抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成的乳桿菌篩選及機制初探

李佳珣, 葉雨寒, 胡心怡, 張秋香, 趙建新

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

近年來,慢性創面感染的發病率不斷上升,傷口愈合緩慢影響了患者的生活質量[1-2]。慢性創面感染主要受多種微生物的影響,這些微生物定植在傷口上形成生物膜,并產生代謝產物進而延緩傷口的愈合[3-4],其中最常見的病原菌為銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌[5],二者具有協同作用共同形成毒力和抗生素耐受性更強的生物膜[6]。生物膜態病原菌對大部分慢性創面感染有實質性的影響,進而導致傷口愈合不良[7]。病原菌生物膜的形成與群體感應系統的調控密不可分[8],其中,銅綠假單胞菌群體感應系統中的lasR和rhlI基因[9-10]和金黃色葡萄球菌群體感應系統中的SarA和RNAIII基因[11-12]與生物膜形成和致病菌的毒力因子表達密切相關。隨著對益生菌研究的不斷深入,在皮膚健康領域應用益生菌療法已有一些研究和嘗試,如植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌[13-14]。Onbas等[15]研究發現植物乳桿菌F10上清液對皮膚慢性創面致病菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生長具有抑制作用。Moreira等[16]研究表明,小鼠口服鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.3724可以促進皮膚傷口愈合并減少疤痕形成。然而目前的研究主要集中在乳桿菌對單菌感染的抑制效果評價上,乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌混合生物膜形成及其種間群體感應的影響鮮有報道。本研究通過探究乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群體感應信號分子AI-2的產量等指標綜合評價乳桿菌的抗感染潛力,采用PCA等分析方法篩選得到具有優良特性的益生菌菌株,最后評價其對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜和群體感應系統相關基因的影響,以期得到具有抗感染潛力的乳桿菌,為其應用于慢性創面敷料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM233(分離自昂立一號口服液)、CCFM595(分離自四川眉山泡菜)、CCFM11(分離自發酵蔬菜)、CCFM10(分離自發酵蔬菜)、CCFM634(分離自四川內江泡菜)、CCFM8724(分離自發酵蔬菜)、CCFM361(分離自土壤)、卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)FHBZX 13M4、FHNFQ 15L11、FCQJJ 9M2(均分離自糞便)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM(分離自商業化酸奶發酵劑)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)FAHWH 30-1、FAHWH 26-1、FBJCY 3-1、FBJCY 2-1(均分離自糞便)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)D-6-A122、D-9-A28(均分離自酸奶)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)17312(分離自重慶泡菜水),上述乳桿菌現保藏于江南大學食品生物技術中心;哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)BB170由渤海大學食品科學與工程學院勵建榮教授課題組惠贈,現保藏于江南大學食品生物技術中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC1.1861、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC29213購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,現保藏于江南大學食品生物技術中心。

