乙醛脫氫酶高產菌株的篩選及其酶學性質

汪冉，彭政，張娟

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)/未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122) 3(食品合成生物技術教育部工程研究中心(江南大學)/江蘇省食品合成生物技術工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

乙醛(CH3CHO)是乙醇的代謝物，廣泛存在于眾多食品、環境[1]和過量飲酒者體內[2]。大量的細胞和動物實驗研究發現，高劑量(40～1 000 μmol/L)的乙醛會對哺乳動物細胞產生較高毒性、誘變性以及致癌性[3-4]。此外，乙醛還會毒害乙醇生產過程中的微生物，使其無法正常生長，繼而使乙醇產量降低[5-8]。世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構已把乙醛列為Ⅰ類致癌物[9]。

乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)是廣泛存在于人和動物的肝臟細胞、植物細胞和微生物細胞中的一種氧化還原酶，可在NAD(P)+存在的條件下催化乙醛脫氫生成乙酸[2]。目前，工業化的ALDH主要從動物的胰腺、肝臟或肝細胞線粒體中提取，由于來源少，提取難度大，產量較低，成本較高，因此尚未得到廣泛應用[10-11]。研究發現，微生物ALDH來源豐富，學者們采用測定酶活性的方式獲取產ALDH的微生物。目前雖然已從法爾凱干酵母[12]、雪峰干酵母[13]、釀酒酵母[14]、陸生伊薩酵母[15]菌等眾多微生物細胞中提取到ALDH，但酶活性普遍較低。由于通過測定酶活性來篩選產ALDH的微生物這種方式工作量大且效率低，所以較難篩選到產高活性ALDH的微生物。醛脫氫酶抑制劑(雙硫侖)能夠通過抑制ALDH活性來抑制以乙醇為主要碳源的產ALDH微生物的生長，而產生較高活性ALDH的微生物因ALDH活性只受到部分抑制而能夠利用乙醇繼續生長。通過調整雙硫侖的濃度初步分離出一部分產較高活性ALDH的微生物，再以測定酶活性的方式確定最終結果，2種方法結合使用則能更高效并精確地篩選到產高活性ALDH的微生物菌株[5,15-18]。

本研究以雙硫侖抗性篩選結合酶活性測定的方式從葡萄樣品中篩選出產高活性ALDH的微生物，采用超聲波破碎法提取出ALDH并通過硫酸銨分級沉淀和DEAE-Sephacel陰離子交換層析將ALDH分離純化，研究該酶的最適反應溫度、最適反應pH、熱穩定性、pH穩定性、金屬離子的影響、底物特異性和動力學，為食品和環境中的乙醛降解奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與培養基

樣品：無錫自然葡萄園的土壤和葡萄。

無碳培養基(g/L)：(NH4)2SO45，KH2PO41，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，酵母粉 0.1，121 ℃滅菌15 min[5,19]。

雙硫侖培養基(g/L)：無碳培養基，瓊脂粉20，無水乙醇20，不同濃度的雙硫侖。無水乙醇和雙硫侖試劑經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，115 ℃滅菌30 min。

1.2 主要試劑及儀器

輔酶NAD+、酵母菌通用PCR引物[NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)、NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)]，生工生物工程(上海)股份有限公司；雙硫侖，上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、40%乙醛溶液、KCl、β-巰基乙醇、(NH4)2SO4，國藥集團化學試劑有限公司；DNA Marker和2×TaqDNA Polymerase，大連寶生物工程有限公司。

B00 N-900 N超聲波細胞破碎儀，上海版諾生物科技有限公司；SYNERGY/H1酶標儀，美國BioTek公司；PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；AKTA蛋白純化儀、陰離子交換柱，美國通用電器；GC-2030AF氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 菌株的分離與篩選

1.3.1 初篩

稱取10 g葡萄園土壤和新鮮葡萄，分別制成土壤懸液和葡萄汁液，用無菌生理鹽水將兩者梯度稀釋，分別吸取100 μL,10-4、10-5和10-6稀釋度的土壤懸液和葡萄汁液涂布于含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4 mg/L雙硫侖的無碳培養基平板，于30 ℃培養4～5 d后將含最高濃度雙硫侖平板上的單菌落挑出并劃線分離，保存于YPD斜面培養基[5, 19]。

