酵母浸出物對嗜酸乳桿菌菌體形態及凍干存活率的影響

伍業旭，熊昌武，朱亞軍，覃先武

(酵母功能湖北省重點實驗室(安琪酵母股份有限公司)，湖北 宜昌，443003)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是革蘭氏陽性無芽孢桿菌，呈鏈桿狀或球桿狀，是人體和動物腸道內的重要有益微生物，與人類和動物腸道健康息息相關，也是目前人類膳食補充劑、乳品飲料及飼料添加劑中常見的菌種之一[1-2]。國內乳酸菌的生產企業主要關注發酵過程中活菌數和凍干存活率，因此大多數研發工作者主要圍繞著原料的篩選以及工藝的改進來達到提升活菌數和凍干存活率的目的[3-4]，而很少關注到原料、工藝對微生物的菌體形態等微觀生理狀態的影響所導致的最終活菌數、凍干存活率差異。目前已有研究關注到菌體形態對同等培養條件下的微生物能達到的最高活菌數、凍干存活率以及貨架期存在影響[5]，但對于菌體形態的差異具體受到哪些因素的影響研究相對較少，其中報道的乳酸菌菌體形態的差異主要集中在培養過程的理化條件如pH[6]、溫度[7]等的影響。但在研究中發現，不同的營養對乳酸菌菌體形態也會產生很大的影響。目前乳酸菌的生產中，國內企業一般會采用酵母浸出物、蛋白胨(大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨)、牛肉浸膏等有機氮源混合使用，而國外生產企業如科漢森、雀巢、丹尼斯克則主要以酵母浸出物為唯一的有機氮源，酵母浸出物相對于其他動物源有機氮源具有來源穩定、生物安全的優點。因此本研究以酵母浸出物作為培養基中的唯一氮源，研究酵母浸出物中對嗜酸乳桿菌菌體形態產生影響的關鍵營養組分，以期在乳酸菌的工業化生產中，通過營養條件干預菌體形態，從而提升菌體穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

嗜酸乳桿菌，安琪酵母股份有限公司蛋白質營養與調味技術中心保存。

1.1.2 試劑

MgSO4、KH2PO4、MnSO4、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、葡萄糖、瓊脂粉，國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸出物FM902、FM803、FM502、FM860、FM808，安琪酵母股份有限公司提供；脫脂乳粉，內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1C型雙人單面超凈工作臺，蘇州進化設備有限公司；FiveEasy Plus FP20型pH計，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；HWS-350型生化培養箱，上海比朗儀器有限公司；Sp-750型分光光度計，上海光譜儀器有限公司；GI54DWS型滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；CX43型生物顯微鏡/MII Image View4.11.19051拍照系統，奧林巴斯株式會社；BIOTECH-3 JG-6型離位滅菌玻璃多聯發酵罐，上海保興生物設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)液體培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母浸出物5、乙酸鈉5、K2HPO42、檸檬酸氫二銨2、MgSO40.58、MnSO40.25、吐溫-80 1 mL，調節pH至6.2～6.4。

氮源影響分析培養基(g/L)：葡萄糖20、有機氮源20、吐溫-80 3 mL、MgSO40.1、MnSO40.075、K2HPO42、檸檬酸氫二銨2，調節pH至6.2～6.4，其中有機氮源為不同型號的酵母浸出物，具體包括酵母浸出物FM902、FM803、FM502、FM860、FM808。

RNA、核苷酸對嗜酸乳桿菌形態影響的分析培養基(g/L)：葡萄糖20、酵母浸出物FM902 20、吐溫-80 3 mL、MgSO40.1、MnSO40.075、K2HPO42、檸檬酸氫二銨2，實驗組分別添加RNA水解物0.8、鳥嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate，GMP)0.4、腺嘌呤核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)0.4、尿嘧啶核苷酸(uridine monophosphate，UMP)0.4、肌苷酸(inosine monphosphate，IMP)0.4、胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate，CMP)0.4，混合核苷酸組添加IMP 0.3、CMP 0.3、AMP 0.2、UMP 0.1、GMP 0.3，調節pH至6.2～6.4。

