黃刺多糖工藝優化及其對過氧化氫損傷的胰島β細胞的保護作用

鄧永蓉，韓麗娟,2*，岳慶明，漆瑩，馬娜娜，趙玉欣

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016)2(省部共建三江源生態與高原農業國家重點實驗室(青海大學)，青海 西寧，810016)

黃刺，學名直穗小檗(BerberidasystachyaM.)，是青藏高原特色的藥食同源漿果[1]。青海省是小檗屬植物的重要分布區，該植物資源量十分豐富[2]。黃刺果實具有多種活性成分，如植物甾醇、有機酸、多糖和多酚等[3]。迄今為止，市面上已有黃刺加工成的果汁、果粉及保健食品等[4]。多年以來，國內外對于小檗屬的研究大多集中在小檗堿上[5]，而目前研究發現黃刺多糖也是一種重要的活性物質，具有良好的體外抗氧化活性[6]、降血糖活性[7]及調節腸道微生物等作用[3]。然而目前對于黃刺僅局限于粗多糖的提取和生物活性的初步研究，因此后續可從分子水平進一步闡述多糖抗氧化、降血糖活性及其機制。

糖尿病是一種復雜的代謝紊亂疾病，嚴重危害人們身體健康[8]。多種天然植物多糖被證實具有降血糖的功效[9]，對于多糖降血糖分子機制的研究主要是從抑制胰島細胞凋亡、降低胰島素抵抗[10]、提高抗氧化應激能力、調節相關信號通路、調節腸道菌群[11-12]等方面發揮作用。氧化應激是指體內過多的活性氧與抗氧化物質同時存在的一種不平衡的狀態[13]。機體在氧化應激狀態下，體內抗氧化酶類活性逐漸降低，體內生成過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會導致胰島β細胞的凋亡[14]。H2O2作為一種化學誘導劑，是研究細胞氧化損傷的重要工具[15]。楊艷等[16]利用250 μmol/L H2O2誘導RIN-m5F細胞18 h建立氧化應激模型，MAHESHWARI等[17]通過H2O2體外誘導睪丸精細胞凋亡模型研究其作用途徑。

目前植物多糖提取方法較為成熟，其中超聲波輔助酶解法由于提取效率較高而常被采用，本實驗采用纖維素酶輔助超聲波法對黃刺果實多糖的提取工藝進行優化，確立提取多糖的最佳工藝條件，以H2O2誘導RIN-m5F細胞建立氧化損傷模型，并使用不同濃度的黃刺粗多糖(Berberidasystachyapolysaccharides，BDPs)干預模型細胞，通過CCK-8法檢測細胞存活率、ROS水平測定、抗氧化酶活及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量探究BDPs對H2O2誘導胰島β細胞氧化損傷的保護作用，對研究黃刺多糖活性具有重要意義，也為黃刺多糖的抗氧化功能作用提供更加充分的依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

黃刺漿果，2021年8月采集于青海省大通縣；RIN-m5F細胞(大鼠胰島β細胞瘤細胞)，賽百慷生物技術股份有限公司；胰蛋白酶細胞消化液、D-PBS、細胞增殖與毒性檢測(CCK-8)，上海生工生物工程股份有限公司；RPMI—1640培養基，上海逍鵬生物科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；活性氧檢測試劑盒、丙二醛檢測試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，南京建成生物工程研究所；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶(酶活力>400 U/mg)，南京都萊生物技術有限公司；α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)，上海麥克林生化科技股份有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA2104電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；KB-300E臺式機械超聲波清洗器，東莞市科橋超聲波設備有限公司；GS55-9冷凍干燥機，基因有限公司；Optilab T-rEX示差檢測器，美國懷雅特技術公司；Thermo ICS5000離子色譜系統，美國賽默飛世爾科技公司；UV-1780紫外分光光度計，島津有限公司；SU8220冷場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Cytation 5 MV熒光酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；BSC-1304IIA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；HF90二氧化碳培養箱，上海力申科學儀器有限公司；AE31E倒置生物顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司；MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌器，日本松下健康醫療器械株式會社；H1850醫用離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；M200PRO酶標儀，帝肯(上海)貿易有限公司。

2 實驗方法

2.1 多糖提取工藝優化

2.1.1 黃刺果實多糖提取工藝流程

原料—烘干粉碎—石油醚除脂—脫色脫單糖—纖維素酶浸提—超聲波浸提—濃縮—醇沉—冷凍干燥

取黃刺鮮果于50 ℃的烘箱中徹底干燥后，粉碎過40目篩。將粉碎后的原料加入石油醚(料液比1∶5,g∶mL)，水浴加熱40 ℃脫脂2 h，經抽濾后烘干，在85%乙醇中50 ℃條件下水浴2 h，過濾后干燥備用。經過脫脂脫色的黃刺粉末按料液比15∶1(mL/g)加入蒸餾水，加入一定量纖維素酶，在45 ℃，pH=4.0條件下水浴酶解60 min，酶解結束于90 ℃滅酶10 min，140 W超聲波浸提60 min。收集浸提液，待冷卻后離心(4 500 r/min，10 min)，上清液用Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]除蛋白，離心后減壓濃縮至原體積的1/4。濃縮的多糖溶液裝入截留量為5 000 Da透析袋進行透析48 h，加入濃縮液4倍體積無水乙醇靜置48 h，醇沉后冷凍干燥，得到BDPs，得率按公式(1)計算：

