降膽固醇乳酸菌的篩選鑒定及其性能研究

楊晴，王榮春,2*，孫玥，劉小琳，李啟明，馬鶯,2

1(哈爾濱工業大學 醫學與健康學院，黑龍江 哈爾濱，150001)2(哈爾濱工業大學 鄭州研究院，河南 鄭州，450000) 3(四川新希望乳業有限公司，四川 成都，610000)

根據世界衛生組織統計，心血管疾病是造成目前全球人口的主要死因之一，每年有1 700多萬人因此死亡[1]。同時預測心血管疾病將繼續成為人類死亡的主要原因。到2030年，全球近2 300萬人將死于以心臟病、中風為主的心血管疾病[2]。

高脂血癥以總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平升高以及高密度脂蛋白水平降低為特征，是引起動脈粥樣硬化和心血管疾病發展的重要危險因素，嚴重威脅人類的健康[3]。有報告稱，血清膽固醇>5.2 mmol/L，患冠狀動脈心臟疾病的風險則會增加35%，同時，降低血清中膽固醇水平的1%，可以將患心腦血管疾病的風險降低2%～3%[4]。

合理飲食和適量運動有助于降低體內血脂水平，但藥物治療必不可少。盡管他汀類、貝特類、煙酸類等臨床常用藥物是治療高脂血癥最快捷的途徑[5]，但是大多數化學合成的降脂藥物都存在使血清轉氨酶升高、造成肝毒性等不良反應，需長期服用藥物，費用較高，病情易反復[6]。鑒于此，開發安全、可靠、經濟的降血脂功能性食品對降低心血管疾病的患病率尤為重要。目前研究表明，一些發酵乳制品內的乳酸菌具有一定的降血脂作用，研究發現乳酸菌在體內使膽固醇的含量降低1%，心血管疾病的發病率可降低2%～3%[7]。PEREIRA等[8]發現分離自人體腸道中的乳酸菌和雙歧桿菌具有膽固醇同化作用。酸奶和發酵豆奶中的雙歧桿菌也被證實對高血脂癥有緩解作用。我國青藏高原地區傳統發酵牦牛酸乳由于獨特的氣候環境以及傳統的發酵工藝，其中蘊含著豐富的乳酸菌資源，且富有獨特的生理學特性。DING等[10]研究表明，從我國青藏高原傳統發酵牦牛乳中分離出的乳酸菌菌株比其他報道乳制品中分離出的乳酸菌具有更高的降膽固醇活性，這種差異可能是由于在中國青藏高原高脂肪濃度的發酵牦牛奶經過長時間的自然選擇所致。因此，傳統發酵牦牛酸乳成為篩選具有降血脂水平乳酸菌的寶庫。

本研究立足于青藏高原傳統發酵乳制品中分離純化出來的乳酸菌菌株，從中篩選出具有降膽固醇功能的益生乳酸菌，測定其體外膽固醇清除率、生長性能、發酵性能、耐酸耐膽鹽能力、表面疏水性及耐藥性，以期篩選出有開發潛力并可用于功能性發酵乳生產的乳酸菌，為工業化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗中使用的乳酸菌菌株為本實驗室自主分離鑒定得到；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus) CHR Hansen YOFLEX Mild 1.0；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus) CHR Hansen YOFLEX Mild 1.0。原料乳(蛋白含量3.2%，脂肪含量4.0%，總固形物12%)，收購于當地牧場。

膽固醇，Solarbio公司；牛膽鹽，上海Sigma-Aldrich公司；MRS培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；所有分離用有機溶劑，國產分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計、PT-3502C全波長酶標分析儀，北京普天新橋技術有限公司；LD5-2A超凈工作臺，上海一恒科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膽固醇降解率的測定

參照賀珊珊等[11]的方法加以改進。配制200 g/L的膽固醇膠束溶液，溶液中V(吐溫-80)∶V(無水乙醇)=1∶5，80 ℃水浴加熱15 min，用微孔濾膜過濾除菌備用。向MRS肉湯培養基中添加2.0 g/L的牛膽鹽和1.0 g/L的蔗糖脂肪酸酯，混勻后121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。將上述制備的膽固醇膠束溶液加入到MRS培養基中，使培養基中膽固醇的終質量濃度為1 g/L，即為高膽固醇培養基(MRS-CHOL培養基)。將活化后的乳酸菌按1×108CFU/mL的接種量接種至MRS-CHOL培養基中，37 ℃培養24 h后，4 000 r/min離心10 min，取上清液。以膽固醇氧化酶法測定總膽固醇，膽固醇通過膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶的作用最終形成紅色醌化合物。以去除膽固醇的MRS-CHOL培養基為實驗空白對照，分別在96孔板上向酶液中加入1%(體積分數)的待測樣品上清液、實驗空白對照液、未接菌的MRS-CHOL培養基上清液、5.17 mmol/L膽固醇標品和蒸餾水，37 ℃孵育10 min，用酶標儀在510 nm下測定各孔光密度值，每個樣品平行測定3次。