1.3.2 菌株的活化與培養

菌種的活化：用接種環從保菌管中蘸取1環，在MRS固體培養基上劃線，平板置于37 ℃培養36～48 h，挑取單菌落，接入15 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養12 h。以2%(體積分數)接種到新鮮的MRS培養基中，培養12 h得到活化的種子液。

嗜酸乳桿菌的擴大培養：將活化好的種子液按5%(體積分數)的接種量，轉接于裝有氮源影響分析培養基的3 L發酵罐(裝液量2 L)中，以流加質量分數10% NaOH的方式，恒定pH 5.0培養，培養至發酵液中葡萄糖質量濃度低于2 g/L，結束培養。

1.3.3 嗜酸乳桿菌的菌體形態分析

嗜酸乳桿菌擴大培養結束后取1.5 mL發酵液于2 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，收集菌體，菌體用生理鹽水懸浮洗滌1～2次，取適量菌懸液于載玻片固定，染色后用顯微鏡油鏡觀察，利用拍照系統進行拍照記錄并統一添加2 μm的參照標尺，對比菌體長度差異。

1.3.4 生物量與活菌數的測定

菌體密度的測定：用紫外分光光度計在600 nm下測定發酵液的吸光度值，若吸光度值大于0.8，需要將發酵液進行稀釋，使稀釋后菌液的吸光值在0.2～0.8。

活菌數的測定：采用平板計數法。

1.3.5 不同型號酵母浸出物的營養特性分析

蛋白質含量測定：參照GB/T 20886.2—2021《酵母產品質量要求 第2部分: 酵母加工制品》計算總氮，總氮乘以換算系數即為蛋白質含量。

游離氨基酸和水解氨基酸的測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》采用氨基酸分析儀測定樣品中游離氨基酸，柱后茚三酮衍生法。采用氨基酸分析儀測定樣品中鹽酸水解后的游離氨基酸。

肽分子質量分布的測定：采用高效液相色譜法測定，采用排阻柱，依據樣品組分中物質相對分子質量進行分離，在紫外吸收波長220 nm條件下檢測。

RNA的測定：稱取0.06～0.15 g酵母浸出物或者3 g發酵液于離心管中，加入8 mL，0.25 mol/L HClO4(冷)到離心管中，4 ℃水浴15 min。4 000 r/min離心10 min，輕輕倒出浮于表面的物質后加入5 mL 0.5 mol/L的HClO4振蕩混勻，70 ℃水浴15 min，每隔3～4 min振蕩1次，4 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液，用蒸餾水定容至100 mL。使用紫外分光光度計在260 nm測定吸光值，蒸餾水作為空白對照。RNA含量按照公式(1)計算：

(1)

式中：R，RNA含量，%；A，吸光值；n，稀釋倍數；m，樣品質量，mg；w，樣品固形物質量分數，%。

核苷酸的測定：稱取樣品0.5～1 g(精確至0.000 1 g)，加水溶解，移入100 mL容量瓶中，超聲波溶解，并用水定容至刻度。根據樣品中的核苷酸含量對溶液進行適當的稀釋(稀釋倍數n)。用0.22 μm水相微孔膜過濾，濾液備用。如果用0.22 μm水相微孔膜過濾后樣品仍然渾濁，將樣品在4 000～10 000 r/min離心10 min后再過濾，進行超高液相色譜檢測，具體條件如下：色譜柱(Waters Acquity H-Class UPLC),流動相B，10 mmol/L NaH2PO4；C，質量分數0.1%磷酸水溶液；D，乙腈;柱溫50 ℃;進樣量1 μL;檢測波長3D掃描，254 nm;梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Process conditions of gradient elution