1.3.2 復篩

將初篩得到的菌株在YPD固體培養基平板上劃線活化，挑取單菌落接種于5 mL YPD液體培養基中，于30 ℃，220 r/min恒溫搖床中過夜培養，以體積分數1%的接種量接入50 mL YPD液體培養基中，在30 ℃、220 r/min恒溫搖床中振蕩培養48 h。取3 mL發酵液于8 000 r/min離心5 min后收集全部菌體，用PBS(pH 7.4)洗滌并重懸菌體后進行超聲波破碎(開4 s，關5 s，工作時間20 min)，12 000 r/min離心3 min，取上清液測定酶活力[5]。

將Tris-HCl(pH 9.2)、輔酶NAD+、乙醛、KCl、β-巰基乙醇和超純水按照表1 ALDH活力測定體系中的添加量提前混勻，在35 ℃條件下溫浴10 min后加入ALDH，迅速使用酶標儀檢測340 nm下吸光度值的變化量，每隔1 min讀取1次吸光度值，總反應時間為5 min，根據每分鐘吸光度值的變化量計算出ALDH的酶活力[20]。

表1 ALDH活力測定體系Table 1 Enzyme activity assay system of ALDH

酶活力定義：在35 ℃下，1 min在340 nm下吸光度值發生0.001的數量變化定義為1個活力單位。ALDH的酶活力按公式(1)(2)計算[21]：

(1)

(2)

1.4 產ALDH菌株的鑒定

1.4.1 菌株菌落及細胞形態

根據產生菌的菌落和菌體形態、繁殖方式可以進行菌種初步分類鑒定[5, 22]。

1.4.2 菌株ITS rRNA序列的PCR擴增與序列測定

使用酵母ITS rRNA的通用引物進行PCR擴增，擴增體系為：2×TaqDNA聚合酶12.5 μL，10 μmol/L NL1和NL4各1 μL，菌液1 μL，水9.5 μL，混勻后即離心；PCR程序為：94 ℃ 3 min，預變性；94 ℃ 30 s，變性；55 ℃ 30 s，退火；72 ℃ 1 min，延伸；由變性到延伸設定為34個循環；72 ℃延伸10 min后反應終止[5]。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后將PCR產物送至上海生工測序。

1.4.3 ITS rRNA序列比對及系統發育樹構建

將菌株的ITS rRNA序列上傳至GenBank進行BLAST比對，篩選出與待鑒定菌株ITS rRNA序列同源性較高的序列，利用MEGA 7.0軟件以距離矩陣法中的Neighbor-Joining構建系統發育樹[5]。

1.5 ALDH的分離純化

1.5.1 硫酸銨分級沉淀

在冰浴條件下，將粗酶液置于磁力攪拌器上，一邊攪拌一邊緩慢加入硫酸銨粉末至飽和度依次達到35%、45%、55%、60%、70%、80%，分別于4 ℃靜置2 h，10 000 r/min離心20 min后收集分級沉淀，將沉淀溶于2 mL緩沖液A(pH 7.4，含0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液，體積分數3%的甘油，0.1 mol/L海藻糖，1 mmol/L二硫蘇糖醇)中并在相同的緩沖液中透析脫鹽，測定沉淀中的ALDH活力和蛋白質含量，確定使ALDH沉淀的最佳硫酸銨濃度范圍。

1.5.2 DEAE-Sephacel陰離子交換層析

DEAE-Sephacel層析柱(2.6 cm×9 cm)預先用緩沖液A平衡，柱床體積為50 mL。取10 mL經脫鹽處理的酶液上樣于該柱，用緩沖液A和緩沖液B(緩沖液A、1 mol/L NaCl)分段洗脫，收集活性ALDH并經緩沖液A透析脫鹽后濃縮至一定體積，經SDS-PAGE分析后確定最佳洗脫鹽濃度。

1.6 ALDH的酶學性質研究

1.6.1 ALDH的最適反應溫度及熱穩定性

為探究ALDH的最適反應溫度，分別測定反應體系在不同溫度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)下的酶活力，以檢測到的最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。將ALDH在不同溫度下保溫120 min后，計算各溫度下的剩余酶活力，以未處理組的酶活力為100%[20]。

1.6.2 ALDH的最適反應pH及pH穩定性

為探究ALDH的最適反應pH，將酶活力測定體系的 Tris-HCl(pH 9.2)和水替換成不同pH梯度(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的廣泛緩沖液，其他條件不變，分別測定不同pH條件下的ALDH活性，以檢測到的最高酶活力為100%，計算各pH條件下的相對酶活力。將酶液在不同pH緩沖液中保存2 h后，測定剩余酶活力，以未處理組的酶活力為100%。

