基于網絡藥理學探討木防己湯治療類風濕關節炎的作用機制

王寶娟，辛昊洋，李 月

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院腎病風濕科，天津 300150 2.天津市南開區廣開街社區衛生服務中心，天津 300191）

木防己湯源于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治篇》，為寒熱并用、補泄兼施之劑，可通陽利水、清熱補虛、消散飲邪積聚[1]。葉天士在《臨癥指南醫案》中提出，“濕熱流著，四肢痹痛”建議用仲景木防己湯法。后吳鞠通擴而充之，對木防己湯進行加減化裁，用于治療暑濕痹證，稱“此治痹之祖方也”。臨床上類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期多用此方治療。網絡藥理學概念是2007 年英國藥理學家Hopkins AL[2]提出，是在現代藥理學研究的基礎之上提出的藥物設計與開發的新方法和新策略，其是以系統生物學為基礎，從整體水平觀察“藥物－靶點－疾病”復雜網絡關系[3]。本研究旨在通過網絡藥理學方法，探究木防己湯治療類風濕關節炎的作用機制，以期為臨床合理應用提供證據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 木防己湯有效成分及其作用靶點的篩選 于TCMSP 數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集木防己湯（防己、桂枝、人參、石膏）的有效成分信息和藥理學信息，將有效成分匯總后與DrugBank（https：//go.drugbank.com）數據庫里所有已知藥物進行相似度比較，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性指數（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件篩選有效成分。利用TCMSP 數據庫篩選潛在蛋白靶點，并通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）將已篩選出來的靶蛋白名稱標準化。

1.2 類風濕關節炎靶點的獲取 利用GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）等數據庫，以“Rheumatoid arthritis”為關鍵詞，得到類風濕關節炎相關靶點。

1.3 網絡構建及可視化

1.3.1 木防己湯-類風濕性關節炎的共同靶標基因的篩選 根據上述方法整理出相關靶點后，運用Venny2.1 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）篩選得出木防己湯中有效成分與類風濕性關節炎的共同靶點，并繪制Venny 圖。采用Cytoscape3.7.2 構建木防己湯-有效成分-類風濕關節炎-交集靶點的生物網絡。

1.3.2 蛋白互作網絡（PPI）及核心靶點的確定 將共同靶標基因導入STRING 數據庫（https://string-db.org/）,構建蛋白互作信息網絡圖。運用Cytoscape3.7.2軟件對PPI 網絡進行拓撲特征分析，最終篩選出核心靶點。

1.4 生物功能富集分析 運用R 語言軟件（Rx64 4.0.4）對木防己湯與類風濕關節炎共同靶基因中的蛋白進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析，獲得顯著富集的信號通路（P＜0.05），導出柱狀圖，闡釋木防己湯治療RA 的作用機制。

2 結果

2.1 核心處方的有效成分及靶點預測 利用TCMSP數據庫收集整理得到木防己湯有效成分，設定OB≥30%、DL≥0.18，共篩選得到32 個有效成分：防己3 個、桂枝7 個、人參22 個，去除重復項共得到30 個有效成分（見表1）。收集整理得到有效成分的潛在蛋白靶點377 個，其中防己47 個、桂枝74 個、人參256 個，去除重復值共得到125 個潛在蛋白靶點；利用UniProt 數據庫把靶蛋白名稱轉換成對應的基因名稱，去除重復值后得到56 個靶蛋白。石膏只有一個有效成分，無對應靶點蛋白。

表1 木防己湯有效活性化合物的相關信息

2.2 核心處方化學成分與類風濕關節炎相關的共同作用靶點篩選 通過Gene Cards 和HMIM 數據庫進行檢索，去除重復靶點后共搜集到與RA 相關的靶點5046 個。運用Venny 軟件得到核心處方化學成分靶點（56 個）與RA 相關靶點（5046 個）的交集，包括PPARG、CASP3、ESR1、RELA、ICAM1 等37 個靶點。木防己湯治療RA 的作用靶點見圖1。

圖1 木防己湯預測靶點與類風濕關節炎靶點韋恩圖

2.3 PPI 網絡構建及核心蛋白的確定 將篩選得到37 個木防己湯-類風濕關節炎相關的共同靶點蛋白質導入STRING 數據庫，導出蛋白質與蛋白質相互作用數據網絡圖，見圖2，該網絡包含37 個蛋白，163 條關系線條，平均節點數8.81 條，預期邊緣35 個，PPI 濃縮P＜1.0e-16。通過R 語言軟件查詢核心靶點，依據節點count 值，得到互作關系排名前20的靶點信息，導出barplot 條形圖，見圖3。對PPI 網絡的靶點運用Cytoscape3.7.2 進行拓撲特征分析，以“度中心性”（degree）、“中介中心性”（betweenness）“接近中心性”（closeness）三個參數均大于中位數的條件來進行篩選，共篩選出15 個核心靶點，根據count 值 及PPI 拓 撲 特 征 分 析，PPARG、CASP3、RELA、ESR1、ICAM1 排名靠前，推測為核心基因。

