火龍果HpGST基因克隆及表達分析

屠凱，文曉鵬，張惠敏，申洛男

貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院/山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室，貴陽 550025

谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）是一種普遍存在的參與多種細胞功能的蛋白，參與植物花青苷運輸與定位?；ㄇ嗨氐倪\輸需要與GSH結合才能運輸到液泡中，而谷胱甘肽泵能夠識別與GSH結合標記的內源底物并將它們定位到合適部位［1］。在蘋果中，MdGSTF3基因的表達與果實不同組織花青苷的積累和分布密切相關［2］。在葡萄中，葡萄果皮和果肉花青苷的積累與GST相關［3］，GST參與小泡運輸花青苷［4］，并且在葡萄中，葡萄ATP結合蛋白ABCC1運輸花青苷依賴于谷胱甘肽的含量［5］。

火龍果（Hylocereus）為仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereusundatus）果樹，因其富含甜菜素而具有很高的經濟價值，被貴州省列為重點支持的特色產業［6］。研究表明，甜菜素是以酪氨酸為起始底物，經眾多酶促反應和自發反應合成，其關鍵酶是酪氨酸羥化酶和4，5-多巴雙加氧酶［7］。雖然甜菜素合成通路日漸清晰，對于甜菜素合成后的運輸機制尚不清楚?；瘕埞闹饕厥翘鸩怂囟皇腔ㄇ嗨?，鑒于GST在植物中參與花青苷運輸與定位的重要作用，火龍果GST是否參與甜菜素的運輸與定位？為探究這一科學問題，本研究克隆火龍果HpGST基因的cDNA全長序列，分析HpGST在火龍果不同組織和發育時期的表達情況，測定相應時期和組織中甜菜素含量，進而對該基因表達與甜菜素含量間的相關性進行分析，旨在全面認識HpGST基因在火龍果甜菜素代謝過程中的分子機制， 為通過基因工程手段對果實色澤性狀進行定向改良提供新信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取貴州省羅甸縣火龍果種植基地紫肉（紫紅龍）、粉肉（粉紅龍）、白肉（晶紅龍）類型適齡植株掛牌標記，每種色澤類型品種選3株，采集開花后10、20、25、26、27、30 d果實，并分別標記為S1（10 DAF）、S2（20 DAF）、S3（25 DAF）、S4（26 DAF）、S5（27 DAF）、S6（30 DAF）。每個采樣時期從3株植株各采1果，經清水洗凈后液氮速凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取約0.2 g樣品經液氮速凍充分研磨后，采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（張家口賽諾生物科技有限公司），根據說明書操作步驟提取果實總RNA，利用全波長掃描酶標儀（Thermo Fisher）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和質量；利用TaKa?Ra公司反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMTR reagent Kit with gDNA Eraser）進行反轉錄，合成cDNA第1鏈。

1.3 基因克隆

根據HpGST基因序列，使用Prism 5.0本地軟件設計特異性引物（表1）。利用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase （TaKaRa， 大連）高保真酶進行 PCR 擴增，PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增采用10 μL體系，包括5 μL PrimerSTAR Buffer、3.5 μL ddH2O、0.5 μL正 向 引物、0.5 μL反向引物、0.5 μL cDNA模板。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的片段膠回收后與Blunt克隆載體連接并轉化大腸桿菌感受態中，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 火龍果HpGST基因克隆的相關引物。Table 1 Primers used for HpGST gene cloning in pitaya fruit

1.4 基因生物信息學分析

利用美國國家生物技術信息中心（National Cen?ter for Biotechnology Information，NCBI）進行核苷酸和氨基酸序列比對及保守結構域分析；使用MEGA 8.0 軟 件構 建 系統 發 育樹；使 用Expasy（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在線分析軟件預測蛋白質的理化性質和親疏水性；TMHMM Serv?er2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）在線軟件分析蛋白質的跨膜結構域；使用Cell-PLoc 2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/Cell-PLoc-2/）預測蛋白質的亞細胞定位，GOR4（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）預測蛋白質二級結構。

1.5 RT-PCR分析

根據筆者所在課題組前期獲得的火龍果轉錄組數據［8］中的HpGST基因序列，設計熒光定量引物，qHpGST-F和qHpGST-R（表1），以ACTION-2為內參，分別設計其特異性引物ACTION-2-F、ACTION2-R（表1），采用2-△△Ct法分析相對表達量。

