萎縮芽孢桿菌Rk1殼聚糖酶高效制備及特性表征

王建榮，祝木金，王平，陳微，余思，鐘斌

1(深圳潤康生態環境股份有限公司，廣東 深圳，518102)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

幾丁質是一種由乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的多糖，來源豐富，在自然界的含量僅次于纖維素[1]。幾丁質和纖維素一樣，由于內部致密的結晶結構，導致其溶解性很差，從而限制其商業化應用[1]。殼聚糖作為幾丁質脫乙?；蟮难苌a物，可以溶于稀酸，但是不溶于水，且具有高黏度等缺陷，限制了其應用[2]。殼聚糖進一步分解，則形成殼寡糖。相比幾丁質和殼聚糖，殼寡糖具有很好的溶解性，可以溶于水和多種溶劑[3]。殼寡糖具備多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌等，在保健食品、化妝品、醫藥等領域具有巨大的應用潛力[4]。此外許多研究證明，殼寡糖的生物活性取決于其聚合度和脫乙酰度，根據不同應用領域，需要定向制備不同特性殼寡糖，才能最大化發揮其價值。目前殼寡糖的制備方式主要分為物理、化學和酶法3大類[5]。相比于另外2種方法，酶法具有綠色無污染、產物結構完整、反應過程及產物可控等優勢，因此酶法成為主流方式用于殼寡糖制備領域[5]。

有多種酶可以水解殼聚糖制備殼寡糖，這些酶主要分為特異性酶(殼聚糖酶)和非特異性酶(蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等)[6]。作為殼聚糖特異性水解酶，殼聚糖酶的水解效率遠高于非特異性酶[6]。殼聚糖酶根據氨基酸相似性，可以分為6個糖苷水解酶家族(包括糖苷水解酶5家族、7家族、8家族、46家族、75家族和80家族)，目前的研究主要集中在46家族和75家族[7]。已報道的46家族殼聚糖酶主要來源于芽孢桿菌和鏈霉菌，其中芽孢桿菌殼聚糖酶的研究集中于枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和莫海威芽孢桿菌，其他來源芽孢桿菌殼聚糖酶則報道較少[8-10]。因此研究和探索其他芽孢桿菌殼聚糖酶不僅能夠豐富殼聚糖酶的種類，而且有望獲得更高效的殼聚糖酶。

殼聚糖酶的制備方式主要分為天然菌發酵和異源重組表達2大類。天然菌發酵制備殼聚糖酶存在產量低、重復性差、酶系復雜等缺點，從而限制其大規模產業化應用[11]。異源重組表達則很好地規避了天然菌發酵存在的缺點，適用于大規模工業化生產。目前殼聚糖酶異源重組表達宿主包括大腸桿菌和畢赤酵母，其中大部分的研究選用大腸桿菌進行重組表達[12]。相對于大腸桿菌，畢赤酵母具備胞外表達、內源蛋白少、發酵過程及后處理工藝簡便等優勢，因此畢赤酵母更適合用于殼聚糖酶的高效制備[13-16]。本論文首先通過基因克隆獲得萎縮芽孢桿菌Rk1殼聚糖酶基因(簡稱bacsn46)，其次以畢赤酵母為宿主，通過密碼子優化和分子伴侶蛋白共表達，高效制備萎縮芽孢桿菌殼聚糖酶(簡稱BaCsn46)，最后系統研究了重組BaCsn46酶學特性，為其下一步研究和產業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)Rk1由實驗室前期從土壤分離獲得；不同分子伴侶蛋白表達載體由前期實驗構建[17](表1)；表達載體pPICZαA和畢赤酵母X33，賽默飛世爾科技公司；大腸桿菌Top10感受態細胞，深圳輝諾生物技術有限公司；TA克隆試劑盒、PCR擴增酶TaqTM、無縫克隆試劑盒和限制性內切酶SacI、BlnI，寶日醫生物技術(北京)有限公司；木聚糖、幾丁質、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉、不同脫乙酰度殼聚糖(85%、90%和95%)、氨基葡萄糖、G418硫酸鹽、卡那霉素，上海源葉生物科技有限公司；不同聚合度殼寡糖(殼二糖～殼六糖)，青島博智匯力生物科技有限公司；蛋白純化試劑盒(Ni-IDA)，上海生工股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖膠純化試劑盒和質粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；薄層層析硅膠板，德國默克公司。