待測菌株對膽固醇的降解率的計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

式中：c(膽固醇)，膽固醇濃度，mmol/L;A1，待測樣品的吸光度；A2，實驗空白對照的吸光度；A3，膽固醇標品的吸光度；A4，蒸餾水的吸光度。

(2)

式中：c0，MRS-CHOL培養基中的膽固醇濃度，mmol/L；c1，待測樣品上清液中的膽固醇濃度，mmol/L。

1.3.2 活菌數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品 微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》的方法檢測培養基和發酵乳中的乳酸菌活菌數，每個樣本平行測定3次。

1.3.3 乳酸菌耐酸性測定

參照HUANG等[12]的方法并進行微調。制備含8 g/L胃蛋白酶的無菌PBS并將其pH分別調至4.0、3.5、2.5、2.0、1.5。乳酸菌活化3代以上，以3%(體積分數，下同)接種量分別接種至不同pH梯度的酸性環境中37 ℃靜置培養3 h，測定乳酸菌活菌數。每個樣品平行測定3次，菌株存活率的計算如公式(3)所示。

(3)

式中：a，初始活菌數，CFU/mL；b，處理后活菌數，CFU/mL。

1.3.4 乳酸菌膽鹽耐受性測定

參照HUANG等[12]的方法并進行微調。制備含1 g/L胰蛋白酶的無菌PBS(pH 8.0)，并分別添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的牛膽鹽。菌種活化3代以上，以3%接種量分別接種至不同膽鹽濃度的環境中37 ℃靜置培養4 h，按1.3.2的方法測定乳酸菌活菌數。每個樣品平行測定3次，菌株存活率的計算同1.3.3公式(3)。

1.3.5 乳酸菌表面疏水性測定

參照SADISHKUMAR等[13]的方法并進行微調。將乳酸菌發酵液在4 ℃、10 000 r/min離心3 min，棄去上清液，收集菌體沉淀。用無菌PBS(pH=7.4)洗滌菌體沉淀2次，重懸于無菌PBS中，調節菌發酵液的光密度值(OD600)為(0.8±0.05)。取2 mL菌發酵液與2 mL二甲苯混勻，室溫靜置30 min，分離兩相。吸取下層水相，在OD600下測定光密度值。每個樣品平行測定3次，菌體表面疏水率(cell-surface hydrophobicity, CSH)的計算如公式(5)所示。

(5)

式中：A0，菌發酵液的吸光度；A1，下層水相的吸光度。

1.3.6 乳酸菌耐藥性測定

參照董春陽[14]的方法并進行微調。用生理鹽水調節乳酸菌MRS發酵液的光密度值(OD600)為(0.1±0.02)。將菌液均勻涂布于MRS固體培養基表面，分區編號并將抗生素紙片(干燥)貼到涂布后的培養基表面，37 ℃下倒置培養24～48 h。用精確度為1 mm的直尺測量抑菌圈的直徑并記錄。依據各類抗生素作用機制的不同，分別選取青霉素類的青霉素、頭孢類的頭孢唑啉、氨基糖苷類的慶大霉素、大環內酯類的四環素、酰胺醇類的氯霉素、喹諾酮類的氧氟沙星這6種常見的抗生素。參照CLSI M100《抗菌藥物敏感性試驗執行標準2017》，判讀菌株對抗生素的耐藥性。