結果與計算：將標準系列和樣品溶液分別進樣，進樣量為1 μL，根據標準品的保留時間定性樣品中的 CMP、UMP、GMP、IMP、AMP的色譜峰。根據樣品的峰面積，以外標法計算各組分的含量。CMP、UMP、GMP、IMP、AMP含量按照公式(2)計算：

(2)

式中：X，樣品中CMP、UMP、GMP、IMP、AMP的含量，%；ρ，由標準曲線獲得的進樣溶液中CMP、UMP、GMP、IMP、AMP的含量，μg/mL；V，定容體積，mL；n，稀釋倍數；m，樣品質量，g。

1.3.6 菌株對不同核酸類物質的消耗

在進行嗜酸乳桿菌的擴大培養時，完成接種后馬上取樣300 mL，將發酵液于10 000 r/min離心10 min，然后將上清液置于旋轉蒸發儀濃縮至30～50 mL，利用快速水分測定儀進行水分測定，并按照RNA、核苷酸含量測定方法進行相關指標的測定。擴大培養結束后，按照同樣的方法進行取樣、離心，收集上清液進行濃縮，對濃縮液進行水分、RNA、核苷酸含量測定。培養前與培養后的RNA、核苷酸含量差值即為核酸類物質的消耗量。

1.3.7 RNA水解物的制備與檢測

RNA充分溶解后調pH至5.0，加核酸酶酶解制備RNA水解物。

1.3.8 菌體形態對凍干存活率的影響

擴大培養結束后，離心發酵液，收集菌體，菌體量與凍干保護劑(質量分數10%滅菌脫脂乳)按照質量比1∶10混合，乳化后準確稱取1 g稀釋至一定的濃度進行活菌計數，同時準確稱取5 g樣品于西林瓶中進行凍干，每個樣品3個重復。凍干結束后使用一定量的生理鹽水對凍干粉進行復溶，并稀釋至一定濃度進行活菌計數。統計凍干前后活菌總數，凍干存活率按照公式(3)計算：

(3)

式中：RS，凍干存活率，%；C1，凍干前每1 g乳化液活菌數總和，CFU；C2，每5 g乳化液凍干后活菌數總和，CFU。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3次，實驗結果表示為平均值±標準偏差，實驗數據采用Origin 9.0繪圖，采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素ANOVA判斷(鄧肯檢驗)，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同酵母浸出物對菌體形態的影響

嗜酸乳桿菌在使用不同酵母浸出物培養后，利用顯微鏡放大1 000倍(物鏡100×，目鏡10×)并添加2 μm標尺，進行觀察記錄。由圖1的鏡檢結果可以看出，嗜酸乳桿菌在使用不同酵母浸出物制備的培養基和相同條件下進行培養，嗜酸乳桿菌菌體的形態呈現出了顯著差異。其中，以酵母浸出物FM502為氮源的菌體最短，菌體長度均一且基本在2 μm左右，而其他酵母浸出物培養的嗜酸乳桿菌菌體形態均較長，最高長度可達6～8 μm。根據相關文獻報道，菌體的形態一方面受到生長條件的影響[8]，另一方面受到培養基營養條件的影響[9]，本次實驗整個培養過程中pH值、初始糖濃度、滲透壓都維持在相當的水平，因此造成形態不同的可能原因是酵母浸出物的營養差異導致嗜酸乳桿菌的生理代謝發生了改變。雖然酵母浸出物的原料均來源于面包酵母，但不同酵母培養基及培養條件會造成面包酵母蛋白質含量、生長因子、核酸類物質的差異，最終導致該原料制備的酵母浸出物營養特性不同，造成微生物對其營養吸收和利用的差異，進而引起菌體表觀形態的改變。

a-FM902；b-FM803；c-FM860；d-FM502；e-FM808圖1 不同酵母浸出物對嗜酸乳桿菌形態的影響Fig.1 Effect of different yeast extracts on morphology of L.acidophilus