1.6.3 金屬離子對ALDH的影響

向酶的反應體系中加入濃度為5 mmol/L的金屬離子(Na+、K+、NH4+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+)，以檢測到的最高酶活力為100%，計算ALDH的相對酶活力，以未添加金屬離子檢測到的酶活力為對照。

1.6.4 ALDH的底物特異性研究

底物特異性是在最適反應溫度和pH條件下，將酶活力測定體系中的乙醛替換成等濃度的甲醛、丙醛、正丁醛、戊二醛、丙酮醛、苯甲醛、水楊醛，其他條件不變，分別測定乙醛脫氫酶的活力性，以檢測到的最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.5 酶動力學常數的測定

將乙醛稀釋成不同濃度(0.2～5.0 mmol/L)，將輔酶NAD+稀釋成不同濃度(0.1～2.0 mmol/L)，將ALDH純酶液分別加入到不同濃度底物和輔酶NAD+中，測定反應初速，并繪制底物濃度和反應速度，以及輔酶NAD+濃度和反應速度之間的散點圖，再利用Origin 2021對各個數據點使用米氏方程展開非線性擬合至收斂，求得最大反應速度(Vmax)和米氏常數(Km)，并進一步計算催化常數Kcat及催化效率Kcat/Km[20, 23]。

1.7 乙醛降解實驗

1.7.1 乙醛標準曲線的繪制

1.7.2 樣品處理和頂空進樣條件

樣品處理：將提取到的ALDH粗酶液加入到裝有酶反應混合液[1 mol/L Tris-HCl(pH 9.2)，20 mmol/L 輔酶NAD+，100 mmol/L乙醛，3 mol/L KCl，1 mmol/L巰基乙醇]的20 mL的頂空瓶中，加水至終體積為3 mL，立即用鋁帽密封并置于35 ℃的水浴鍋反應2 h，然后沸水浴10 min將ALDH滅活，以不加輔酶NAD+的體系為對照。

頂空進樣條件：將裝有3 mL樣品的頂空瓶經75 ℃水浴加熱30 min，用2 mL注射器吸取2 mL液上氣體，迅速注入氣相色譜分析乙醛含量的變化。

1.7.3 色譜操作條件

色譜分析柱：HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；柱溫40 ℃恒溫5 min，以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，然后按20 ℃/min增至250 ℃，約保持2 min后結束分析；檢測器200 ℃；進樣口200 ℃；高純N2(載氣)流速1.2 mL/min；分流比設為25∶1；H240 mL/min，空氣400 mL/min，N245 mL/min[5, 24]。

1.7.4 數據分析和處理

按上述條件檢測并根據外標法計算樣品中的乙醛含量，設置3次平行實驗，取平均值，按公式(3)計算乙醛降解率(%)：

（4）澆筑事故處理?；炷翝沧⒅腥绯霈F澆筑中斷時間過長導致混凝土初凝或導管被拔出混凝土面的情況，應立即清除孔內混凝土重新澆筑；如清除難度大則可在上游側增加一道混凝土防滲墻，采用高壓旋噴樁在新、舊墻端頭結合處進行補強，確保墻體質量。

(3)

式中：ρ0，對照反應中的乙醛質量濃度，mg/L；ρ，酶催化反應結束后剩余的乙醛質量濃度，mg/L。

2 結果與分析

2.1 產ALDH菌株的篩選

由圖1可知，涂滿新鮮葡萄汁液的雙硫侖平板上生長了許多菌落，且隨著雙硫侖濃度的提高，平板上的菌落逐漸減少，直到含有4.0 mg/L雙硫侖的平板上不再有菌落生長。將含3.5 mg/L雙硫侖的平板上的單菌落劃線分離后進行搖瓶發酵，由表2可知，共有6株菌產生較高活性的ALDH，其中菌株CT-20產生的ALDH活性最高，為13.26 U/mL，故選擇菌株CT-20作為下一步研究對象。

圖1 雙硫侖平板篩選產ALDH菌株Fig.1 Screening of ALDH-producing strains by disulfiram plates

表2 不同菌株ALDH活性Table 2 ALDH activity of different strains

2.2 菌株的初步鑒定

2.2.1 菌株的形態特征

觀察菌株CT-20在YPD固體培養基和雙硫侖固體培養基上的生長形態，發現CT-20在YPD這樣營養充分的培養基上培養48 h后呈現微白色，圓形凸起狀，表面光滑且濕潤，質地比較均一，易挑取的狀態，如圖2-a所示；在雙硫侖培養基這樣營養匱乏的惡劣條件下，菌落邊緣長出明顯的假菌絲，如圖2-b；在光學顯微鏡下，CT-20呈短卵形或球形，直徑在4～6 μm，具有典型的酵母細胞形態特征，同時可觀察出該菌較明顯的出芽生殖特征，如圖2-c所示。

a-YPD培養基菌落形態;b-雙硫侖培養基菌落形態;c-顯微鏡下細胞形態圖2 菌株CT-20的分離與鑒定Fig.2 Isolation and identification of strain CT-20