2 結果與分析

2.1 具有降膽固醇能力乳酸菌的篩選及鑒定

從青海收集100多份自然發酵的牦牛乳(包括曲拉、發酵乳、發酵奶油、鮮牦牛乳)，從中分離出乳酸菌200株。臨床試驗證明了L.rhamnosusgrx10(保藏編號為CGMCC No:2526)具有良好的降血脂能力[15]。篩選出21株菌，其體外膽固醇清除率均超過選定標準菌株L.rhamnosusgrx10(63.14%)，其中有6株菌的膽固醇清除率>70%。分析發現，YD-4膽固醇清除率顯著性(P<0.05)高于Q3-7及之后17株菌，G150～G050間的9株菌膽固醇清除率差異均不顯著(P>0.05)。對清除率較高的6株菌YD-4[(74.21%±1.58)%]、G150[(72.96±2.37)%]、Q2-3[(72.54±1.64)%]、G055[(71.96±1.22)%]、Q3-7[(70.69±2.09)%]、Q1-1[(70.475±1.14)%]進行菌種鑒定。

將16S rDNA基因序列分析技術用于細菌的系統分類及鑒定，可以鑒定出篩選菌株與已知序列菌株之間的遠近關系[16]。利用BLAST在GenBank核酸序列數據庫中對篩選出的6株菌株的16S rDNA基因序列進行檢索比對，對鑒定后的菌株重新命名，并從GenBank數據庫中選取9種已收錄的外源菌株基因序列構建系統發育樹，結果如表2和圖1所示。

圖1 Neighbor-Joining法構建菌株系統發育樹Fig.1 Construction of phylogenetic tree of strains by Neighbor-Joining method

由表2可知，LF-HF04與Lactobacillusfermentumstrain CIP 102980的同源性達到100%，LD-G150與Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus3286的序列相似度最高達到100%，LF-Q2-3與Lactobacillusfermentumstrain CIP 102980的同源性為99.93%，LB-G055與LactobacillusbuchneriCQ95-2-1-1-2的相似度為100%，LP-Q3-7與LactobacillusplantarumMG5355的序列相似度為100%，ST-Q1-1與Streptococussthermophilusstrain 3290的同源性為100%。這6株菌與GenBank數據庫中已知乳酸菌的16S rDNA D1/D2區域序列高于99%的同源性，鑒定結果有效[17]。

因為本研究的目的為篩選可食用益生菌菌株，根據《可用于食品的益生菌菌種名單》，Lactobacillusbuchneri-G055不在名單之內，將其刪除，選擇剩余的5株菌株進行進一步的菌種性能實驗。其中發酵乳桿菌LF-HF04的膽固醇降解率最高可達74.21%。

從圖1可知，所篩選菌株的親緣關系與BLAST序列比對結果一致，LP-Q2-3、LF-HF04均為發酵乳桿菌，LP-Q3-7為植物乳桿菌，LD-G150為保加利亞乳桿菌，ST-Q1-1為嗜熱鏈球菌。

2.2 篩選乳酸菌的性能研究

具有優良性能的乳酸菌需要滿足實際生產中對于乳酸菌生長代謝特性多方面的需要，且適應胃腸道的低pH環境、高滲透壓的膽鹽環境等特性是益生菌成功定植并發揮益生功能的前提[18]。因此，本實驗以菌株生長能力、耐酸性、膽鹽耐受力、抗藥性及細胞表面疏水性作為評價指標，進行潛在益生性能的篩選研究，并用凝乳試驗初步判斷菌株的發酵能力，對從發酵乳制品中篩選能用于實際生產需要的具有降血脂功能的乳酸菌具有重要意義。

2.2.1 乳酸菌的生長性能

篩選出的5株菌在MRS培養基中的生長曲線如圖2所示，5株乳酸菌在MRS液體培養基中的生長性能良好，生長曲線均為規則的S型曲線。在測定時間24 h內經歷了適應期、對數生長期和穩定期。5種菌株進入對數生長期的時間相近，約為1.5 h；LF-HF04、LD-G150、Q1-1進入穩定期的時間約為7.5 h，LF-Q2-3、LP-Q3-7進入穩定期的時間約為8.5 h；4株菌株在穩定期均持續較長時間。進入穩定期后可達到的最大活菌量：LF-HF04>LF-Q2-3>LP-Q3-7>LD-G150>ST-Q1-1，繪制標準曲線計算得LF-HF04在24 h時的活菌數可達7.22×108CFU/mL。

圖2 乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of lactic acid bacteria

2.2.2 乳酸菌的發酵性能

產酸能力是乳酸菌發酵過程中的重要性能，乳酸菌產酸的快慢影響酸奶的組織結構和品質[19]。根據國標GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中對發酵乳的酸度要求(>70 °T)，將篩選出的5株乳酸菌在巴氏殺菌牛乳中發酵，測定酸度達到70 °T所用時間，結果如圖3所示。