表1 分子伴侶蛋白信息表Table 1 Information of secretion helper factor

1.1.2 儀器與設備

ProFlex PCR儀，美國應用生物系統(ABI)公司；GelDoc XR+凝膠成像系統、GenePulser XcellTM電轉化儀，美國伯樂公司；ND5000核酸濃度測定儀，北京百泰克生物技術有限公司；7 L發酵罐，鎮江東方生物工程設備技術公司；UV-1780紫外分光光度計，日本島津公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 培養基

LBA培養基(LB培養基添加質量濃度為0.03 g/L的氨芐青霉素)；LBZ培養基(LB培養基添加質量濃度為0.025 g/L的博來霉素)；YPDZ培養基(YPD培養基添加不同濃度博來霉素)；YPDG培養基(YPD培養基添加不同濃度遺傳霉素)；重組工程菌篩選培養基包括BMGY和BMMY培養基；重組工程菌高密度發酵培養基為BSM培養基；所有培養基的配制均可參照畢赤酵母表達手冊進行(https://www.thermofisher.com)。

1.2 實驗方法

1.2.1 萎縮芽孢桿菌殼聚糖酶Rk1基因克隆

將低溫保存的萎縮芽孢桿菌Rk1在LB固體培養基37 ℃活化后接入LB液體培養基，37 ℃、200 r/min培養24 h后提取基因組用于PCR擴增。根據NCBI中萎縮芽孢桿菌BA59基因組序列假定殼聚糖酶基因序列(基因登錄號：CP024051.1，2510631-2511455)和萎縮芽孢桿菌UCMB-5137基因組序列假定殼聚糖酶基因序列(基因登錄號：CP011802.1，1493426-1494250)設計一對引物[bacsn46-fw：ATGAAGGCAAAA(A/G)TAGATTCATG和bacsn46-rev：TTACTTGATTACGAAATCACCATAC]用于殼聚糖酶基因bacsn46擴增。以提取的萎縮芽孢桿菌殼聚糖酶Rk1基因組為模板，通過PCR擴增以及瓊脂糖凝膠電泳獲得目標產物，將目標產物純化回收后，連接至pMD20-T，轉入大腸桿菌Top10，通過菌液PCR獲得陽性轉化子，通過提取質粒酶切并測序，最終獲得殼聚糖酶基因bacsn46。

1.2.2 殼聚糖酶BaCsn46生物信息學分析

殼聚糖酶基因bacsn46序列比對分析通過NCBI在線軟件blastn和blastp完成；殼聚糖酶BaCsn46理化性質及二級結構分析由expasy平臺提供的軟件完成(https://www.expasy.org/)；信號肽預測分析通過在線軟件SignalP-6.0 Server完成；殼聚糖酶BaCsn46氨基酸比對分析由在線軟件ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)和ENDscript/ESPript(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)完成；殼聚糖酶BaCsn46三維建模以及分子對接分別由軟件Modeller10.2和軟件Autodock vinerv.1.2.0完成；蛋白三維結構比對以及分析通過軟件PyMOL1.8.x完成。