1.1.2 培養基 LB培養基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉 10.0 g,蒸餾水1.0 L,配制固體培養基時添加20 g瓊脂,用于培養生物膜的LB培養基則需添加0.1 g蔗糖;MRS培養基：葡萄糖20.0 g,牛肉膏10.0 g,胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,無水乙酸鈉5.0 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸鎂0.58 g,硫酸錳0.25 g,吐溫-80 1.0 mL,蒸餾水1.0 L,pH調至6.2～6.4。以上培養基均115 ℃高壓滅菌20 min;AB培養基：氯化鈉0.3 mol,硫酸鎂 0.05 mol,酸水解酪蛋白 0.2 g,蒸餾水1.0 L,115 ℃ 高壓滅菌20 min后加入10 mL 1 mol/L的無菌磷酸鉀緩沖液,10 mL 0.1 mol/L的無菌精氨酸溶液和20 mL 50%(體積分數)無菌甘油;2216E培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 結晶紫、甲醇、冰醋酸、三氯甲烷、異丙烷、無水乙醇、胰蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、牛肉膏、無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫-80、精氨酸、甘油、蔗糖購自國藥集團化學試劑有限公司,酵母提取物購自賽默飛世爾科技有限公司,酸水解酪蛋白購自上海碧迪醫療器械有限公司,RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司,全波長酶標儀(Multiscan Go,賽默飛世爾科技有限公司);實時熒光定量PCR儀(CFX96, 上海伯樂生命醫學產品有限公司);臺式冷凍高速離心機(Centrifuge 5424R,Eppendorf公司);基因擴增儀(T100,上海伯樂生命醫學產品有限公司);微量核酸檢測儀(NanoPhotometer?N120,德國因普恩中國有限公司)?？祵?6孔細胞培養板購自南通市海之星實驗器材有限公司,qPCR 96孔板、premix Mix購自上海伯樂生命醫學產品有限公司,無酶槍頭購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養 取出-80 ℃保藏的乳桿菌,將菌液以體積比1∶50分別接種于5 mL的MRS培養基中,于微需氧恒溫培養箱中37 ℃靜置培養18 h。將金黃色葡萄球菌CGMCC1.1861、銅綠假單胞菌ATCC29213接種于LB培養基中,于需氧振蕩培養箱中37 ℃培養18 h。哈維氏弧菌BB170接種于2216E培養基,于需氧振蕩培養箱中28 ℃,200 r/min 培養18 h?；罨?代后用于實驗。為培養雙菌生物膜,將活化后的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于0.1 g/L(質量濃度)蔗糖的LB液體培養基中,使菌懸液濃度達到約107cfu/mL。為得到乳桿菌無菌上清液,將乳桿菌的過夜培養液于4 ℃以6 000×g離心10 min,為排除酸的影響,取一半上清液調pH至中性(pH=7),用0.22 μm的濾膜過濾除菌,另一半上清液直接過濾除菌,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 結晶紫法測定致病菌生物膜量 采用結晶紫染色法,在96孔板中分別加入金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液各75 μL,隨后將乳桿菌上清液加入孔板中,37 ℃靜置培養24 h。陰性對照組以同等體積的MRS培養基代替。培養結束后去除培養液,用1 mol/L的磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline, PBS)小心清洗生物膜2遍,室溫靜置晾干。向每孔中加入100 μL甲醇以固定生物膜,10 min后棄去甲醇,自然晾干,加入100 μL 0.1%(質量分數)的結晶紫溶液,將生物被膜染色30 min。染色結束后用PBS清洗2遍,每孔以100 μL 33%(體積分數)的冰醋酸溶解,用酶標儀讀取OD600吸光度值。每組設置6個平行[17]。

1.2.3 抑菌圈法測定乳桿菌對致病菌生長的抑制作用 為篩選得到不抑制銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌生長但能夠顯著抑制致病菌生物膜形成的乳桿菌,采用雙層平板打孔法,在素瓊脂上倒一層LB固體培養基,在其上涂布銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌,隨后在瓊脂上打孔并在孔內分別加入200 μL已調pH的乳桿菌上清液和未調pH的乳桿菌上清液,37 ℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈直徑。每組設置2個平行。

1.2.4 化學發光法測定AI-2信號分子 哈維氏弧菌發光現象受到群體感應的調控,其中哈維氏弧菌BB170菌株僅識別AI-2信號分子從而發光,發光強度隨AI-2分子的含量升高而增大。為探究乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌群體感應系統的影響,本研究采用哈維氏弧菌BB170化學發光法檢測乳桿菌自身產生AI-2能力以及乳桿菌對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2的影響,按1.2.2所述培養生物膜,培養結束后收集、過濾獲得雙菌培養的無菌上清液,備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170接種于AB培養基,28 ℃、180 r/min培養12 h,調節菌液OD600為0.8左右,再用無菌新鮮AB培養基按1∶2 000(體積比)稀釋該菌液,混勻備用。按1∶50(體積比)將乳桿菌上清液或上述收集的雙菌培養上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。28 ℃、100 r/min培養5 h,避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標板中,以多功能酶標儀于波長571 nm處檢測哈維氏弧菌BB170化學發光情況[18]。

1.2.5 RT-qPCR測定致病菌毒力基因表達 按1.2.2制備生物膜樣品,用生理鹽水洗脫生物膜并移至無酶離心管中,4 ℃、3 000×g離心2 min,棄上清液,按RNA提取試劑盒提取生物膜RNA,提取后于微量核酸檢測儀測定RNA濃度。隨后用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR所用引物如表1所示。反應體系為10 μL：SYBR Green Mix 5 μL;上下游引物各0.5 μL;cDNA 1 μL;無酶ddH2O 3 μL。反應條件為95 ℃ 15 min、40個循環(95 ℃ 15 s 55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)、融解曲線(95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃ 0.5 s)。以16S rRNA作為內參基因校準相關基因的相對mRNA水平,通過2-ΔΔCt法對靶基因進行定量分析[19]。