圖3 乳酸菌的產酸性能Fig.3 Acid production performance of lactic acid bacteria

根據圖3可知，2株發酵乳桿菌LF-HF04和LF-Q2-3的發酵性能最好，分別在11.5 和13.5 h時可使發酵乳的酸度達到70 °T。有研究表明，發酵乳桿菌為發酵乳制品中的優勢菌株，具有良好的發酵能力[20-21]。其余3株乳酸菌均需要20 h左右其發酵乳酸度才能達到70 °T，植物乳桿菌LP-Q3-7的發酵乳在24.5 h酸度達到70 °T,所用時間最長。這可能是因為植物乳桿菌為植物源乳酸菌，在乳基中的生長性能和產酸能力較差，使得發酵時間較長[22]。由于這5株乳酸菌的單菌發酵時間較長，工廠生產時成本較高，且易造成產品污染，在實際運用時需要采用商業菌種混合發酵，以滿足生產中對活菌總數和發酵周期等的需求。

2.2.3 菌株的耐酸和膽鹽耐受能力

益生菌作為正常腸道菌群的一員，在攝入后從口腔到腸道傳送的過程中，必須克服口腔、胃部(高酸性、胃蛋白酶)和消化道上端(膽鹽、胰酶)等部位的不良環境，才能對宿主發揮有益功效。因此，良好的人體胃腸道環境抗逆能力已經成為評價益生菌的重要性質和指標，在一定程度上反映乳酸菌在真實胃腸道環境中的實際存活能力。同時多數研究表明，在膽鹽存在的條件下，乳酸菌才能更好地吸收膽固醇，所以篩選的降膽固醇乳酸菌必須具有對膽鹽的耐受性[23]。

5株菌分別在pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0的環境中處理3 h的生長和存活情況如圖4-a所示，牛膽鹽濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的環境中處理4 h后的生長和存活狀況，耐膽鹽實驗結果如圖4-b所示。

a-耐酸性；b-膽鹽耐受性圖4 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力Fig.4 Acid and bile salt tolerance of lactic acid bacteria

從圖4-a中可知，在pH<2.0時，所有菌株均不能存活，在pH為2.0～4.0時，菌株存活率與環境pH的增加呈正相關。在pH 4.0的環境中處理3 h后，5株菌存活率均大于70%，LF-HF04的存活率最高為97.65%，顯著高于其他4株菌(P<0.05)。在pH 2.5時，LD-G150和LP-Q3-7的存活率下降至低于20%，其他3株均保持在45%以上的存活率，LF-Q2-3存活率最高為56.28%，顯著高于其他4株菌(P<0.05)。

從圖4-b可知，乳酸菌的存活率與環境中膽鹽含量呈負相關。1 g/L的膽鹽處理4 h后，LF-HF04、LD-G150及LF-Q2-3的存活率在90%以上，LP-Q3-7的存活率最低為64.84%。相較于其他4株乳酸菌，LP-Q3-7對膽鹽的耐受性最差，整體存活率最低，在含有3 g/L牛膽鹽的人工腸液中處理4 h后，存活率已降到了28.38%，其他4株菌的存活率均保持在50%以上。在膽鹽5 g/L時，5株乳酸菌均表現出不同程度的耐受性：LF-HF04(53%)>ST-Q1-1(42.27%)>LF-Q2-3(28.18%)>LD-G150(18.67%)>LP-Q3-7(17.03%)，LF-HF04、ST-Q1-1、LF-Q2-3差異顯著(P<0.05)，LD-G150和LP-Q3-7差異不顯著(P>0.05)。

正常人的胃液pH 1.5～4.5，其pH值因食物結構不同而波動。通常人體胃液pH≈3.0，空腹和食用酸性食品可達1.5，食用堿性食物可達4～5，且食物(尤其是流體)通過胃的時間相對較短，一般1～2 h[24]。LF-Q2-3、LF-HF04和ST-Q1-1具備相對好的耐酸性，能夠保證在進食非酸性食品時，有一定數量的活菌體順利通過胃酸環境到達腸道內。通過胃液后存活的菌株將在小腸的上部遇到膽鹽，故對膽鹽具有抗性是它能夠在腸道中生長、存活、發揮功效的一個重要指標[25]。MARTEAU等[26]認為人體內正常的膽鹽濃度為0.3%～0.5%，同時食物通過腸道的時間一般為4～16 h。LF-HF04、LF-Q2-3、LD-G150和ST-Q1-1均具有較強的耐膽鹽能力。綜合而言，LF-HF04菌株對酸性環境和膽鹽具有良好的耐受性，預測在實際胃和腸道上端環境中能順利通過并存活下來。