圖2 蛋白質互作PPI 網絡圖

圖3 基因互作關系barplot 圖

2.4 藥物-化學成分-靶點-疾病共同作用靶點及關系網絡構建 將獲得的木防己湯-有效成分-靶點-類風濕關節炎數據利用Cytoscape3.7.2 網絡繪圖軟件繪制并分析木防己湯干預類風濕性關節炎的成分-靶點網絡圖，見圖4。菱形表示類風濕性關節炎，長方形代表木防己湯中的中藥組成，三角形代表有效成分，六邊形表示基因靶點。使用network analyzer 功能進行網絡特征分析，以自由度（degree）值為評判標準可得出較為重要的成分、靶點，結果見表2。

表2 網絡拓撲圖分析表

圖4 藥物-化學成分-靶點-疾病靶點網絡圖

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 GO 功能富集共包括83個GO 條目，根據P 值將82 個GO 條目進行升序排列，篩選前20 個條目，導出柱狀圖，見圖6。柱狀圖Y 軸代表GO 名稱，X 軸表示富集的基因數目，生物過程主要涉及nuclear receptor activity、ligandactivated transcription factor activity、transcription coactivator binding、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway、cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process 等。

圖6 GO 功能富集分析柱狀圖

2.5.2 KEGG 通路富集分析 KEGG 信號通路共確定90 條信號通路，篩選出富集基因數的前20 條通路（見圖7）。柱狀圖Y 軸代表KEGG 通路名稱，X 軸表示富集的基因數目，信號通路主要包括Lipid and atherosclerosis、TNF signaling pathway、Toxoplasmosis、Chemical carcinogenesis -receptor activation、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Influenza A、Apoptosis。

圖7 KEGG 富集分析柱狀圖

3 討論

RA 在中醫上屬于“痹證”的范疇，急性期多為濕熱痹[4]，臨床使用木防己湯治療有效[5-7]。RA 發生發展過程由多種信號分子和多條生物通路調控。本研究采用網絡藥理學方法，通過分析木防己湯的有效成分、作用靶點及調控的信號通路，建立該方治療RA 的“成分-靶點-信號通路”多層次網絡模型，探討了木防己湯治療類風濕關節炎的主要機制。

本研究發現在木防己湯-有效成分-靶點-信號通路網絡中β-谷甾醇、山柰酚關聯度最高。β-谷甾醇有抗炎作用，Liu R 等[8]研究發現，β-谷甾醇通過調節巨噬細胞極化減輕膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠踝關節腫脹癥狀，降低膠原特異性抗體并抑制促炎因子的產生。Guo Q等[9]研究表明，β-谷甾醇和歐前胡素能夠協同作用于CIA 大鼠，改善其關節炎的嚴重程度，協同機制與調節LTA、CD83 和SREBF1 的水平密切相關。Zhang F等[10]研究發現β-谷甾醇通過增加滑膜的氧化還原狀態水平并減少TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17，增加TGF-β、IL-10 等細胞因子，抑制NF-kB和激活HO-1/Nrf-2 通路顯示出對CFA 大鼠的抗關節炎作用。山柰酚有抗炎和免疫調節特性，山柰酚可雙向調節Treg 細胞的免疫抑制和Th 細胞的促炎作用，同時可抑制滑膜異常增厚，調節相關信號通路，抑制骨侵蝕和血管生成[11]。其可降低破骨細胞的分化，并通過靶向成纖維細胞生長因子受體3-核糖體S6 激酶2 信號軸防止類風濕性關節炎的發展[12]。β-谷甾醇和山柰酚有抗炎和免疫調節作用，因此推斷木防己湯治療RA 發揮作用的主要成分可能為β-谷甾醇、山柰酚等。

本研究運用網絡藥理學技術預測木防己湯治療類風濕關節炎有37 個潛在作用靶點。篩選出15 個核心靶點，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、RELA、雌激素受體R1（ESR1）、細胞間黏附分子-1（ICAM1）等靶點排名靠前，推測為核心靶點。PPARG 屬于核受體超家族，和其他核受體超家族一樣，可調節細胞分化、發育和代謝。此外，它還涉及脂質代謝的調節以及單核細胞、巨噬細胞的成熟和炎癥反應的控制[13]。Baroi S 等[14]研究發現，骨細胞中的PPARG 能夠控制硬化蛋白表達、骨量、骨髓肥胖并介導羅格列酮誘導的骨質流失。Hu YH 等[15]發現炎癥反應時可以導致AIA 大鼠脂肪合成不足，調節PPARG 恢復脂肪代謝的穩態，可以阻止AIA 大鼠單核細胞/巨噬細胞糖酵解引起的炎癥極化。RELA 翻譯后修飾可精準調控NF-κB 的轉錄活性，在調節炎癥、腫瘤、代謝以及免疫應答等重要的生命活動及相關疾病的發生發展過程中起重要作用。RelA 通過調控NLRP3 的轉錄，促進巨噬細胞中NLRP3 炎癥小體的形成，進而調控RA 關節滑膜的炎癥反應[16]。ESR1 可表達于成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞和骨髓基質細胞以及骨細胞，與很多骨性疾病密切相關。ESR1 基因在RA患者中存在差異表達，預測其可作為治療RA 的新靶點[17]。ICAM1 又叫做CD54 是介導黏附反應重要的一個黏附分子，它在炎癥反應、控制腫瘤惡化和轉移以及調節機體免疫反應中起重要作用[18，19]。