2.2.2 菌株ITS rRNA 序列分析

對菌株CT-20的ITS rRNA序列進行擴增，得到了全長為585 bp的基因序列，將該序列上傳至GenBank數據庫中(登錄號為OM373101)，通過BLAST檢索GenBank中的全部核酸序列并進行分析和比對，基于ITS rRNA基因序列構建菌株CT-20的系統發育樹如圖3所示，該菌株與CandidatropicalisMYA-3404序列具有99.65%的相似性，結合菌株的形態特征最終判斷菌株CT-20為熱帶假絲酵母，將其命名為CandidatropicalisLBBE-W1。其產生的乙醛脫氫酶命名為CTALDH(Candidatropicalisaldehyde dehydrogenase)。

圖3 基于ITS rRNA序列的菌株CT-20的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain CT-20 based on ITS rRNA sequences

2.3 ALDH CTALDH的分離純化

2.3.1 硫酸銨分級沉淀

硫酸銨具有溶解度較大、溫度系數偏小、對大多數蛋白活性影響較小等特點，常被用于蛋白質的初步純化。分別測定飽和度在0%～35%，35%～45%，45%～55%，55%～60%，60%～70%，70%～80%之間析出的沉淀中的CTALDH活性和蛋白含量(以粗酶液的酶活力和總蛋白質含量為100%)，確定最佳硫酸銨鹽析范圍。由圖4-a可知，當硫酸銨飽和度在0%～35%和35%～45%時，沉淀中顯示出很高的活性，分別達到粗酶液酶活力的31.7%和33.91%，蛋白質含量分別為粗酶液總蛋白質含量的4%和9%；當硫酸銨飽和度>45%時，沉淀中的CTALDH活力僅為粗酶液酶活力的5%左右，蛋白質含量約為粗酶液總蛋白質含量的24%，因此選擇在0%～45%的硫酸銨飽和度下沉淀出的蛋白質做進一步純化。

a-硫酸銨分級沉淀中酶活力和蛋白質含量與硫酸銨飽和度的關系;b-DEAE-陰離子交換層析SDS-PAGE分析圖4 CTALDH的分離純化Fig.4 Seperation and purification of CTALDH注：M-Marker;泳道1-CTALDH純酶；泳道2-CTALDH粗酶

2.3.2 DEAE-Sephacel陰離子交換層析

將脫鹽處理后的硫酸銨沉淀蛋白上樣于DEAE-Sephacel柱進行陰離子交換層析，收集洗脫液，通過酶活力測定發現ALDH活性主要集中在0.3～0.4 mol/L NaCl梯度洗脫范圍內，將0.4 mol/L NaCl洗脫得到的洗脫液經3 kDa、10 kDa和30 kDa超濾管過濾并濃縮后進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖4-b，泳道1中顯示出一條分子質量約為55 kDa的單一條帶，經計算得出CTALDH的比酶活力為181.17 U/mg，是目前報道的酶活力最高的天然ALDH(IssatchenkiaterricolaXJ-2來源)的5.8倍[11, 24]。

2.4 CTALDH的酶學性質研究

2.4.1 CTALDH的最適反應溫度及熱穩定性

溫度可以通過影響酶蛋白的構象、酶與底物、激活劑和抑制劑的親和力而影響酶的反應速度。微生物來源的ALDH的最適反應溫度一般在35～60 ℃[24]，由圖5-a可知，CTALDH純酶的最適反應溫度為60 ℃，當溫度>80 ℃，活性急劇下降，在90 ℃時幾乎失去了全部活性。由圖5-b可知，當溫度<50 ℃時，該酶具有較好的熱穩定性；當溫度為60 ℃時，僅孵育60 min酶活力便出現明顯降低；當溫度>70 ℃時，酶活力則迅速降低。

a-最適反應溫度;b-熱穩定性圖5 溫度對CTALDH的酶活力和穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of CTALDH

