非酒精性脂肪性肝病患者髓源性抑制細胞和白介素-6的初步研究

莊靜華，李明凱，陳式儀，王貸明

（1.汕頭市中心醫院風濕科，廣東 汕頭 515041；2.中山大學第三附屬醫院消化內科，廣東 廣州 510000；3.汕頭大學醫學院第二附屬醫院內分泌與風濕科，廣東 汕頭 515041；4.汕頭大學醫學院第二附屬醫院心內科，廣東 汕頭 515041）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒和其他明確的肝損害因素所致的、以肝實質細胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征。NAFLD 根據肝臟病理學形態的不同，分為非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細胞癌[1]。髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC） 存在于大多數癌癥患者中，它是一群位于B細胞、T細胞上游的免疫調節細胞，包括早期髓系祖細胞和不成熟的粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等。在正常情況下，骨髓中的造血干細胞分化為未成熟髓樣細胞，進一步分化為成熟的粒細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞，但在感染、腫瘤、器官移植或炎癥性疾病等病理狀態下，未成熟髓樣細胞分化受阻并失去分化能力，即成為MDSC[2]。MDSC分為單核型MDSC（monocytic-MDSC，Mo-MDSC）和多核型/粒細胞型 MDSC （granulocytic-MDSC，G-MDSC)。MDSC 與肝臟炎癥、纖維化和肝細胞癌的發病機制有關[3-4]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）被認為可抑制氧化應激和線粒體功能紊亂，從而保護肝臟，而肝細胞與周圍脂肪細胞也能分泌IL-6，IL-6 又能介導和促進巨噬細胞浸潤，在NAFLD 的發生發展中發揮重要作用[5]。目前MDSC 在NAFLD 患者中的表達情況研究較少，MDSC 是否影響NAFLD 進展為肝細胞癌也未見相關報道。本研究探討NAFLD 患者外周血中MDSC和IL-6的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018—2019 年在汕頭大學醫學院第二附屬醫院就診的NAFLD 患者30 例（NAFLD 組）和同期健康體檢者30 名（正常對照組）。NAFLD 患者均符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》[1]中的相關診斷標準：（1）無過量飲酒史（男性飲酒折合乙醇量＜30 g/d，女性＜20 g/d）；（2）具有彌漫性肝細胞脂肪變的影像學或組織學證據。排除標準：（1）全胃腸外營養、病毒性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、肝豆狀核變性等可導致脂肪性肝病的特定疾??；（2）伴有感染（慢性乙型肝炎、肺結核等）、惡性腫瘤、自身免疫性疾?。?型糖尿病、橋本甲狀腺炎、炎癥性腸病等）、嚴重心肺疾病、嚴重腎功能不全等。本研究經汕頭大學醫學院第二附屬醫院倫理委員會審查批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

抗人HLA-DR-APC 抗體、抗人CD11b-PC5抗體、抗人CD33-PE 抗體、抗人CD14-FITC 抗體及IgG 同型對照均購自美國Biolegend 公司，IL-6和酶聯免疫檢測試劑盒購自英國Abcam 公司，EPICS XL 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，EnSpire酶標儀購自美國PerkinElmer公司。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血單個核細胞的分離收集所有研究對象空腹狀態下肘靜脈血2 mL，置于EDTA 抗凝管中。取100 μL人外周血，加入2 mL流式細胞分析用溶血素，冰浴10 min，350×g離心5 min；棄上清，加入10 mL 磷酸鹽緩沖液洗細胞1 次，350×g離心5 min，棄上清后，重懸計數。

1.3.2 流式細胞術將新鮮分離的外周血單個核細胞濃度調整為1×107個/mL，每管100 μL，加入相應的表面標記抗體（CD14、CD33、CD11b、HLA-DR），混勻后室溫避光孵育30 min。加入2 mL 的細胞染色緩沖液重懸細胞，350×g離心5 min，棄上清，加入0.1 mL的細胞染色緩沖液重懸細胞，在1 h 內上流式細胞儀檢測。以CD11b+CD33+HLA-DR-定義為MDSC，CD11b+CD14-CD33+HLA-DR-定 義 為 G-MDSC，CD11b+CD14+CD33+HLA-DR-定義為Mo-MDSC。采用FlowJo軟件分析MDSC、G-MDSC、Mo-MDSC 占外周血單個核細胞的比例。

1.3.3 血清中IL-6的檢測收集NAFLD組和正常對照組研究對象空腹狀態下肘靜脈血3 mL，置于非抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，吸取血清分裝于無菌管中，按照酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書的操作步驟檢測IL-6的濃度。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和四分位數 間 距 [M（Q1，Q3）]表 示 ， 組 間 比 較 采 用Mann-WhitneyU檢驗。采用Spearman 相關分析判斷MDSC 及其亞型、IL-6 與丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶等臨床指標的關系。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAFLD 組和正常對照組基本的器官功能指標和臨床實驗指標的差異情況

NAFLD 組男性15 例，女性15 例，年齡64（50，75），正常對照組男性14例，女性16例，年齡27（24，41）。NAFLD 組和正常對照組年齡、白細胞計數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、嗜酸性細胞百分比、嗜堿性細胞百分比、血紅蛋白、紅細胞壓積差異有統計學意義（P值均＜0.05），見表1。

表1 NAFLD組和正常對照組基本的器官功能指標和臨床實驗指標的差異情況（n=30例）

2.2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 和IL-6 在NAFLD組和正常對照組外周血中的表達情況

