甜櫻桃擴展蛋白PavEXPA2基因克隆與表達分析

張焱，仇志浪，申洛男，文曉鵬

貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院/山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室，貴陽 550025

甜櫻桃（Prunus aviumL.）屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）櫻亞屬植物，原產歐洲及亞洲西部，果實色澤紅潤，且營養價值高，深受消費者的喜愛，具有較高的經濟價值［1］。

擴展蛋白（expansins，EXPA）又稱為細胞壁松弛蛋白，廣泛存在于植物細胞組織中，是調節細胞壁伸展和松弛的細胞壁蛋白酶［2］。它首先從黃瓜細胞壁中分離［3］，后來在很多植物中陸續發現了擴展蛋白。此外，擴展蛋白能夠通過其他細胞壁酶相互作用，促進細胞壁降解［4］。近年來，研究發現擴展蛋白基因參與了植物的抗逆過程。Sabirzhanova等［5］發現，在干旱條件下玉米葉片中擴展蛋白基因轉錄水平提高，推測擴展蛋白能夠特異調節細胞壁松弛。毛竹葉片中擴展蛋白基因PeEXPA2表達水平也明顯升高［6］。Cho［7］利用特異啟動子使擬南芥AtEXP10基因超表達促進葉柄脫落；而抑制表達則會減少葉片脫落，并證明了葉柄脫離的原因是由于分離區擴展蛋白受到誘導發生細胞膨脹、使其產生機械壓力而導致的。在花器官脫落過程中，RbEX?PA1的表達量上升，在延緩花瓣脫落的過程中，Rb?EXPA1的轉錄水平則降低［8］。

甜櫻桃在花發育、坐果及發育期間易出現幼果異常脫落現象，但有關甜櫻桃擴展蛋白基因的克隆和功能分析未見報道?；贓XPA基因在植物器官脫落中的功能，本研究以甜櫻桃脫落小果果柄為材料，克隆甜櫻桃擴展蛋白基因PavEXPA2，并通過在線軟件對其進行生物信息學分析；利用 qRT-PCR技術分析該擴展蛋白基因在不同組織以及不同脅迫處理中的表達情況，以期為闡明其在甜櫻桃生長發育中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

以甜櫻桃品種“桑提娜”為材料，分別采集莖、花芽、盛開花朵、幼葉、老葉、幼葉葉柄、老葉葉柄、2個脫落高峰期正常果柄與即將脫落果柄、2個脫落高峰期正常果實與脫落果實。以葉片為材料，使用20% PEG6000和20 mmol/L NaCl溶液分別模擬干旱和鹽脅迫，采集處理0、2、4、6、8 h的材料，采集后迅速用液氮速凍，后于-80 ℃中保存備用。以上材料均設置3個生物學重復。

1.2 甜櫻桃PavEXPA2基因的克隆

用植物多糖多酚RNA提取試劑盒（賽諾生物科技有限公司，中國張家口）提取甜櫻桃果柄總RNA，用MutiscanGO（Thermo，美國）和瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行檢測，并用PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，日本）對甜櫻桃果柄總RNA進行cDNA第1鏈合成，使用內參基因檢測cDNA的完整性并于-20 ℃保存備用。

在甜櫻桃基因組數據庫中搜索該基因的CDS序列，利用Primer Premier 5軟件設計特異引物PavEX?PA22-F：CACATGCTGACCTGTCCTCC、PavEX?PA2-R： CC GCCTAACCTCCTAAC TCTAAT，提交至上海生工生物工程有限公司合成。

以cDNA為模板，利用上述合成引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：ddH2O 3 μL，高保真mix（TaKaRa，日本）5 μL，cDNA 1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，共10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35次循環；最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增PCR產物純度，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，將回收產物連接到pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金，北京）并轉化DH5α大腸桿菌，37 ℃活化1 h后吸取100～200 μL活化產物涂布于Kan抗性的LB平板上，于37 ℃過夜培養，待長出菌落后挑取單菌落進行菌落PCR驗證，對檢驗出的陽性克隆進行培養，將陽性菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 PavEXPA2基因的生物信息學分析