1.2.3 密碼子優化提升重組BaCsn46表達

在本研究中選擇畢赤酵母α信號肽用于分泌表達重組BaCsn46，因此構建表達載體時需要去掉BaCsn46自身信號肽。以方法1.2.1獲得的bacsn46為模板，設計引物bacsn46s-fw(GAGGCTGAAGCTGAATTCGCGGGACTGAACAAGGATCAG)和bacsn46s-rev(TAGAAAGCTGGCGGCCGCCTTGATTACGAAATCAC-CATA)進行PCR擴增獲得不含信號肽的編碼序列(命名為bacsn46s)。通過無縫克隆將bacsn46s連接至表達載體pPICZαA后轉入大腸桿菌Top10，通過菌液PCR，酶切以及測序驗證最終獲得表達載體pPICZαA-bacsn46s。為了研究密碼子偏好性對重組BaCsn46表達的影響，根據畢赤酵母密碼子偏好性，通過在線軟件GenSmart Codon Optimization對bacsn46s序列進行優化。優化后的基因命名為bacsn46sopt，由通用生物(安徽)股份有限公司合成并連接至表達載體pPICZαA，從而獲得表達載體pPICZαA-bacsn46sopt。

用SacI分別線性化表達載體pPICZαA-bacsn46s和pPICZαA-bacsn46sopt，純化回收后測定濃度。分別將線性化表達載體pPICZαA-bacsn46s和pPICZαA-bacsn46sopt轉入畢赤酵母X33。轉化子均勻涂布于YPDZ平板(博來霉素質量濃度分別為0.2，0.4，0.6和0.8 g/L)，30 ℃培養3 d后，通過24孔板法進行初步篩選，通過搖瓶培養進行復篩。篩選過程參照之前方法進行[17]。

1.2.4 分子伴侶蛋白共表達

以1.2.3中篩選出來的酶活性優勢菌為宿主，通過共表達不同分子伴侶蛋白，進一步提升重組BaCsn46表達量。參照文獻[17]的方法將酶活性優勢菌制備成感受態細胞；提取不同分子伴侶蛋白共表達載體并用限制性內切酶BlnI線性化；純化回收不同線性化后的分子伴侶蛋白表達載體并轉入酶活性優勢菌，轉化子均勻涂布于YPDG固體平板，30 ℃培養3～4 d；共表達分子伴侶蛋白轉化子篩選和1.2.3中方法一致。

1.2.5 高密度發酵

參照文獻[17]的方法進行。將重組工程菌接入YPD培養基制備一級和二級種子液；將二級種子液按照10%(體積分數)的接種量接入7 L發酵罐進行培養；初始階段流加葡萄糖作為碳源進行培養，當菌體濕重達到170 g/L后，開始進行甲醇誘導培養，整個過程保持溶氧大于10%；誘導階段每隔24 h進行菌體濕重、總蛋白濃度以及酶活力的測定。

酶活力測定采用DNS方法[10]，以95%脫乙酰度膠體殼聚糖為底物(5 g/L)，反應pH和溫度分別為6.0和55 ℃。首先將膠體殼聚糖底物和酶液分別預熱5 min；其次分別取50 μL酶液和350 μL膠體殼聚糖，振蕩混勻，水浴反應10 min后加入600 μL DNS溶液終止反應；最后將反應溶液煮沸5 min，冷卻至室溫后在OD540測定吸光值，以失活的酶液作為對照。酶活力定義為每分鐘生成1 μmol氨基葡萄糖為一個酶活力單位?？偟鞍诐舛炔捎肂radford法進行測定，具體步驟參照試劑盒說明書進行。菌體濕重測定方法如下：將發酵液離心去掉上清液后進行稱重，根據前后質量差計算菌體濕重。

1.2.6 重組BaCsn46分離純化及酶動力學參數測定

參照文獻[10]的方法分離純化重組BaCsn46。首先采用超濾管(10 kDa)進行濃縮，濃縮后的重組BaCsn46參照Ni-IDA蛋白純化試劑盒進行純化。酶動力學參數測定參照文獻[10]的方法進行，以不同濃度95%脫乙酰度膠體殼聚糖為底物，測定重組BaCsn46反應速度，通過Graph分析獲得最大反應速度Vmax和米氏常數Km。