1.6 甜菜素提取和測定

參考曾燦彬［9］的方法并進行改進。準確稱取不同色澤類型品種及不同發育時期火龍果果肉0.2 g，經液氮研磨，利用80%乙醇提取甜菜素，在紫外分光光度計上分別于波長538、470 nm處測定甜菜紅素和甜菜黃素吸光度并計算其含量。

2 結果與分析

2.1 HpGST基因克隆與生物信息學分析

將提取的火龍果總RNA反轉錄獲得火龍cDNA，以火龍果cDNA為模板，利用引物HPGST-F和HPGST-R（表1）擴增得到1條500～900 bp的特異性條帶。利用ExPaSy-Protparam預測HpGST蛋白分子質量為2.5 ku，理論等電點為7.02。編碼氨基酸包含了20種常見氨基酸。其中賴氨酸含量最高，達到10%。分子式為C1193H1834N304O326S7。蛋白不穩定系數為44.46，屬于不穩定蛋白。利用TMHMM-2.0分析跨膜結構域，發現該蛋白不具有跨膜結構域，推測其在膜外發揮作用。利用在線分析軟件Cell-PLoc 2.0分析蛋白的亞細胞定位，發現該基因主要定位于細胞質。利用ExPASy的ProtScale程序分析火龍果HpGST編碼蛋白疏水性和親水性，結果顯示，該蛋白質屬于親水性蛋白。通過GOR 4在線分析軟件對HpGST蛋白進行二級結構預測，其中α-螺旋占該蛋白的比例最高為33.94%，不規則卷曲所占比例為46.15%，延伸鏈所占比例為19.91%（圖1）。

使用NCBI的CDD在線分析軟件對HpGST進行蛋白質保守結構域預測，結果（圖2）顯示，該基因編碼蛋白含有GST_N_Tau和GST_C_Tau的保守結構域，第1個保守結構域由第6～80個氨基酸之間的74個氨基酸組成，第2個保守結構域由第91～214個氨基酸之間的123個氨基酸組成，并將該編碼蛋白命名為HpGST。

圖 2 火龍果HpGST保守結構域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of HpGST in pitaya

使用NCBI的BlastP在線分析軟件進行在線比對，在蛋白質序列庫中對HpGST進行同源性檢索和比對分析。獲取來自藜麥（Chenopodium quinoa）、甜菜亞種（Beta vulgarissubsp.vulgaris）、菠菜（Spina?cia oleracea）、阿爾巴尼亞牧豆（Prosopis alba）等8種植物的15個蛋白氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件將HpGST蛋白與這15個GST蛋白序列進行多重序列比對并構建系統進化樹（圖3）。結果顯示：火龍果HpGST蛋 白 與 藜 麥（XP_021720754.1、XP_021715456.1、XP_021746029.1、XP_021715455.1），甜菜亞種（XP_010594823.1），菠菜（XP_021839481.1，XP_021866921.1）親緣關系最近，與阿爾巴尼亞牧豆（XP_028752413.1、XP_028752382.1、XP_028752391.1、XP_0288045421.1）親 緣 關 系較遠。

使用DNAMAN8.0將HpGST的氨基酸序列與親緣性較近的幾個物種的GST氨基酸序列進行多重比對（圖4），結果顯示，HpGST蛋白與其他物種的GST蛋白的氨基酸序列同源性比較高，其中與藜麥（XP_021720754.1、XP_021715456.1、XP_021746029.1、XP_021715455.1）相 似 性 分 別 為81%、81.02%、79.64%、76.50%，與甜菜亞種（XP_010594823.1）相似性 為77.98%，與 菠 菜（XP_021839481.1、XP_021866921.1）相似性為71.15%和71.61%。

