熒光蛋白在雙色蠟蘑中的構建與表達

馬嘉楠, 李 蕊, 鄒 嶸, 張 鳳

(蘭州大學 生態創新研究院,甘肅 蘭州 730070)

在長期的協同進化過程中,植物為了適應復雜的生態環境,進化出多種形式的植物-微生物共生體系,其中最重要的體系就是植物根系和土壤真菌形成的互利共生的聯合體—菌根[1]。根據菌根形態學及解剖學特征,菌根可以分為三種主要類型：內生菌根、外生菌根和內外生菌根[2],目前全世界共有7 750多種外生菌根真菌和200余種叢枝菌根真菌[3]。據文獻報道,外生菌根真菌不僅能幫助促進植物生長增加植物生物量,還能提高葉綠素的含量與凈光合速率,刺激植物產生次級代謝產物,調節激素平衡,促進植物生長,增強植物抗逆性、適應性與吸收能力,在改善土壤微生物環境方面也具有重要意義,是土壤生態系統中重要的組成部分[4-9]。外生菌根中植物主要為真菌提供碳源,真菌為植物提供主要的氮、磷等營養元素[1]。外生菌根和植物宿主相互作用機制的研究,一方面受限于外生菌根共培養體系的建立,另一方面則受限于外生菌根真菌的遺傳轉化體系的建立[10]。因此,建立高效的真菌遺傳轉化體系尤為重要。外生菌根真菌功能的研究需要高效穩定的遺傳轉化體系,農桿菌介導的遺傳轉化體系(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)[11]是植物科學中的一種成熟技術,同樣也為真菌遺傳學開啟了一個新時代。在過去的20年里,熒光標記物的使用提供了大量的信息,涵蓋了真菌生物學的各個方面,在真菌細胞與植物組織相互作用時的可視化[12]等方面具有重要作用,例如與植物組織相互作用時可視化真菌細胞等[13],揭示了特定真菌蛋白和細胞過程在植物與病原體相互作用中的重要性[14-18]。外生菌根真菌及其共生植物的類群龐雜,其共生過程缺乏共性,給研究帶來了難度。雙色蠟蘑(Laccariabicolor(Maire P.D.Orton))是擔子菌亞門(Basidiomycatina)口蘑科(Tricholomataceae)蠟蘑屬(Laccaria)的優良外生菌根真菌[19],存在于植物根際土壤中[20],在森林、成熟苗圃中十分常見[21]。隨著雙色蠟蘑基因序列的完成,越來越多的研究者開始以雙色蠟蘑為模式生物研究外生菌根真菌與植物的作用機制。對于外生菌根與外生菌根真菌的分子機理、調節機制的研究仍有待進一步完善,深入研究該機制有助于理解外生菌根及其在整個自然生態循環中的作用,使得外生菌根真菌能夠有目的地轉化為生產力并在生態修復中發揮作用。因此,選擇外生菌根真菌模式生物雙色蠟蘑構建外生菌根真菌攜帶熒光蛋白轉化子具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本研究所用的pCEBN載體、pHg載體以及LaccariabicolorS238N(Maire P.D.Orton)均由法國農業科學院Francis Martin院士惠贈。

1.1.2 培養基(g/L) ①MMN固體培養基(Melin Norkrans medium,MMN)：Thiamine 0.05,CaCl20.05,NaCl 0.025,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.15,(NH4)2HPO40.25,FeSO4·7H2O 0.001,葡萄糖 10,麥芽糖提取物 3,酵母提取物 0.5,pH 5.8,用于固體平板培養時,加入瓊脂15;②P5培養基(篩選培養基)：酒石酸銨0.5,Thiamine 0.05,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,葡萄糖 20,麥芽糖 5,pH 5.8,用于固體平板培養時,加入瓊脂15;③共培養培養基(農桿菌侵染真菌培養基)：Thiamine 0.05,CaCl20.05,NaCl 0.025,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.15,(NH4)2HPO40.25,葡萄糖 2,麥芽提取物 3,酵母提取物 0.5,MES 40 mmol/L,甘油 5,pH 5.3,用于固體平板培養時,加入瓊脂15。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 限制性內切酶購自美國Thermo Fisher公司;連接酶購自TaKaRa公司;質粒提取試劑盒購自南京Vazyme公司;試劑購自上海生工公司;本實驗所用引物見表1。高壓滅菌鍋(GI80TW作ZEALWAY);搖床(MQD-S2NR,旻泉);PCR儀(Bio Rad T100,伯樂);核酸電泳儀(DYCP-31DN,北京六一);生化培養箱(LRH-250,上海一恒科學儀器);激光共聚焦顯微鏡(FV3000,Olympus)。