1.2.7 重組BaCsn46表征分析

重組BaCsn46表征分析包括pH特性、溫度特性、金屬離子特性、底物特異性。pH特性包括最適反應pH和pH穩定性：在不同pH緩沖液條件下測定重組BaCsn46的酶活力，將酶活力最高pH條件下的酶活力設置為100%計算其他pH條件下的相對酶活力；將重組BaCsn46在pH 3.0～11.0條件下室溫放置4 h后進行剩余酶活力測定，以沒有處理的樣品作為對照，計算不同pH條件下的剩余酶活力。

重組BaCsn46溫度特性包括最適反應溫度和熱穩定性：在不同溫度條件下測定重組BaCsn46的酶活性，以酶活力最高溫度設置為100%計算其他溫度的相對酶活力；將重組BaCsn46在不同溫度條件下水浴處理30和60 min后進行剩余酶活力測定，以沒有熱處理的樣品作為對照，計算剩余酶活力。

不同金屬離子(Co2+、Cu2+、Fe2+、Na+、Ca2+、K+、Mn2+和Mg2+)對重組BaCsn46穩定性影響如下：將重組BaCsn46分別加入含有1和5 mmol/L不同金屬離子緩沖液(pH 7.0)，室溫放置4 h后進行活性測定，以沒有處理的樣品作為對照，計算剩余酶活力。

重組BaCsn46對不同底物水解活性的測定如下：分別測定重組BaCsn46對羧甲基纖維素鈉、木聚糖、可溶性淀粉、膠體幾丁質、粉末幾丁質以及不同脫乙酰度膠體殼聚糖的活性，把酶活力最高的底物設置為100%，計算其他底物的相對酶活力。

1.2.8 重組BaCsn46水解模式分析

以不同聚合度殼寡糖為底物分析重組BaCsn46的水解模式。重組BaCsn46的添加量為10 U/mL，不同殼寡糖底物質量濃度為5 g/L，在50 ℃、100 r/min條件下反應2 h，反應過程中定時取樣進行薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)分析。擴展劑為V(異丙醇)∶V(氨水)∶V(水)=15∶7.5∶1，層析完成后，噴顯色劑(0.5 g茚三酮溶于100 mL無水乙醇)，在微波爐高溫5 min后，觀察實驗結果。

1.2.9 重組BaCsn46酶法制備殼寡糖

重組BaCsn46酶法制備殼寡糖所用底物為95%脫乙酰度膠體殼聚糖(質量濃度為40 g/L)。首先研究不同酶添加量(10～30 U/mL)條件下殼寡糖的組成?？偡磻w系為10 mL，在50 ℃、100 r/min反應1 h后進行水解率測定以及產物分析。水解率測定參照文獻[10]的方法進行，將水解產物(5 mL)加入NaOH溶液調整pH至8.5，離心去上清液，在100 ℃烘干至恒重，根據質量差進行計算。通過TLC分析水解產物殼寡糖組成。

根據第一步酶解實驗結果，進一步研究15 U/mL酶添加量不同反應時間水解率以及殼寡糖組成。反應總體系為200 mL，反應條件為50 ℃、100 r/min。反應過程中定時取樣進行TLC分析、水解率測定以及水解產物分析[8]。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶基因bacsn46克隆及分析

通過PCR擴增獲得長度約為830 bp的特異條帶，將該條帶純化連接至pMD20-T，轉化至大腸桿菌Top10，結合酶切和測序驗證最終獲得殼聚糖酶基因bacsn46。bacsn46全長為825 bp，編碼274個氨基酸。通過預測分析，發現BaCsn46分子質量為30.7 kDa，等電點為6.22，前32個氨基酸為信號肽。NCBIblastp比對結果表明，BaCsn46屬于殼聚糖酶46家族，與耐鹽芽孢桿菌相似性最高(87.5%)，其次為漠海威芽孢桿菌(87.1%)。