表1 RT-qPCR所用引物

1.2.6 數據分析和處理 數據分析使用Graphpad Prism 8.4.3、R studio 4.0.1、SPSS軟件,使用One-way anova進行方差分析,P< 0.05表示具有顯著性差異,使用Graphpad Prism 8.4.3、R包 ggplot2和PCAtools等進行數據可視化。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌對致病菌生物膜量的影響

生物膜對超過90%的慢性創面感染有實質性的影響，會導致傷口愈合不良。由圖1可知，未調pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌雙菌生物膜的形成均具有顯著的抑制作用，這可能是由于乳桿菌上清液中的酸抑制了雙菌生物膜的形成[24]。而大部分調pH后的乳桿菌上清液沒有抑制生物膜的效果。由圖1B可知，植物乳桿菌CCFM233、CCFM595，卷曲乳桿菌13M4、15L11、9M2，嗜酸乳桿菌NCFM顯著抑制生物膜的形成，而鼠李糖乳桿菌FAHWH26-1顯著促進生物膜的形成。

圖1 乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌雙菌生物膜抑制效果評價Fig.1 Evaluation of the biofilm inhibitory effect of Lactobacillus supernatant on biofilms ofPseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureusA：未調pH;B：調pH。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)A： Without pH adjustment; B： pH adjustment. * Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.2 乳桿菌對致病菌生長的影響

未調pH的乳桿菌上清液顯著抑制生物膜的形成,而大部分調pH后的乳桿菌上清液沒有抑制生物膜形成的效果,這可能是由于調pH和未調pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生長能力的影響不同,因此采用抑菌圈法測定乳桿菌上清液作用于致病菌后抑菌圈直徑,結果表明(表2),除卷曲乳桿菌15L11、鼠李糖乳桿菌A28、短乳桿菌17312外,其余未調pH的乳桿菌上清液對兩種致病菌都具有不同程度的抑菌能力,其中植物乳桿菌CCFM233對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均有較大的抑菌圈。而調pH的乳桿菌上清液均不能抑制菌的生長,因此,調pH的乳桿菌上清液可能通過群體感應等其他方式來調控生物膜形成。后續僅對調pH的乳桿菌上清液進行研究。

表2 未調pH的乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果評價Table 2 Evaluation of the bacteriostatic effect of Lactobacillus supernatant without pH adjustment on P. aeruginosa and S. aureus

2.3 乳桿菌對細菌間群體感應信號分子AI-2產生的影響

為探究乳桿菌對致病菌群體感應的影響,使用哈氏弧菌生物發光法測定乳桿菌自身AI-2產量和其對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2的影響,由圖2A可知,乳桿菌菌株自身產生的AI-2 信號分子有所差異,其中,植物乳桿菌CCFM233、CCFM11、CCFM10,鼠李糖乳桿菌FBJCY 3-1,短乳桿菌17312產生的AI-2分子較多。乳桿菌的AI-2的產生與其抗菌能力如細菌素分泌密切相關,AI-2產量越多,其抗菌能力越強[25]。不同乳桿菌菌株對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間AI-2分子的影響也不同,植物乳桿菌CCFM233和CCFM634干預后,種間的AI-2顯著升高,但植物乳桿菌CCFM233能顯著抑制生物膜的形成,而植物乳桿菌CCFM634則不能,這可能是由于本身AI-2分子的含量差異所導致。

圖2 群體感應評價Fig.2 Evaluation of quorum sensingA：乳桿菌自身產生AI-2產量;B：乳桿菌上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之間群體感應分子AI-2產生的影響。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)A： AI-2 production by Lactobacillus; B： Effect of Lactobacillus supernatant on the production of AI-2, a quorum-sensing molecule between P. aeruginosa and S. aureus. *Iindicates significant difference from the control group (P<0.05)

2.4 乳桿菌特性綜合分析

為篩選得到具有抗感染潛力的乳桿菌菌株,采用主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)來評價乳桿菌抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的能力。載荷圖(圖3B)顯示可以分為6個主成分,其中最重要的是第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2),其貢獻率分別為50.9%和49%,其中PC1的特征是乳桿菌上清液調pH時對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜的抑制效果,PC2的特征是乳桿菌自身AI-2產量和其對種間AI-2的影響。由圖3A可知,PCA得分高的細菌為植物乳桿菌CCFM233和CCFM634,具有較高的綜合能力。再結合熱圖(圖3C)分析,熱圖顏色越接近紅色,表示抑菌圈直徑、致病菌生物膜形成量、AI-2產量越高,由此可見,植物乳桿菌CCFM233產生的AI-2信號分子較多,具有良好的抑菌能力,致病菌生物膜形成量最低,因此選擇植物乳桿菌CCFM233做進一步研究。