2.4.2 CTALDH的最適反應pH及pH穩定性

pH通過影響酶的構象和底物的帶電狀態而影響酶和底物的親和力，繼而影響酶的催化反應速度。由圖6-a可知，CTALDH純酶對酸性環境高度敏感，當pH<6.0時，酶活力隨著pH值的增加而提高，但均低于50%；當pH值達到9.0時，酶活力最高；當pH>9.0時，酶活力迅速降低。CTALDH在弱堿性環境中活性最高，在強酸性和強堿性環境中迅速失活，這與大部分微生物來源的ALDH的最適反應pH相似。由圖6-b可知，CTALDH在pH 7.0～9.0孵育120 min具有較好的穩定性，ALDH酶活力保留了80%以上；當pH>5.0或pH<9.0時，CTALDH迅速失去活性。

a-最適反應pH;b-pH穩定性圖6 pH對CTALDH的酶活力和穩定性的影響Fig.6 Effect of pH value on activity and stability of CTALDH

2.4.3 金屬離子對CTALDH的影響

金屬離子通過與酶結合可以穩定酶的最佳活性構象，提高與底物的親和力，從而對酶活力起到激活作用，也可能影響到酶的必需基團或活性部位而抑制酶活力[25]。由圖7可知，金屬離子Na+、K+、Ba2+對CTALDH純酶的活性具有明顯促進作用，金屬離子Ni2+、Cu2+和Mn2+對CTALDH活性具有較強烈的抑制作用。

圖7 金屬離子對CTALDH的影響Fig.7 Effect of metal ions on CTALDH

2.4.4 CTALDH的底物特異性

為了考察CTALDH對底物的特異性，選擇7種底物替代乙醛進行研究。結果如圖8所示，CTALDH對甲醛、戊二醛、水楊醛具有較低的活性，對乙醛表現出最高的活性，這一結果表明CTALDH具有較狹窄的底物特異性，乙醛是其最適底物。

圖8 CTALDH的底物特異性Fig.8 Substrate specificity of CTALDH

2.4.5 酶動力學常數的測定

通過酶的動力學研究，可推斷該酶促反應的機理。Vmax值隨酶濃度的差異而改變，米氏常數Km值則是酶的另一種特性常量，它由酶反應的固有特性而決定，并因外部條件如pH、溫度、離子強度等的影響而出現不同變化[20-21]。將純化的CTALDH添加到具有不同底物濃度(0.20～5.0 mmol/L)和不同濃度輔酶NAD+(0.10～2.00 mmol/L)的酶反應液中，可以計算得出CTALDH作用于底物乙醛時的米氏常數Km為13.35 mmol/L、最大速度Vmax為156.36 U/mg；輔酶NAD+的米氏常數Km為1.34 mmol/L，最大速度Vmax為36.91 U/mg。CTALDH的催化常數Kcat為130.3/s，催化效率Kcat/Km為9.76 L/(mmol·s)。

2.5 乙醛降解結果

利用頂空氣相色譜測定CTALDH催化反應后乙醛的殘余量，已知乙醛標準品的出峰時間為6.23 min[5]，由圖9可知，酶反應液中的乙醛峰面積(B)與其對照(A)比較明顯減小，表明菌株C.tropicalisLBBE-W1產生的CTALDH具有良好的乙醛降解能力。通過乙醛標準曲線方程計算出CTALDH對乙醛的降解效率達到95.12%，這與姚正穎[24]在E.coliJM109中表達的I.terricolaXJ-2來源的ALDH乙醛降解能力同處于較高水平。

a-空白對照乙醛峰;b-CTALDH反應后的乙醛峰圖9 乙醛降解圖Fig.9 Acetaldehyde degradation diagram

3 結論

本研究分離到1株酵母菌株CandidatropicalisLBBE-W1，其產生的CTALDH活力為13.26 U/mL，比酶活力為181.17 U/mg。CTALDH的最適反應溫度為60 ℃，最適反應pH為8.0～9.0。該酶在30～50 ℃和pH 5.0～9.0條件下具有較好的穩定性。金屬離子Na+、K+、Ba2+均對CTALDH活性具有促進作用，而Ni2+、Cu2+、Mn2+則對其具有明顯的抑制作用，乙醛是CTALDH的最適底物。CTALDH作用底物乙醛和輔酶NAD+的米氏常數Km分別為13.35 mmol/L和1.34 mmol/L、最大反應速度Vmax分別為156.36 U/mg和36.91 U/mg；CTALDH的催化常數Kcat為130.3/s，催化效率Kcat/Km為9.76 L/(mmol·s)。CTALDH 在2 h內乙醛降解率達到95.12%，在乙醛降解領域具有較大的潛力。