表1 實驗引物

1.2 方法

1.2.1 載體構建 以野生型雙色蠟蘑gDNA為模板,選擇Kemppainen研究中的pCEBN∷mCherry載體,mCherry為雙色蠟蘑的標記蛋白[22]構建過表達質粒。使用引物：H2B-F-StuⅠ+H2B-R-XmaⅠ (表1)擴增目的基因條帶連接T載體后測序,測序正確的質粒以StuⅠ和XmaⅠ為酶切位點,定向克隆連接到pCEBN∷mCherry載體上;然后使用SacⅠ酶切連接穿梭載體pHg,圖1為pHg-pCEBN∷mCharry-H2B的質粒構建圖。驗證正確的質粒轉化農桿菌菌株AGL-1,挑取固體培養基平板上的農桿菌單克隆,液體搖菌培養,并再次用載體引物mch/GFP-F+R與潮霉素抗性引物(表1)菌檢,選取驗證正確的農桿菌菌液侵染真菌。

圖1 pHg-pCEBN∷mCherry-H2B質粒構建圖Fig.1 pHg-pCEBN∷mCherry H2B-plasmid construction diagram

1.2.2 侵染真菌 使用凍融法轉化農桿菌,使用農桿菌株系AGL-1;使用Kemppainen等[23]研究的根瘤農桿菌介導轉化法轉化真菌：選用真菌培養廣泛使用的MMN培養基培養7 d的野生型L.bicolor作為侵染材料,侵染液濃度至OD600=0.4～0.6,加入200 μmol/L的乙酰丁香酮(AS);將侵染液滴加到真菌上,使真菌與農桿菌置于共培養培養基上,共培養培養基中同樣含有利于轉化的乙酰丁香酮(AS),正置暗培養4 d,24 ℃。

1.2.3 篩選轉化子 使用營養豐富的P5培養基加抗生素篩選,經過第1輪、第2輪篩選培養基(P5培養基含頭孢霉素500 μg/mL和潮霉素300 μg/mL)與第3輪篩選培養基(P5培養基含潮霉素150 μg/mL)篩選后選出15個真菌轉化子。

1.2.4 檢驗轉化子 外生菌根真菌雙色蠟蘑基因組提取參考十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取真菌基因組[24]。

1.2.5 真菌生長表型 將MMN培養基生長7 d的雙色蠟蘑pHg-pCEBN∷mCherry-H2B與野生型菌絲進行對比,觀察生長速度、菌絲形態與邊緣菌絲生長狀況等。

1.2.6 雙色蠟蘑菌絲染色觀察 在培養基上取生長周期7 d的菌圈邊緣新鮮的雙色蠟蘑菌絲,用多聚甲醛固定樣品4 h后,使用PBS溶液清洗3遍;將固定好的菌絲切片用10 μg/mL的小麥凝集素(WGA染料)染色30 min;染色標本在激光共聚焦顯微鏡下進行形態學觀察。

1.2.7 數據處理 使用Image J測量菌落直徑,使用Origin 2018、PhotoshopCS6 2020作圖。

2 結果與分析

2.1 構建pHg-pCEBN∷mCherry-H2B質粒

2.1.1 目的基因擴增 選擇核小體核心組蛋白H2B家族作為目的基因檢測熒光蛋白在雙色蠟蘑中的表達,H2B存在許多亞型,在這5個Laccaria組蛋白H2B基因模型中,作為功能作用的基因HTB16201和HTB162022是典型的復制依賴的組蛋白亞型,選擇其中的HTB16202作為雙色蠟蘑中熒光蛋白定位表達的檢測基因[22]。與天然組蛋白類似,組蛋白-熒光蛋白的融合被證明也能進入核小體[25],因此,熒光蛋白在細胞的所有有絲分裂階段都定位于細胞核。以外生菌根雙色蠟蘑gDNA為模板,H2B-F和H2B-R為引物擴增得到兩端分別帶有StuⅠ和XmaⅠ限制性酶切位點的H2B基因(圖2A),連接T載體后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,通過與序列比對,結果顯示,序列匹配度為100%。將H2B的片段克隆到中間載體pCEBN,構建pHg-pCEBN∷mCherry-H2B后,轉化到農桿菌AGL1中進行后續真菌轉化實驗(圖2B、C)。