用NCBI在 線 分 析 工 具ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.Html）尋找DNA的開放閱讀框，通過DNAMAN軟件進行蛋白質翻譯、NCBI Blastp進行蛋白質同源性比對，利用MEGA5.1構建進化樹。利用在線軟件TMHMM Server v.2.0（http：//www. cbs.dtu.dk /services/TMHMM/）對PavEXPA2蛋白的跨膜結構域進行預測，用ProtParam（https：//web.expasy.org/ prot?param/）分析PavEXPA2蛋白的分子質量和等電點等基本理化性質，用在線分析工具SignalP 4.1 Serv?er（http：//www. cbs.dtu.dk/services /SignalP-4.1/）分析PavEXPA2基因所編碼的氨基酸序列的信號肽，利用Cell PLoc2.0（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf /Cell-PLoc-2/）進行亞細胞定位預測。

1.4 qRT-PCR分析

根據克隆獲得的PavEXPA2基因序列，用prim?er 5設計特異性引物，引物序列PavEXPA2-Y-F：CTTCTTTCTCATCTCCTCTGCC，PavEXPA2-Y-R：CCAAGGAACCATACC CACAA，在上海生工生物工程有限公司合成。以甜櫻桃不同組織的cDNA為模板，以PavRSP3和PavEF1-α2為內參基因［9］，引 物 序列 為：PavEF1-α2-F：ATCCAGAG?TAGCA GAACCAATCAC，PavEF1-α2-R：GT?TAGGCATCCAGTCCCAGAAT，在CFX 96TM Real-Time System（Bio-rad，美國）實時熒光定量PCR儀上進行。反應采用三步法，程序為：94 ℃預擴增10 min；94 ℃ 變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 甜櫻桃PavEXPA2克隆與生物信息學分析

以甜櫻桃果柄cDNA為模板，通過PCR擴增獲得與預期目的基因片段大小一致的條帶，將目的條帶回收并測序，結果顯示序列長度為1 035 bp，開放 閱 讀 框（ORF）為852 bp，編 碼283個 氨 基酸（圖1）。

圖1 PavEXPA2基因ORF序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 ORF sequence and encoded amino acid sequence of PavEXPA2 gene

采用ProtParam分析可知，PavEXPA2蛋白質分子式為C1366H2125N3750408S15，等電點為8.90，分子質量約為30.81 ku。PavEXPA2蛋白總的負電荷殘基數（Asp+Glu）為21個，正電荷殘基數（Arg+Lys）為29個，由此推測該蛋白帶正電荷。該蛋白含量最豐富的氨基酸分別為丙氨酸Ala（9.9%）、甘氨酸Gly（8.8%）、絲氨酸Ser（8.8%）、亮氨酸Leu（8.8%）和賴氨酸Lys（6.4%）。蛋白的不穩定系數為41.88，這表明該蛋白屬于不穩定蛋白質。氨基酸殘基疏水性總和（GRAVY）是-0.139，所以該蛋白親水性較強。

采用SignalP 4.1 Server在線預測得知PavEX?PA2蛋白存在1個信號肽，且信號肽裂解位點位于41～42（圖2）。用在線軟件TMHMM Server v.2.0預測跨膜結構域，結果顯示，PavEXPA2為跨膜蛋白，含有2個跨膜螺旋結構（圖3）。利用Cell PLoc 2.0 在線軟件對甜櫻桃PavEXPA2蛋白進行亞細胞定位預測分析，發現該蛋白主要位于細胞壁中。

圖2 PavEXPA2蛋白的信號肽預測Fig. 2 Signal peptide prediction of PavEXPA2 protein

圖3 PavEXPA2 蛋白的跨膜域預測Fig. 3 Prediction of the transmembrane domain of PavEXPA2 protein

2.2 PavEXPA2基因的同源性分析

將PavEXPA2基因序列在NCBI網站上進行BLAST同源檢索，發現它與很多植物都具有較高的同源性，其中與扁桃（Prunus dulcis）、桃（Prunus persi?ca）、梅（Prunus mume）擴展蛋白基因同源性最高，分別為97.49%、97.47%和96.91%，并且發現PavEX?PA2有較高保守性，含有DPBB_1保守結構域。