2.2 不同的酵母浸出物營養成分分析

有機氮源一方面提供微生物所需要的氮元素[10]，另一方面為微生物提供各類生長因子[11]。表2結果顯示，不同型號的酵母浸出物在蛋白質、蛋白分子質量分布、游離氨酸、RNA以及核苷酸上都存在一定的差異，其中FM902蛋白質含量最高，FM502核苷酸含量最高，FM803游離氨基酸含量最高。2.1小節中不同型號酵母浸出物培養的嗜酸乳桿菌出現的形態差異可能與酵母浸出物的上述營養特性存在密切關系。本研究中酵母浸出物是嗜酸乳桿菌培養的唯一氮源，一方面需要滿足嗜酸乳桿菌蛋白合成所需要氮素需求[12]，另一方面也要為菌體遺傳物質合成提供所需核酸類物質[13]，有文獻報道嗜酸乳桿菌的合成代謝較弱[14]，因此有機氮源中特定分子質量的蛋白類物質、游離氨基酸、核酸、核苷酸等物質的含量差異都有可能是影響嗜酸乳桿菌菌體形態的重要因素。

表2 不同酵母浸出物的營養組分含量 單位：g/100 g

2.3 嗜酸乳桿菌培養前后培養基中主要營養物質的變化分析

從氮源的吸收方面分析，影響微生物對有機氮源利用的主要因素包括分子質量分布、水解度、游離氨基酸含量等[15]。對比表3中培養前后發酵液中蛋白質、游離氨基酸含量變化發現，嗜酸乳桿菌對培養基中的蛋白質、游離氨基酸的利用率均只有30%左右，說明不同型號酵母浸出物均能夠滿足嗜酸乳桿菌的氮源需求，不同型號酵母浸出物中的蛋白質、游離氨基酸的差異可能不是造成嗜酸乳桿菌菌體形態發生重大變化的主要原因。

從表4中的分子質量分布可以看出，不同型號的酵母浸出物含有的多肽有細微差別，但從嗜酸乳桿菌培養前后培養基中蛋白質分子質量的構成對比發現，400～1 000 Da的多肽變化最為顯著，但該分子質量段的小肽在不同型號酵母浸出物中的含量相當，因此2.1小節中菌體形態的差異可能與酵母浸出物中分子質量的分布也沒有顯著關系。

表3 培養基中蛋白質與氨基酸的消耗 單位：g/L

表4 培養基中不同分子質量的多肽消耗Table 4 Consumption of peptides of different molecular weights in the culture medium by L.acidophilus

通過對發酵前后培養基中核苷酸含量的檢測，發現培養過程中不同酵母浸出物所提供的核苷酸都發生了大量的消耗。由圖2可以看出，鳥嘌呤單核苷酸的消耗量最大，消耗比例>70%；其次為IMP，消耗比例在50%左右，而尿嘧啶單核苷酸和胞嘧啶單核苷酸的消耗量相對較低，消耗比例在20%左右。表2結果表明，酵母浸出物FM502的游離核苷酸含量(IMP、GMP、CMP、UMP、AMP)總和達到了4.5%，而其他型號的酵母浸出物核苷酸含量不足0.5%。由表5可知，以酵母浸出物FM502為氮源制備的培養基在培養嗜酸乳桿菌后其核苷酸消耗總量為3 567 mg/L，其他型號酵母浸出物所能提供的單核苷酸總和遠低于該值。另外從核苷酸的消耗比例可以看出GMP、IMP等的利用率遠高于蛋白質的利用率，由此可推斷造成嗜酸乳桿菌的形態差異主要原因可能是由于酵母浸出物中核酸類物質含量影響了微生物的遺傳物質合成與正常分裂，導致菌體形態差異，而蛋白類組分對菌體形態沒有顯著影響。有文獻曾提到嗜酸乳桿菌屬于嚴苛營養型微生物[16]，其自生合成代謝能力較弱，對培養基的營養要求高，一些營養的缺乏可導致菌體狀態的變化[17]。因此從本研究結果來看有機氮源中核苷酸的含量可能通過影響嗜酸乳桿菌的正常分裂，進而造成嗜酸乳桿菌菌體形態過長，但是具體哪些核苷酸或核酸類物質起主要作用有待進一步研究。