圖2 目的基因擴增Fig.2 Target gene amplificationA：LbH2B目的基因擴增;B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B構建質粒的PCR擴增;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B農桿菌的PCR擴增;M：2 000 bp DNA Marker;1：H2B基因全長441 bp;2、3：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B構建質粒;4、5：陰性對照野生型gDNA;6、7：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B農桿菌;8、9：陰性對照空白AGL-1菌液;2、4、6、8使用引物為mch/GFP-F+R;3、5、7、9使用潮霉素抗性引物A：LbH2B target gene amplification; B：PCR amplification of pHg-pCEBN∷mCherry-H2B plasmid; C：PCR amplification of pHg-pCEBN∷mCherry-H2B Agrobacterium; M：2 000 bp DNA Marker; 1： H2B gene full length, about 441 bp; 2, 3： pHg-pCEBN∷mCherry-H2B plasmid; 4, 5： Wild-type gDNA negative control; 6, 7： pHg-pCEBN∷mCherry-H2B Agrobacterium; 8, 9：Negative control blank AGL-1 bacterial liquid; 2, 4, 6, 8 using the primer mch/GFP-F+R; 3, 5, 7, 9 using the hygromycin B primer

2.2 菌根真菌的轉化

利用農桿菌介導的方法,對真菌的菌絲進行了轉化。首先利用抗生素進行篩選,兩輪篩選后隨機挑選15個真菌轉化子使用CTAB法提取DNA,潮霉素抗性引物進行PCR驗證。

結果發現15個隨機挑選的真菌轉化子中,有14個真菌轉化子的基因組DNA擴增出大小750 bp左右與潮霉素抗性基因片段長度相同,而野生型(NC)的基因組卻沒有相應的條帶(圖3)。于是計算出該方法進行農桿菌侵染的轉化效率高達93.33%。14個陽性轉化子中,3號轉化子與15號條帶較淺,1號、5號、6號、7號、12號和14號條帶較亮,推測15號轉化子中H2B表達較弱,1號、5號、6號、7號、12號和14號轉化子中H2B基因表達較強。因此選擇真菌轉化LbH2B-1、6、7、12進行后續的研究。

圖3 LbH2B轉化子潮霉素抗性基因鑒定Fig.3 Identification of Hygromycin resistance gene in pHg-pCEBN∷mCherry-H2B transformantsM：2 000 bp DNA Marker;NP：野生型雙色蠟蘑 gDNA,陰性對照;PC：陽性質粒pHg-pCEBN∷mCherry;1～15：轉化子M：2 000 bp DNA Marker; NP：WT gDNA, negative control; PC：Positive plasmid pHg-pCEBN∷mCherry; 1-15：Transformants

2.3 真菌生長表型

在MMN培養基上培養7 d的雙色蠟蘑野生型(圖4A)與LbH2B∷mCherry(LbH2B)真菌轉化子(圖4B～4E)的生長情況沒有區別：野生型菌落的平均直徑為702 mm,LbH2B-1轉化子真菌菌落的平均直徑為726 mm,LbH2B-6真菌菌落的平均直徑為715 mm,LbH2B-7真菌菌落的平均直徑693 mm,LbH2B-12真菌菌落的平均直徑為696 mm。而且野生型與轉化子間生長速度相近,真菌生長形態沒有區別。實驗表明雙色蠟蘑轉化子LbH2B和紅色熒光蛋白融合表達后不會影響真菌的生長狀態。

圖4 雙色蠟蘑菌落形態Fig.4 Colony morphological diagram of L. bicolorA：雙色蠟蘑野生型;B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-1轉化子;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-6轉化子;D：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-7轉化子;E：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-12 轉化子A：WT;B：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-1 strain;C：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-6 strain;D：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-7 strain;E：pHg-pCEBN∷mCherry-H2B-12 strain

2.4 陽性真菌轉化子的紅色熒光蛋白信號觀察

為了檢測融合熒光蛋白的表達情況,利用共聚焦激光顯微鏡對真菌菌絲進行觀測,結果發現,這四個陽性的真菌轉化子的細胞核中均有紅色熒光信號(圖5),而野生型卻沒有熒光信號。結果表明,本研究成功將核小體H2B蛋白和紅色熒光蛋白融合后,轉入外生菌根真菌雙色蠟蘑中,并穩定表達,證明了融合熒光蛋白在真菌分子機制可視化研究中的可行性。