2.2 HpGST的表達分析

利用qRT-PCR分析HpGST在火龍果不同色澤類型品種、不同發育期果肉中的表達情況，表達結果（圖5A）顯示，在有色果肉中S3期開始表達量明顯上升，紫肉S3期表達量是S2期表達量的9.96倍，粉肉中則是5.54倍。而白肉中直到S4期表達量才顯著上升，且表達量整體上較低。此外，紫肉火龍果中基因表達量變化早于粉肉火龍果；紫肉火龍果S4期表達量是S3期表達量的3.32倍且兩者差異明顯，S5期表達量是S4期表達量的3.80倍且兩者差異明顯。而粉肉火龍果中S4期表達量是S3期表達量的1.37倍，兩者差異不明顯，S5期表達量是S4期表達量的12.0倍且2個時期差異顯著。而對應時期白肉中表達量則分別是0.99和0.48且表達量較低。

圖 3 HpGST與其他物種GST氨基酸序列系統進化樹分析Fig. 3 The phylogenetic tree analysis of GST amino acid sequences of HpGST and that of other species

分析HpGST在火龍果不同發育期、不同色澤類型品種果肉中的表達情況，結果（圖5B）顯示，在S1-S2期，HpGST在3個色澤類型品種果肉表達量無明顯差異。而從S3期開始，在有色果肉中表達量明顯高于白肉；在紫肉中表達量是白肉的8.12倍，差異顯著，而在粉肉中表達量是白肉的4.49倍，差異顯著。S4期在紫肉中表達量遠高于在粉肉和白肉中的表達且均差異顯著，分別是粉肉的4.11倍、白肉的6.82倍。而在該時期HpGST在粉肉中的表達量是白肉的1.66倍。此后的S5期和S6期，HpGST在有色果肉表達量無顯著差異但都遠高于白肉中的表達量且差異明顯，S5期HpGST在紫肉中表達量是白肉中表達量的26.09倍，在粉肉中的表達量是白肉中的17.36倍，而S6期對應的分別為20.02倍和21.45倍。

上述結果表明，HpGST基因在不同色澤類型品種果肉中均有表達，但表達特性不同。HpGST在有色素累積的果肉中表達量明顯遠高于無色素累積的白肉火龍果，且整體上呈現紫肉>粉肉>白肉，發育時期上呈現出隨時間的延長而先上升后下降的趨勢，其中在紫肉和粉肉類型的S5期（27 DAF）相對表達量最高，而白肉類型S4期（26 DAF）表達量最高。

2.3 火龍果發育過程中甜菜素含量的變化

甜菜紅素在不同發育時期果肉中的含量變化結果（圖6A）顯示，紫肉火龍果中甜菜紅素含量整體呈現隨發育時期的延長而不斷上升的趨勢，從S3期開始急速升高，S3-S6期甜菜素含量均與S1、S2期含量有顯著差異。而在粉肉火龍果中，S1-S4期甜菜紅素含量均無顯著差異，S5-S6期差異顯著，但整體含量較低。而甜菜紅素含量在白肉火龍果中全時期均含量極低且無顯著差異。

甜菜紅素在不同色澤類型品種火龍果果肉中的含量變化（圖6B）顯示，S1-S2期在不同色澤類型品種火龍果果肉中雖有差異，但整體含量較低不進行討論。比較S3-S6期不同色澤類型品種果肉甜菜紅素含量差異；S3期紫肉中含量是粉肉的7.50倍，是白肉的9.68倍、而S4期對應的差異分別是16.47倍和20.29倍、S5期對應的差異分別是17.52倍和24.82倍、S6期對應的差異分別是15.04倍和34.00倍。即從S3期開始，不同色澤類型品種火龍果中甜菜紅素含量開始出現顯著差異，不同色澤類型品種間甜菜紅素含量從高到低分別為紫肉>粉肉>白肉。

甜菜黃素在火龍果不同發育時期果肉中的含量變化（圖7A）顯示，甜菜黃素與甜菜紅素具有相同的累積趨勢即在不同色澤類型品種火龍果中甜菜黃素含量隨發育時期的增加色素含量不斷上升但含量都較低。

圖 4 火龍果HpGST和其他植物GSTs蛋白序列比對Fig. 4 Alignment of HpGST protein sequences of Hylocereus and GSTs protein sequences of other plants