利用DNAMAN軟件將PavEXPA2基因的開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，并將其序列與30個和PavEXPA2蛋白同源性較高的氨基酸序列進行對比，發現該基因編碼氨基酸序列與桃、扁桃和梅擴展蛋白氨基酸序列的同源性較高，分別為95.58%、95.56%和94.76%。

利用MEGA5.1軟件對甜櫻桃擴展蛋白PavEX?PA2與BLAST檢索得到其他物種（柑橘、楊梅、胡楊、楊樹）擴展蛋白氨基酸序列全長，構建系統進化樹，結果發現甜櫻桃PavEXPA2與PmEXPA2（梅）、PdEXPA2（扁桃）和PpEXPA2（桃）序列相似程度最高，親緣關系最近（圖4）。

圖4 甜櫻桃PavEXPA2系統進化分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of sweet cherry PavEXPA2 and the α-expansins of other plant species

2.3 PavEXPA2的組織特異性表達

PavEXPA2在甜櫻桃“桑提娜”即將脫落組織，如莖、花芽、花朵，葉、葉柄、果柄和果實的表達結果顯示，在成熟葉葉柄中表達量最高，隨后依次是盛開花朵、第2落果高峰即將脫落果柄、成熟葉、第1落果高峰即將脫落果柄、第2落果高峰即將脫落果實，在第1落果高峰正常果實中表達量最低。而在第1落果高峰正常果柄、第2落果高峰正常果柄、花芽、第1落果高峰即將脫落果實、第2落果高峰正常果實、幼葉葉柄、幼葉以及莖中基本檢測不到表達（圖5）。因此，PavEXPA2基因主要是在成熟葉及其葉柄、脫落果柄和盛開花朵中表達，且在這些組織的表達與其成熟和脫落進程大致同步，由此推測該基因可能參與甜櫻桃組織脫落的調控，尤其與葉柄脫落相關。

圖5 甜櫻桃PavEXPA2基因組織差異性表達分析Fig.5 Differential expression of PavEXPA2 gene in sweet cherry

2.4 PavEXPA2對非生物逆境的應答

在20% PEG6000和20 mmol/L NaCl處 理后PavEXPA2基因的相對表達量結果（圖6）顯示，在干旱處理（20% PEG6000處理）條件下，PavEXPA2基因表達量逐漸上升，在處理6 h時的表達量達到峰值，同時鹽脅迫（20 mmol/L NaCl處理）下其表達量也在6 h達到峰值。而在兩者表達量均達到峰值時，干旱脅迫下該基因的表達量顯著高于鹽脅迫，推測甜櫻桃在抵御干旱及鹽脅迫過程中，通過PavEX?PA2基因上調表達而響應逆境脅迫。表明PavEX?PA2在甜櫻桃抵御非生物脅迫時可能起著關鍵作用，尤其是對于干旱脅迫的響應較為明顯。

圖6 鹽處理和干旱脅迫下甜櫻桃PavEXPA2基因的表達Fig.6 Expression of PavEXPA2 gene in sweet cherry under salt and drought treatments

3 討論

本研究從甜櫻桃克隆了1個擴展蛋白基因家族成員PavEXPA2，其編碼蛋白與桃、扁桃、梅等擴展蛋白氨基酸序列有較高的同源性，PavEXPA2參與甜櫻桃器官脫落的調控，尤其是葉柄脫落；在干旱及鹽脅迫下，PavEXPA2基因均上調表達。因此，甜櫻桃可能通過該基因上調促進脫落而抵御逆境脅迫。