以去除信號肽的氨基酸序列進行蛋白三維建模，實驗結果如圖1所示。由圖1-a可知，BaCsn46三維構象可分為上下2個半球，其中上、下半球均主要由4個α螺旋構成，這2個半球通過一個長的α螺旋進行連接。PyMOL軟件分析BaCsn46蛋白表面靜電分布，發現其底物結合區域主要帶負電荷(圖1-b)，有利于其與殼聚糖進行結合和發生催化反應。BaCsn46與殼六糖分子對接結果表明，BaCsn46主要以氫鍵的方式和殼六糖進行結合(圖1-c)，此外在底物結合區域多個氨基酸(E19、Y29、D35、R37、T40、A44、G45、T50、D52、Y118、Q146、D149、W204、E206和E235)在水解反應中發揮重要作用。

a-BaCsn46三維構象；b-BaCsn46靜電分析圖；c-BaCsn46催化活性中心關鍵氨基酸和殼六糖相互作用圖1 殼聚糖酶BaCsn46三維結構分析Fig.1 Homology-modeling structure of BaCsn46

2.2 密碼子優化提升重組BaCsn46表達量

根據畢赤酵母密碼子偏好性，分析bacsn46s基因序列，發現存在多個低頻密碼子，如編碼丙氨酸所對應的密碼子GCG、編碼亮氨酸所對應的密碼子CTC等，因此需要優化bacsn46s基因序列。經過優化bacsn46s內部166個堿基，使得bacsn46s基因序列的GC含量由44.72%提升至46.78%，表達適應指數由0.61提升至0.82，優化后的基因bacsn46sopt與bacsn46s相似性約為77%(圖2)。

圖2 殼聚糖酶基因bacsn46s 密碼子優化前后序列比對Fig.2 Sequence comparison between the native and optimized gene of bacsn46s

初步篩選實驗，bacsn46s和bacsn46sopt所對應重組菌分別挑選96個轉化子進行培養，經過酶活力測定，最終各獲得3個酶活性優勢菌。bacsn46s所對應的3個重組工程菌分別命名為B1、B26和B75，酶活力分別為12.6，12.3和12.1 U/mL。bacsn46sopt所對應的3個重組工程菌分別命名為Bo11、Bo35和Bo86，酶活力分別為17.2、16.5和16.2 U/mL。通過搖瓶培養進一步比較初步篩選獲得的酶活力優勢菌，bacsn46sopt所對應的重組工程菌Bo11、Bo35和Bo86發酵酶活力均高于bacsn46s所對應的重組工程菌B1、B26和B75，重組工程菌Bo11、Bo35、Bo86、B1、B26和B75搖瓶發酵酶活力分別為71.5、63.3、66.5、52.8、55.3和49.6 U/mL。

相比于搖瓶培養，發酵罐培養更容易控制補料速度、溫度、pH等技術參數，因此能夠更精確地比較不同菌種的發酵特性。為了更精確地比較bacsn46s和bacsn46sopt所對應酶活力優勢菌B26和Bo11的發酵特性，分別將2個菌種在7 L發酵罐進行高密度培養，實驗結果如圖3所示。7 L發酵罐培養條件下，重組工程菌B26和Bo11最高發酵酶活力分別為3 521和4 929 U/mL；總蛋白質量濃度分別為2.88和4.21 g/L。

圖3 重組工程菌B26和Bo11高密度發酵Fig.3 High density fermentation of recombinant strain B26 and Bo11

2.3 分子伴侶蛋白共表達提升重組BaCsn46表達量

以重組工程菌Bo11為宿主，將不同線性化后的分子伴侶蛋白表達載體轉入重組工程菌Bo11，獲得不同分子伴侶蛋白共表達重組工程菌。初步篩選結果表明分子伴侶蛋白KAR2效果最好，其次為HAC1和SSA1。將共表達分子伴侶蛋白KAR2、HAC1和SSA1最高酶活性工程菌分別命名為Bo11K、Bo11H和Bo11S。搖瓶培養結果顯示，重組工程菌Bo11K、Bo11H和Bo11S最高發酵酶活力分別為105.8、96.2和89.3 U/mL，分別是重組工程菌Bo11的1.46，1.34和1.24倍。