在木防己湯治療RA 的GO 分析中，主要涉及核受體活性、配體激活轉錄因子活性、轉錄輔激活子結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、半胱氨酸型內肽酶與細胞凋亡過程等。通過KEGG 分析得出20 條通路，包括脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、弓形蟲?。╰oxoplasmosis）、化學致癌-受體激活（chemical carcinogenesis-receptor activation）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、甲型流感（Influenza A）、細胞凋亡（apoptosis）等信號通路，這些通路可能是木防己湯治療RA 的作用機制。

自身免疫性疾病與動脈粥樣硬化有著密切的聯系[20]，高脂血癥環境激活了致病性自身免疫性細胞反應，從而促進了自身免疫性疾病。推測木防己湯可能會通過調控脂質和動脈粥樣硬化信號通路影響RA 患者體內脂質代謝，抑制炎癥反應和免疫細胞，減輕患者的炎性癥狀。

TNF 作為一種關鍵的細胞因子，可以誘導廣泛的細胞內信號通路，包括細胞凋亡、炎癥和免疫。其在RA 患者的關節滑液和滑膜組織中的表達明顯上升，可影響滑膜巨噬細胞、滑膜細胞、軟骨細胞和破骨細胞等，進而改變關節微環境，進一步加重關節破壞[21]。已有實驗證實[22]，木防己湯能夠降低血清TNF-α 含量，從而緩解RA 病情，減輕關節水腫，減少淋巴細胞浸潤，抑制滑膜增生。結合研究結果，考慮木防己湯可能通過抑制TNF 信號通路緩解疾病。

細胞凋亡指細胞為了抵抗外界刺激，維持內部環境的穩態而發生的非依賴性有序死亡，通常被稱為程序性死亡。與其他細胞死亡方式不同，細胞凋亡是一種自我保護機制[23]。誘導FLS 細胞凋亡是中藥治療RA 的重要機制，可能與死亡受體介導的凋亡通路、線粒體依賴的凋亡通路、NF-κB 介導的凋亡通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）介導的凋亡通路、內質網應激（ERS）介導的凋亡通路及PI3K-Akt介導的凋亡途徑有關[24]。研究發現[25]，復方木防己湯可能通過抑制C-myc 活化，介導細胞凋亡。推斷木防己湯可能通過每種途徑參與FLS 細胞凋亡的過程，需要深入的實驗研究來加以驗證。

RA 患者RAGE 表達增加，IL-17 和IL-1β 表達增加[26]。這表明抑制RAGE 可能是RA 治療的一個良好靶點。而木防己湯也有可能干預了糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路。RA 的病因不明確，可能與遺傳、感染、環境和內分泌因素有關，病毒感染被認為是自身免疫疾病的一個重要原因。甲型流感病毒（IAV）是其一，病毒感染可誘導或預防自身免疫性疾病[27]。慢性乙肝病毒感染可能有關節痛或與RA 相似的關節炎[28]。有研究報道稱[29]，HBV 感染和RA 患者病理改變具有一定聯系。弓形蟲可能引發個體的病理過程，最終導致RA[30]。弓形蟲增加了患者體內IL-17 的表達，這種細胞因子參與了RA的發病。木防己湯是否可以通過抗病毒、抗寄生蟲途徑等治療RA，有待更深入的研究。

惡性腫瘤是RA 的共病疾病，相關性研究中發現，無腫瘤時淋巴瘤與RA 的相關性最高[31]，但與其他腫瘤相關性并不一致，NHANES 的人口數據分析支持RA 患者癌癥風險增加，乳腺癌和前列腺癌是最常見的癌癥類型[32]，但具體原因不明，可能與炎癥反應或者免疫藥物應用有關。通路富集分析顯示木防己湯可能通過調控脂質代謝和抗動脈硬化、TNF信號通路、促進細胞凋亡、抗病毒、抗寄生蟲、腫瘤相關通路等方面治療RA。

綜上所述，木防己湯對RA 的治療呈現多成分、多靶點、多通路的特點，研究結果初步推測木防己湯有效活性成分治療RA 的作用機制，但本研究僅從網絡藥理學層面分析，而對其臨床作用機制了解仍不足，因此有必要通過實驗研究來進一步深入探究，為木防己湯治療RA 提供理論依據。