2.2.4 乳酸菌表面疏水性

乳酸菌在胃腸道中的黏附和定植是其在人體內表現益生功效的先決條件。有研究證明細菌表面疏水性與其對腸道上皮細胞的黏附力存在一定的正相關性[27-28]。菌體表面疏水性是影響乳酸菌黏附性的內在因素，被廣泛地作為評價乳酸菌黏附性能的重要指標。采用碳烴化合物粘著法測定不同菌株的疏水性差異，5株菌的表面疏水性如圖5所示。

圖5 乳酸菌的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of lactic acid bacteria

當CSH>50%時為高度疏水，當20%0.05)，且顯著低于LP-Q3-7菌株(P<0.05)，后3株菌均判定為非疏水菌株。

2.2.5 對抗生素的耐藥性

乳酸菌的耐藥性大致可分為2種，即天然性耐藥和獲得性耐藥。大多數乳酸菌對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、糖肽類以及磺胺類等抗生素具有天然耐藥性，天然性耐藥基因很少傳播。然而，由于畜牧及水產養殖行業中抗生素的濫用導致獲得性耐藥基因在細菌中出現并傳播，乳酸菌中的獲得性耐藥基因可能會轉移到人體胃腸道的微生物菌群甚至是致病菌中，存在潛在安全隱患[29-30]。因此，篩查乳酸菌的抗生素耐藥性并評估其安全性具有重要意義。

本實驗從6類常用抗生素中分別選擇了具有代表性的6種抗生素，對所篩選的5株乳酸菌進行了紙片擴散法藥敏試驗，以期為篩選出的乳酸菌被用于功能性食品生產的安全性提供理論依據。由表3可知，ST-Q1-1對多種抗生素具有耐藥性，其余4株菌對絕大多數抗生素敏感。分析認為ST-Q1-1多重耐藥性的原因：一方面，可能是抗生素的濫用導致生牛乳中抗生素的殘留，使乳酸菌從外界獲得耐藥基因；另一方面可能是由于抗生素的選擇性壓力，使乳酸菌發生基因突變產生耐藥基因。所有受試菌株均對慶大霉素敏感，這可能與慶大霉素能很好地通過細菌的細胞膜有關[31-32]。有3株菌對氧氟沙星耐藥，研究指出乳酸菌對氟哇諾酮類抗生素有天然耐藥性[33]。LF-HF04的抑菌圈直徑整體上大于另外4株受試菌，且對這6種抗生素均表現為敏感，初步判斷其不具有可傳播的耐藥基因。

表3 抑菌圈直徑及抗性結果 單位：mm

3 結論與討論

本研究從青海發酵牦牛乳中篩選出200株乳酸菌，有21株菌株膽固醇清除率高于選定標準菌株grx10(63.14%)，其中LF-HF04的膽固醇清除率最高(74.21%)。所篩5株菌株生長性能良好，在MRS培養基中培養24 h，菌體濃度均穩定在108CFU/mL；使發酵乳的酸度達到70 °T所用時間范圍為11.5～24.5 h，其中LF-HF04和LF-Q2-3在乳中的產酸性能更好，分別在發酵11.5和13.5 h時酸度達到70 °T。5株菌株在pH為3.0的環境下處理3 h均能存活，說明這5株菌能在進食非酸性食品時通過胃液進入小腸，其中LF-HF04和LF-Q2-3的耐酸性更好；5株菌株在3.0～5.0 g/L膽鹽下處理4 h后均能存活，且活菌數均達到106CFU/mL，說明5株菌株能夠通過小腸存活下來，其中LF-HF04和ST-Q1-1對膽鹽的耐受性更強。5株菌株的表面疏水性范圍在5.09%～42.01%，菌株LF-Q2-3和LF-HF04疏水性較強，分別為42.01%和30.37%。5株菌株中ST-Q1-1具有多重耐藥性，LF-HF04的抑菌圈直徑整體上大于另外4株受試菌，且對6類常用抗生素敏感，初步判斷其安全性較好。

綜上所述，發酵乳桿菌LF-HF04的各項性能優良，可作為開發降膽固醇功能性乳制品和微生態制劑的潛力菌株，有廣闊的應用前景。