為了進一步比較重組工程菌Bo11和Bo11K的發酵特性，分別用7 L發酵罐進行培養，實驗結果如圖4所示。重組工程菌Bo11和Bo11K發酵酶活力分別為5 126和7 356 U/mL；總蛋白質量濃度分別為4.16和5.95 g/L；菌體濕重分別為432和486 g/L。此外將重組工程菌Bo11K不同誘導時間上清發酵液進行蛋白電泳，實驗結果如圖4-b所示。重組工程菌Bo11K發酵上清液中基本為重組BaCsn46，便于下游后處理工藝的進行。

a-重組菌Bo11和Bo11K在7 L發酵罐發酵酶活力、總蛋白濃度和細胞濕重；b-重組菌Bo11K發酵上清液蛋白電泳圖4 重組菌Bo11和Bo11K高密度發酵Fig.4 High density fermentation of recombinant strain Bo11 and Bo11K

2.4 重組BaCsn46純化及酶動力學參數測定

通過實驗獲得純化后的重組BaCsn46，其酶比活力為1 782 U/mg。此外重組BaCsn46米氏常數(Km)、最大反應速度(Vmax)、轉化數(Kcat)以及專一性常數(Kcat/Km)分別為1.02 g/L、1 962 μmol/(min·mg)、423 min-1和202 mL/(mg·min)，表明重組BaCsn46對殼聚糖具有良好的親和力并且能夠高效水解殼聚糖。

2.5 重組BaCsn46溫度和pH特性

以純化后的重組BaCsn46為研究對象，進行溫度和pH特性測定，實驗結果如圖5所示。由圖5-a可知，重組BaCsn46最適反應pH為6.0，在pH 5.0～6.5相對酶活力均大于60%。重組BaCsn46在pH 5.0～9.0范圍內，具有良好的穩定性，室溫放置4 h后，剩余酶活力均高于70%(圖5-b)。

重組BaCsn46最適反應溫度為60 ℃，在50～60 ℃相對酶活力均大于80%，當溫度升至70 ℃，相對酶活力快速下降，僅為24%(圖5-c)。由圖5-d可知，重組BaCsn46在45～50 ℃具有很好的穩定性，熱處理60 min后，剩余酶活力均大于90%，當熱處理溫度高于55 ℃，重組BaCsn46剩余酶活力急劇下降。

a-最適反應pH；b-pH穩定性；c-最適反應溫度；d-熱穩定性圖5 重組BaCsn46酶學特性Fig.5 Enzymatic properties of recombinant BaCsn46

2.6 金屬離子特性

在1 mmol/L條件下，Mg2+和Mn2+對重組BaCsn46具有激活作用，剩余酶活力分別為108%和123%，Fe2+則明顯抑制重組BaCsn46活性，剩余酶活力僅為8%，其他金屬離子剩余酶活力均大于80%。在5 mmol/L條件下，Mg2+、Ca2+和Mn2+對重組BaCsn46具有激活作用，剩余酶活力均高于105%；Fe2+和Cu2+則具有抑制作用，剩余酶活力僅為5%和32%。

2.7 底物特異性

重組BaCsn46最適反應底物為95%脫乙酰度膠體殼聚糖、其次分別為脫乙酰度90%和85%膠體殼聚糖，此外重組BaCsn46對膠體幾丁質、粉末幾丁質、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉和木聚糖均沒有活性。

2.8 重組BaCsn46水解模式分析

由圖6可知重組BaCsn46對殼二糖和殼三糖均沒有水解活性，反應120 min后，殼二糖和殼三糖均沒有被分解成更小的糖。重組BaCsn46對殼四糖有微弱的水解活性，反應120 min后，只有少部分殼四糖被分解。重組BaCsn46對殼五糖和殼六糖具有較高的水解活性：反應60 min后，大部分殼五糖轉化為殼二糖和殼三糖；反應30 min后，殼六糖則全部被分解，轉化成殼二糖、殼三糖和殼四糖。