擴展蛋白是1個龐大的多基因家族，目前植物擴展蛋白一般分為4類，分別為α-expansin（EXPA）、β-expansin（EXPB）、類α-expansin（EXLA）和類β-ex?pansin（EXLB）［10-11］。擴展蛋白基因在植物基因組中廣泛存在，但在基因家族序列的組成、數量、功能等方面，不同物種間有很大差異［12］。研究較多的是α-expansin和β-expansin，越來越多研究表明，在植物整個生長發育進程中擴展蛋白（尤其是α-擴展蛋白）幾乎都有參與。在種子萌發、根毛起始和延長、莖和葉生長發育、葉柄脫落、花粉管延長以及果實成熟等過程中都有擴展蛋白參與［4］。另外，Downes［12］在大豆中同樣發現了1個β型擴展蛋白基因CIM1，該基因通過軟化柱頭與花柱細胞的細胞壁、協助花粉管伸長生長，從而協助花粉管通過花柱進入子房，顯示出擴展蛋白功能的多樣性。

3.1 PavEXPA2基因與植物器官脫落

在其他物種中，例如在草莓［13-14］、枇杷［15］及葡萄［16］等植物中，擴展蛋白與果實的成熟軟化相關。Cho［7］在擬南芥葉以及葉柄基部分析表明，擴展蛋白參與了擬南芥葉柄的脫落過程。此外，Tucker等［17］的研究也發現在大豆脫落葉柄離區中擴展蛋白有顯著上調。西洋接骨木（Sambucus nigraL.）的花脫落過程中能觀察到離區中擴張蛋白的多克隆抗體標記逐漸增加，并且在脫落之前的黃化階段檢測到高水平的擴展蛋白，且離區中編碼擴展蛋白基因SniExp2和SniExp4上調表達［18］。因此，擴展蛋白在植物器官脫落過程中發揮了重要作用。

本研究克隆得到1個甜櫻桃中的擴展蛋白Pav?EXPA2，通過qRT-PCR發現PavEXPA2在成熟的器官及易脫落的組織中高表達，生物信息學分析結果表明，此基因可能在細胞壁中發揮作用。許多研究表明，擴展蛋白可重塑細胞壁，破壞纖維素和半纖維素之間的氫鍵［19-20］。細胞壁是植物細胞連接的部分，在植物器官脫落的過程中，同樣涉及細胞壁的變化［21］。本研究中甜櫻桃PavEXPA2在一些易脫落或者趨向脫落的器官中均有較高的表達量，說明該基因可能與甜櫻桃組織的脫落相關。擴展蛋白在細胞中的功能機制已經較為明晰，但是該基因如何參與甜櫻桃器官脫落尚需進一步深入研究。

3.2 PavEXPA2基因與非生物脅迫

擴展蛋白在響應非生物脅迫中有重要作用，在煙草中過表達TaEXPA2基因能提高植株對鹽［22］、干旱［23］和鎘［24］的抗性。同樣的，在煙草中過表達TaEXPB23基因，提高了煙草的抗氧化和鹽脅迫［25］的能力。在干旱條件下，小麥胚芽鞘擴展蛋白基因的表達上調［26-27］說明干旱條件下，擴展蛋白基因的功能發生了變化。Dai等［28］在擬南芥中過表達月季擴展蛋白基因RhEXPA4，增強了植株的抗旱性。在高鹽條件下，玉米葉片細胞的擴展蛋白基因ZmEX?PA1的表達上調［29］，上述研究都表明擴展蛋白與植物的抗逆性相關。本研究中PavEXPA2表達量在干旱和鹽脅迫下均上調，與以上研究結果一致，說明該基因在甜櫻桃抗逆過程中同樣有著關鍵作用。

由于貴州的寡日照及喀斯特高原的特殊地理條件，櫻桃的生長及果實的發育有著一定的限制。甜櫻桃在幼果階段的異常脫落已經是制約貴州甜櫻桃發展的一個嚴峻問題，而關于甜櫻桃生理落果的分子信號機制仍舊比較模糊。在逆境脅迫時， 擴展蛋白主要通過調節植物細胞壁的組分以增加細胞壁的柔韌性從而緩解脅迫對細胞造成的壓力［30］。細胞的變化在逆境脅迫和脫落中存在相似之處，對擴展蛋白基因的功能研究有助于在細胞層面解析甜櫻桃幼果異常脫落的機制。