中探索出一條新途徑。