2.9 不同聚合度殼寡糖制備

不同酶添加量的水解效果如圖7-a所示。酶添加量在10～15 U/mL，反應1 h后，水解產物由殼二糖至殼五糖構成，含有少量殼六糖，酶添加量>20 U/mL，水解產物則主要由殼二糖、殼三糖和殼四糖構成。

根據不同酶添加量實驗結果，選擇酶添加量15 U/mL研究不同反應時間下殼寡糖組成及水解率的變化。由圖7-b和圖7-c可知，反應15 min后，水解率達到90.2%，水解產物主要由殼三糖至殼六糖組成，其中殼五糖和殼六糖占比為44.2%。隨著水解反應進行，殼五糖和殼六糖逐漸被分解成殼二糖、殼三糖和殼四糖。反應30 min后，水解產物由殼二糖至殼六糖組成，質量濃度分別為5.58、8.24、10.37、7.34和6.06 g/L。當反應時間為45和60 min，水解產物主要包括殼二糖、殼三糖和殼四糖，水解率則均大于95.3%。

a-殼二糖；b-殼三糖；c-殼四糖；d-殼五糖；e-殼六糖圖6 重組BaCsn46水解模式分析Fig.6 Analysis of hydrolytic pattern of recombinant BaCsn46

a-不同酶添加量水解效果；b-不同反應時間水解效果；c-不同反應時間殼寡糖組成及水解率圖7 重組BaCsn46酶法制備殼寡糖Fig.7 Preparation of chitosan oligosaccharides by recombinant BaCsn46

3 討論

殼寡糖由于具備多種生物活性，在許多領域具有巨大的應用潛力，殼聚糖酶在殼寡糖酶法制備過程中發揮重要作用。迄今，關于殼聚糖酶的研究主要集中在46家族和75家族，相比于75家族，46家族殼聚糖酶具備催化活性高、反應條件溫和等優勢，更適于殼寡糖的制備[7,11]。本研究獲得的殼聚糖酶BaCsn46屬于46家族，和已報道的46家族殼聚糖酶相似[6,9-11]，BaCsn46三維構象主要由上下2個半球組成，催化活性區域呈負電荷，此外BaCsn46催化活性區的關鍵氨基酸主要通過氫鍵和底物發生反應。

重組BaCsn46最適反應pH為6.0并且在pH 4.5～6.0具有良好的活性和穩定性，這一特性與來源于莫海威芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶相似[10,15]，優于芽孢桿菌MD-5[18]。殼聚糖的水解效率取決于其溶解狀態，在酸性條件下殼聚糖具有良好的溶解性，有利于進行水解反應[1]。重組BaCsn46的pH特性表明其適用于殼寡糖的制備。迄今，報道的芽孢桿菌殼聚糖酶最適反應溫度主要分布在40～60 ℃[8,10,15,18]。雖然重組BaCsn46最適反應溫度為60 ℃，但其在60 ℃條件下熱穩定性較差，熱處理30 min后剩余酶活力僅為17%。重組BaCsn46在50 ℃的相對酶活力為88%，并且具有良好的熱穩定性(熱處理30 min，剩余酶活力為96%)，因此重組BaCsn46制備殼寡糖反應溫度可控制在50 ℃。

金屬離子通過改變酶蛋白的結構從而影響其活性。本研究中金屬離子Ca2+、Mg2+和Mn2+對重組BaCsn46具有激活作用；Fe2+和Cu2+則明顯抑制重組BaCsn46活性。已有文獻表明同一種金屬離子展現出激活或者抑制作用，和具體的殼聚糖酶相關。例如Cu2+明顯抑制重組BaCsn46活性，而Cu2+對來源于雪白鏈霉菌的殼聚糖酶則具有激活作用，在1 mmol/L條件下，其剩余酶活力高于150%[7]。