圖5 雙色蠟蘑菌絲共聚焦顯微鏡圖Fig.5 Laser scanning confocal microscopy image of L.bicolor hyphae圖中綠色為真菌菌絲,紅色為熒光蛋白;GFP：488 nm波長熒光;mCherry：561 nm波長熒光;BF：明場;OVERLAP：疊加場green：Fungal hyphae, red：Fluorescent protein; GFP：Fluorescence at 488 nm wavelength, mCherry： Fluorescence at 561 nm wavelength, BF： Bright field, OVERLAP： Overlay field

3 討 論

外生菌根真菌分子機制的研究建立在高效的外生菌根真菌的遺傳轉化體系基礎上[10],本研究建立了陽性率達到90%以上高效的遺傳轉化體系,得到了核小體蛋白和紅色熒光蛋白融合表達的轉化子真菌。在真菌中,熒光蛋白除了在細胞質中表達外,還成功地靶向了不同的細胞器,例如細胞核、質膜、過氧化物酶體、線粒體、ER內腔和高爾基體[26-28],本研究選擇雙色蠟蘑核小體核心組蛋白H2B和紅色熒光蛋白融合表達,成功將熒光蛋白定位到細胞核中。在Kemppainen等[22]研究中也證實,紅色熒光蛋白的性能優于綠色熒光蛋白,可以產生更持久的熒光信號,并且紅色熒光的檢測波長范圍內菌絲自發熒光現象最微弱。本研究中選擇小麥胚凝集素(WGA)對菌絲染色,小麥凝集素可特異性識別與結合真菌細胞壁中的幾丁質[29],該染料帶有Alexe flour 488的顯色基團,很容易在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色的真菌菌絲,更好地觀察真菌菌絲的分布。組蛋白-熒光蛋白融合物與天然蛋白相似[30],可通過細胞中的所有有絲分裂期定位于細胞核中更方便可視化,在植物[31-32]和動物中已成功地表達了典型的組蛋白H2B-熒光蛋白融合體[33-36],本研究成功地以H2B作為目的基因,很好地觀察融合熒光蛋白的亞細胞定位,為后續研究基因的亞細胞定位提供了很好的實驗平臺。

根瘤農桿菌是一類普遍存在的革蘭陰性細菌,通過將克隆載體將目的片段插入到自身Ti質粒的T-DNA區,最終將T-DNA片段整合到寄主的基因組中[37],使用的農桿菌株系為AGL-1,研究表明外生菌根真菌常用的農桿菌菌株有AGL-1和LBA4404,在雙色蠟蘑中AGL-1的轉化效率比LBA4404高出4倍[11];由于較高的轉化效率,AGL-1在真菌遺傳轉化中使用較多,Kemppainen等[22]在研究中也使用AGL-1農桿菌,但并未表明轉化效率。本研究轉化效率為93.33%,與其他雙色蠟蘑遺傳轉化效率相比較高[38],并突出了熒光蛋白的表達檢測。影響ATMT轉化效率的因素有很多,包括農桿菌菌株株系、受體材料、目的載體構建、誘導劑濃度、農桿菌菌液濃度等[10]。農桿菌生長狀態需要處于對數期,即活力最強時期;為提高轉化效率需在重懸液中加入乙酰丁香酮作為誘導劑,Satish等[39]在沙漠松露(Terfeziaboudieri)轉化中發現如果不添加乙酰丁香酮轉化率幾乎為零,且最適宜濃度為200 μmol/L。受體材料前期培養中,本研究使用MMN培養基區別于Kemppainen在培養真菌時使用的P5培養基,DNA篩選結果發現,此方法對外生菌根真菌的侵染,陽性率較高,能篩選到陽性轉化子高達90%以上,得到了更好的轉化效率。

綜上所述,本研究利用農桿菌介導的方法侵染真菌,獲得了極高的轉化效率;篩選獲得核小體和熒光蛋白融合表達菌根真菌菌株LbH2B,真菌轉化子并不影響菌絲的生長狀態;利用激光共聚焦顯微鏡清晰地觀察到菌絲細胞核中的紅色熒光。本研究成功地建立了融合表達熒光蛋白的菌根真菌轉化體系,為后續研究其他基因在菌根真菌中的功能提供了技術平臺。在以后的研究中,可將本研究建立的熒光蛋白融合體系用于后續的基因亞細胞定位分析,特別是真菌啟動子的時空表達分析,為揭示菌根形成中的信號分子交流機制提供參考。