2.5 植物乳桿菌CCFM233對致病菌毒力基因表達的影響

為探究植物乳桿菌CCFM233對致病菌群體感應調控毒力基因的影響,使用RT-qPCR測定CCFM233上清液干預后金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的毒力基因表達能力。銅綠假單胞菌QS受lasI/R系統控制,LasR的抑制可導致下游QS信號的丟失。由圖4可知,在CCFM233干預后,LasR和rhlI分別下調了82%和18%,這兩個基因的顯著下調說明乳桿菌抑制了銅綠假單胞菌的毒力基因表達,進而抑制了生物膜形成。負責調控金黃色葡萄球菌生物膜形成和部分毒力因子表達的SarA基因在CCFM233上清液干預后顯著下調(85%),說明了乳桿菌抑制了金黃色葡萄球菌毒力因子表達。而RNAIII的基因表達水平與對照組相近,沒有顯著下降。

圖4 植物乳桿菌CCFM233上清液對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌基因表達的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum CCFM233 supernatant on gene expression of P. aeruginosa and S. aureus*表示與對照組差異顯著(P<0.05)* Indicates significant difference from the control group (P<0.05)

3 討 論

皮膚的慢性創面存在著生物膜態的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。銅綠假單胞菌是一種革蘭陰性細菌,其能夠在醫療設備和人體組織中定殖引起感染,并在臨床環境中會形成耐抗生素生物膜[26]。金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性細菌,會分泌多種外毒素,如腸毒素、白細胞溶血素等,且會在醫院使用的各種醫療設備表面形成生物膜,導致慢性和持續性感染[27]。近年來乳桿菌在皮膚健康方面應用廣泛,Ong等[28]研究表明植物乳桿菌USM8613可以產生植物乳桿菌素,并抑制傷口部位的金黃色葡萄球菌感染進而促進傷口愈合,Vagesjo等[29]研究發現羅伊氏乳桿菌產生CXCL12加速小鼠傷口愈合,Fang等[30]研究發現植物乳桿菌CCFM8610改善了特應性皮炎。本研究通過評價實驗室保存的乳桿菌菌株對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成、抑菌效果、群體感應信號分子AI-2產量的影響,發現同種不同株的乳桿菌抑制生物膜形成的能力也有所差異。值得注意的是,未調pH的乳桿菌上清液對兩種致病菌都具有不同程度的抑菌能力,而調pH的乳桿菌上清液均不能抑制細菌的生長,說明調pH的乳桿菌上清液可能通過其他方式調控生物膜形成,比如調節群體感應。研究結果進一步證實了植物乳桿菌CCFM233顯著抑制生物膜的形成,且種間的AI-2顯著升高,李建周等[25]的研究結果表明乳桿菌通過提高銅綠假單胞菌AI-2的表達進而抑制其形成生物膜,本研究也與該研究結果一致。

隨后采用PCA等分析方法篩選得到一株益生菌菌株植物乳桿菌CCFM233,該菌株具有優良特性和抗感染潛力,自身產生的AI-2產量高且可以顯著抑制致病菌生物膜形成,提高致病菌間的AI-2產量。最后評價植物乳桿菌CCFM233對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜和群體感應系統相關基因的影響,其顯著下調了銅綠假單胞菌的LasR和rhlI以及金黃色葡萄球菌的SarA,但RNAIII的基因表達水平與對照組相近,這可能因為金黃色葡萄球菌的QS系統agr可感知環肽信號分子的局部濃度,并將其轉化為特定的基因表達模式[31],因此RNAIII作為agr系統的主要效應器,在CCFM233上清液干預后,金黃色葡萄球菌的環肽信號分子濃度有所上升,故RNAIII的基因表達水平沒有顯著下降。

綜上,本研究揭示了植物乳桿菌CCFM233具有抗銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌感染的潛力,為其應用于慢性創面敷料及相關生物制品的研發提供了一定的理論依據,乳桿菌自身產生AI-2以及乳桿菌在致病菌生物膜環境中產生AI-2的能力與其抑制銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌形成生物膜的量效關系仍有待進一步研究。