前期研究顯示，46家族殼聚糖酶具有高度底物特異性，對幾丁質、木聚糖、纖維素等多糖均沒有水解活性。此外膠體殼聚糖的脫乙酰度影響46家族殼聚糖酶水解活性，脫乙酰度越高，相對水解活性越高[8,18]，可能的原因是乙?；鶊F降低了殼聚糖酶和底物的結合和水解速率。殼聚糖酶水解殼聚糖主要分為外切和內切2種方式：外切主要從殼聚糖還原端進行水解，水解產物含有氨基葡萄糖；內切則是在殼聚糖內部隨機切割形成不同聚合度(>2)殼寡糖[19-20]。重組BaCsn46水解不同殼寡糖結果表明其是一種內切殼聚糖酶。此外在所有水解反應中重組BaCsn46沒有呈現轉糖苷酶活性，這一結果和已報道大部分46家族殼聚糖酶相似。

聚合度是影響殼寡糖生物活性的重要因素，不同聚合度殼寡糖在不同應用領域呈現出不一樣的效果。研究表明當殼寡糖的聚合度>5時，對金黃色葡萄球菌才具有抑菌效果[21]。ZOU等[22]的研究顯示，殼寡糖能夠提升小麥種子在寒冷條件下的發芽率和生長，其中殼六糖效果最好。LI等[23]在實驗過程中發現隨著殼寡糖聚合度降低，清除羥自由基能力逐漸增強，其中殼三糖效果最好。因此根據不同的應用領域，需要定向制備不同聚合度殼寡糖。本研究報道的重組BaCsn46能夠高效水解膠體殼聚糖，且通過控制酶添加量和反應時間，可定向制備不同聚合度殼寡糖。當酶添加量15 U/mL，底物質量濃度40 g/L，50 ℃條件下，反應15 min，水解率便達到90.2%。在反應前期，水解產物主要由殼四糖至殼六糖構成，在反應后期則主要由殼二糖至殼四糖組成。

作為殼寡糖酶法工藝的核心，殼聚糖酶的生產成本直接影響殼寡糖生產成本，因此高效制備殼聚糖酶具有重要意義。畢赤酵母作為一種成熟的表達系統，已成功重組表達多種酶蛋白。前期已有殼聚糖酶在畢赤酵母重組表達的報道，實驗結果表明畢赤酵母具有產量高、雜蛋白少等優勢。此外為了進一步提升重組蛋白在畢赤酵母的表達量，研究人員也嘗試了密碼子優化、基因拷貝數、分子伴侶蛋白共表達等策略[24-25]。本研究以畢赤酵母X33為宿主，通過結合密碼子優化和分子伴侶蛋白共表達實現了重組BaCsn46高效制備。在7 L發酵罐條件下，最高酶活力和總蛋白質量濃度分別為7 356 U/mL和5.95 g/L。由于酶活力測定方法存在差異，因此不能根據酶活力判斷表達水平的高低。通過分析不同文獻發現總蛋白濃度測定方法基本一致，目前鏈霉菌174殼聚糖酶在畢赤酵母表達量最高，總蛋白質量濃度達到8.5 g/L[25]，其次為解淀粉芽孢桿菌殼聚糖(總蛋白質量濃度約為4.5 g/L)[15]。此外和已報道的研究一樣，重組工程菌Bo11K發酵上清液中基本為重組BaCsn46，有利于后期純化和下游后處理工藝。

4 結論

本研究通過同源克隆獲得萎縮芽孢桿菌Rk1殼聚糖酶基因bacsn46，其全長為825 bp，編碼274個氨基酸。通過結合密碼子優化、分子伴侶蛋白共表達以及高密度發酵實現重組BaCsn46高效制備，發酵酶活力和總蛋白質量濃度最高分別達到7 356 U/mL和5.95 g/L。重組BaCsn46在45～55 ℃以及pH 5.0～6.0具有良好的穩定性和活性。重組BaCsn46作為一種內切殼聚糖酶，能夠高效水解不同濃度膠體殼聚糖，此外通過控制酶添加量和反應時間可以定向制備不同聚合度的殼寡糖。本研究為重組BaCsn46下一步的研究和產業化應用奠定基礎。