甜菜黃素在不同色澤類型品種火龍果果肉中的含量變化結果（圖7B）顯示，紫肉中甜菜黃素含量變化最大，而粉肉和白肉變化較小。對比紫肉與粉肉、白肉類型的甜菜黃素含量發現，紫肉的含量均比粉肉高，S2-S6期 依 次高出1.16倍、2.20倍、2.68倍、2.78倍、2.88倍；而紫肉的甜菜黃素含量更顯著高于白肉類型，S1-S6期依次高出1.86倍、2.06倍、3.30倍、3.46倍、3.71倍、3.39倍。甜菜黃素含量在不同色澤類型品種間表現為紫肉>粉肉>白肉，雖然與甜菜紅素趨勢相同但整體含量較低（P<0.05）。

圖 5 火龍果果肉HpGST基因相對表達量Fig. 5 Relative expression level of HpGST gene in Hylocereus

圖 6 不同色澤類型品種火龍果不同發育時期甜菜紅素含量變化Fig. 6 Variation of betacyanin content in different Hylocereus cultivars at different development stages

圖 7 不同色澤類型品種火龍果不同發育時期甜菜黃素含量變化Fig.7 Variation of betaxanthin content in different varieties of Hylocereus at different development stages

2.4 甜菜素含量與HpGST基因表達的相關性分析

比較HpGST基因在火龍果中的表達與甜菜素的含量變化，發現在火龍果發育時期，HpGST基因的表達與色素累積呈現相同趨勢（不同發育時期基因表達量和色素含量趨勢相同，且在不同色澤類型品種表達量和甜菜素含量也呈現出顯著的同一性），而成熟期甜菜素累積到一定程度會抑制HpGST基因的表達。對比不同色澤類型品種火龍果中Hp?GST基因的表達與甜菜素的含量變化發現，在S1-S2期HpGST基因表達量及甜菜素含量都極低，且都是從S3期開始，不同色澤類型品種間基因表達量及甜菜素含量都呈現出紫肉>粉肉>白肉的趨勢。即HpGST基因表達與甜菜素含量變化具有高度統一的時空性。

3 討論

甜菜素作為一種重要的天然色素，應用前景廣闊，消費市場潛力巨大，然而有關甜菜素的研究多集中在合成通路上，而對于甜菜素合成后運輸與定位的研究卻鮮有報道。

谷胱甘肽-S轉移酶（GSTs）在植物中具有對花青素的運輸標記功能，因GST具有特殊的親和性，能將花青苷和谷胱甘肽形成偶聯連物［10-11］，GST作為載體標記運輸到液泡中從而保護細胞［11］?，F有研究發現，甜菜素在植物中的功能同花青素類似［12］。然而甜菜素在自然界中僅僅在石竹目植物中發現，尚未發現同一植物中同時存在甜菜素和花青素2種色素［13］。此外，甜菜素起始底物酪氨酸和花青素合成前體物質——對香豆酰CoA都來源于苯丙氨酸［14］。二者都作為一類水溶性色素，同樣合成于細胞質中，儲存于液泡［15-16］。此外，二者在植物中的功能相同，合成底物同源，合成部位和最后運輸到的細胞器相同，推測2種色素在細胞質中合成后運輸到液泡的方式存在相同的可能。

本研究對比火龍果中谷胱甘肽S-轉移酶基因（HpGST）編碼蛋白定位部位和蛋白類型都與花青素來源植物中的GSTs編碼蛋白相似，對HpGST在火龍果中的表達與甜菜素含量進行相關性分析發現，火龍果中甜菜素（包括甜菜紅素和甜菜黃素）含量的變化隨發育時期的延長而不斷增加，并且與HpGST基因表達量具有相同趨勢。且甜菜素（包括甜菜紅素和甜菜黃素）含量在不同色澤類型品種火龍果中的含量與HpGST基因的表達量表現出高度一致的趨勢即紫肉>粉肉>白肉。推測HpGST基因與火龍果果肉中甜菜素的累積和分布有著緊密聯系。

本研究通過對比不同色澤類型品種、不同發育時期火龍果中HpGST基因的表達和甜菜素的含量變化，對參與色素運輸的谷胱甘肽S-轉移酶基因（GST）在火龍果中的作用進行了初步研究。鑒于GST在花青苷運輸與定位的重要作用，推測HpGST基因對火龍果中甜菜素的運輸、積累和儲存起到重要調控作用，其具體的分子作用機制還需進一步探究，為火龍果果實中甜菜素累積與運輸的深入研究提供一個新的視角，進而為解析甜菜素的合成代謝調控提供科學根據。