與正常對照組對比，NAFLD 患者外周血單個核細胞中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 的比例均降低（P值均＜0.05），IL-6 的表達水平升高（P＜0.001），見表2。

表2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6在NAFLD組和正常對照組外周血中的表達情況［n=30例，M（Q1，Q3）］

2.3 NAFLD 患者外周血MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6與臨床實驗室檢查指標的相關性

G-MDSC 比例與丙氨酸轉氨酶/天冬氨酸轉氨酶 （alanine aminotransferase/ aspartate aminotransferase，ALT/AST） 呈 負 相 關 （r=-0.403，P=0.030）；G-MDSC與體重指數、AST、ALT、甘油三酯、低密度脂蛋白等其他指標間無相關性（P值均＞0.05）；MDSC、Mo-MDSC、IL-6 與臨床實驗室各檢查指標間無相關性 （P值均＞0.05）。NAFLD 患者外周血中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 比例與IL-6的表達水平均無相關性。見表3。

表3 NAFLD患者外周血中G-MDSC與臨床實驗室檢查指標的相關系數

3 討論

目前，國際范圍內MDSC 與NAFLD 的相關性研究較少，大多數以小鼠為研究對象且尚無定論。在動物模型方面，Chen 等[6]發現與正常對照組小鼠相比，高脂飲食誘導產生的NAFLD小鼠肝臟組織中MDSC 的比例明顯增加。Yao 等[7]發現NAFLD 模型小鼠肝臟非實質細胞中的MDSC 比例比正常對照組高。Li等[8]發現膽堿缺乏氨基酸限制飲食誘導的NASH模型小鼠骨髓中的MDSC比例較正常對照組顯著升高（P＜0.05），肝組織中MDSC比例較正常組顯著降低（P＜0.001），外周血中MDSC 的比例與正常組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究發現 NAFLD 患者外周血中MDSC 比例比正常對照組明顯減少（P＜0.05）。這可能是一種“歸巢現象”，即在NAFLD 的慢性病程中，骨髓產生的MDSC 通過血液被募集到炎癥部位肝臟中，導致外周血中的MDSC 數量減少，而肝臟中的MDSC 數量增加。但也不排除其他的可能：（1）由于研究中樣本量小，不能很好地反映樣本總體的情況；（2）可能存在其他機制，比如在病情很嚴重時，MDSC 的生成反而受抑制，從而導致MDSC數量下降。

本研究中NAFLD 組和正常對照組外周血中MDSC 均 以 Mo-MDSC 為 主 ， 且 NAFLD 組 的Mo-MDSC和G-MDSC比例皆較正常對照組明顯減少 （P＜0.05），這提示 Mo-MDSC、G-MDSC 可能都參與了NAFLD的疾病過程，但兩者的功能可能存在差異，G-MDSC 可能發揮主要作用。本研究發現G-MDSC 比例與ALT/AST 負相關，而ALT/AST上升常見于NASH患者，且與炎癥程度關系密切。Cheng 等[9]發現在高脂飲食和蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導小鼠NASH 模型中，蒼菊清肝降脂湯治療使肝損傷基本恢復正常，降低了ALT/AST 水平，減輕了肝臟炎癥的嚴重程度。Mridha 等[10]發現MCC950 治療使肝組織表達caspase-1 和IL-1β，血漿中IL-1β、MCP1、IL-6、ALT/AST 水平降低，肝臟炎癥和肝纖維化程度減輕。究竟是G-MDSC 比例的降低影響了疾病的進程還是疾病的加重促進了G-MDSC 比例的降低呢？如果是后者的話，G-MDSC 比例的降低又進一步對疾病產生了怎樣的影響，是免疫促進還是免疫保護？這都有待進一步研究。

炎癥雖然是肝臟疾病的常見原因，但其在NASH 發病機制中的作用仍不清楚。有報道稱，相對過量的促炎性細胞因子和相對缺乏的抗炎細胞因子之間的不平衡在NASH 的發病機制中起到關鍵的作用[11]。IL-6 可由單核細胞、巨噬細胞等多種細胞產生，與肝臟局部炎癥有關。IL-6 參與炎癥損傷過程，具有抑制脂肪分解和脂蛋白酯酶活性、促進脂肪生成的作用[12]。本研究發現NAFLD患者外周血中IL-6表達水平較正常人明顯增加（P＜0.001），與其他文獻結果一致，提示了IL-6 可能與NAFLD的發生密切相關。

研究表明，在炎癥或腫瘤中，機體中多種細胞因子能夠影響MDSC 的募集、生長和分化。γ干擾素、IL-6、IL-10、IL-13 和 TGF-β3 能刺激MDSC 的募集和擴增，γ 干擾素、IL-4、IL-13、IL-17和轉化生長因子-β則刺激MDSCs 的活化[13]。關于 NAFLD 中 MDSC 與 IL-6 關系的研究甚少，目前只有動物模型的研究，尚未有關于人的研究。

綜上所述，本研究發現MDSC 及其亞型Mo-MDSC、G-MDSC在NAFLD患者外周血單個核細胞中的比例減少，而IL-6 表達增加，對此我們推測IL-6 可能促進MDSC 遷移到靶器官肝臟中，導致外周血MDSC 的比例減少。遺憾的是，并未發現MDSC 或其亞型與IL-6 相關，可能是由于本研究中的例數相對較少，造成了一定的抽樣誤差，也未能做到以疾病嚴重程度分組。MDSC 與IL-6之間的關系還有待進一步研究。