表5 培養基中核苷酸的消耗 單位：mg/L

圖2 不同酵母浸出物制備培養基中的核苷酸消耗比例Fig.2 Nucleotides consumption rate in the culture media made with different yeast extracts

2.4 不同核苷酸及RNA水解物對嗜酸乳桿菌形態的影響

為了進一步驗證造成菌體形態差異是受到何種核苷酸的影響，分別向FM902中添加一定量的單核苷酸(AMP、CMP、IMP、GMP、UMP)以及RNA水解物進行嗜酸乳桿菌的培養，菌體形態利用顯微鏡放大1 000倍進行觀察記錄。

由圖3結果可以看出，向FM902添加核酸類物質后，嗜酸乳桿菌的菌體形態相對于未添加的均發生了變化。相同培養條件下，添加RNA水解物后菌體長度縮短最為明顯，而添加單一的核苷酸雖能夠在一定程度上使菌體長度變短，但與RNA水解物的相比存在較大的差距。另外，添加單核苷酸的混合物相比添加單一的核苷酸菌體的長度略短，此現象說明嗜酸乳桿菌的菌體形態不僅受到某種單一核苷酸的影響，更受到多種核苷酸的協同作用影響。RNA水解物的作用效果相對于添加單核苷酸化合物和5種核苷酸混合物更顯著，可能主要是由于在RNA水解物的制備過程中，核酸酶的作用具有一定隨機性，導致RNA水解物是一種復雜的混合物，一方面含有部分未經完全水解的RNA片段，另外也含有單核苷酸、堿基、核糖等組分[18]，這些物質都是微生物遺傳物質合成的前體物質[19]。由于嗜酸乳桿菌缺乏從頭合成相關核酸類物質的能力[14]，RNA水解物能為嗜酸乳桿菌提供更豐富的基礎物質用于遺傳物質合成，從而促進菌體的快速分裂，呈現出菌體短小的形態。而嗜酸乳桿菌在未添加核酸類物質的情況下生長，可能由于其菌體DNA的合成不足[20]，使菌體的分裂和生長不協調[21]，導致出現菌體過長、不均一的狀態。

a-AMP；b-CMP；c-IMP；d-GMP；e-UMP；f-核苷酸混合物；g-RNA水解物圖3 不同核苷酸對嗜酸乳桿菌形態的影響Fig.3 Effect of different nucleotides on morphology of L.acidophilus

2.5 菌體大小對凍干存活率的影響

為了驗證菌體大小是否有助于后期的凍干存活力提升，收集使用FM902和FM902+RNA水解物培養的2種不同形態的嗜酸乳桿菌菌泥，進行凍干存活率測試，結果如表6所示。菌體短小的嗜酸乳桿菌凍干存活率明顯高于較長的菌體，該結論與其他菌株的相關報道一致[22]。對于本研究的嗜酸乳桿菌，RNA水解物可以使嗜酸乳桿菌的菌體變短而達到提升凍干存活率的效果，該結果對于嗜酸乳桿菌的工業生產具有一定的參考意義。

表6 RNA水解物對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響Table 6 Effect of RNA hydrolysate on freeze-drying survival rate of L. acidophilus

3 結論

酵母浸出物中的核酸類物質是影響嗜酸乳桿菌的菌體形成的關鍵營養組分。不同單核苷酸、核苷酸的混合物、RNA水解物均有助于縮短嗜酸乳桿菌菌體長度，其中RNA水解物的效果最顯著。核酸類物質通過改變嗜酸乳桿菌的形態，有助于提升嗜酸乳桿菌的凍干存活率。