(1)

2.1.2 黃刺果實多糖提取單因素試驗

2.1.2.1 加酶量

參考陳程等[18]的方法，固定酶解時間為60 min、酶解溫度45 ℃、超聲波功率140 W，考察不同加酶量0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%(以黃刺原料質量分數計)對黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.2 酶解時間

固定加酶量1%、提取溫度45 ℃、超聲波功率140 W，考察不同酶解時間(20、40、60、80、100 min)對黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.3 酶解溫度

固定加酶量1%、酶解時間60 min、超聲波功率140 W，考察不同酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)對黃刺多糖提取率的影響。

2.1.2.4 超聲波功率

固定加酶量1%、酶解時間60 min、提取溫度45 ℃，考察不同超聲波功率(100、120、140、160、180 W)對黃刺多糖提取率的影響。

2.1.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，綜合考慮得率、誤差等因素，選擇加酶量、酶解時間、酶解溫度和超聲波功率為影響因素，以黃刺多糖得率為衡量指標進行響應面設計。響應面優化試驗因素及水平編碼見表1。

表1 黃刺果實多糖提取工藝響應面優化試驗因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface method for BDP extraction optimization

2.2 黃刺多糖理化性質分析

2.2.1 多糖含量

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[19]，根據回歸方程y=9.703 3x+0.136 6計算。

2.2.2 分子質量測定

采用高效體積排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測定BDPs的分子質量[20]。

樣品及標準品溶液配制：精密稱取樣品和標準品，樣品用0.5%(質量分數，下同)LiBr-DMSO溶液配制終質量濃度為1 mg/mL，并通過0.45 μm的過濾器過濾，樣品轉置于進樣小瓶中。

色譜條件：凝膠色譜-示差-多角度激光光散射系統；色譜柱為凝膠排阻色譜柱Ohpak SB-805 HQ(300 mm×8 mm)，Ohpak SB-804 HQ(300 mm×8 mm)，Ohpak SB-803 HQ(300 mm×8 mm)；流動相為0.5% LiBr-DMSO溶液；流速0.3 mL/min，柱溫45 ℃；進樣量100 μL；示差檢測器Optilab T-rEX。

2.2.3 單糖組成

根據文獻[21]的方法，精確稱量多糖樣品5 mg于色譜瓶中，加入1 mL三氟乙酸(2 mol/L)溶液，121 ℃加熱2 h使其充分水解。冷卻后通N2吹干，加入甲醇清洗再吹干，重復2～3次。加入無菌水溶解，轉入色譜瓶中待測。采用Thermo ICS5000離子色譜系統分析樣品的單糖組成。測定條件如下：DionexTMCarboPacTMPA20液相色譜柱(150 mm×3.0 mm，10 μm)；進樣量5 μL；流動相A為0.1 mol/L NaOH，流動相B為0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；洗脫方式為等梯度洗脫。

2.2.4 剛果紅實驗

取0.5 mL BDPs溶液(2.5 mg/mL)，與1.5 mL剛果紅溶液(2.0 mmol/L)混合，加入1 mol/L NaOH溶液混合至NaOH濃度為0～0.5 mol/L，室溫放置30 min，采用紫外分光光度計在400～600 nm范圍內掃描[22]。

2.2.5 微觀結構觀察

取大小厚度合適的BDPs樣品于樣品臺，鍍金處理后，通過掃描電鏡觀察分析[22]。

2.3 細胞實驗

2.3.1 RIN-m5F細胞培養

RIN-m5F細胞復蘇后培養于PRMI-1640完全培養基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素混合液)，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養，隔日換液。待細胞密度達80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代培養、凍存及后續實驗[23]。

2.3.2 RIN-m5F細胞活力測定

采用CCK-8法進行細胞存活率檢測，以1×105cells/mL的密度將細胞接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后至細胞貼壁。棄去培養液，每孔加入100 μL CCK-8溶液[V(CCK-8試劑)∶V(無血清培養)=1∶10]，每組設6個復孔，置于恒溫培養箱孵育0.5 h后在450 nm處測定吸光值[24]。細胞存活率按照公式(2)計算：

(2)

式中：A1，實驗組的吸光值；A2，空白組的吸光值；A3，正常對照組的吸光值。

2.3.3 ROS水平測定

2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針法進行ROS水平檢測[25]，以1×105cells/ mL的密度接種至96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，取各處理組細胞，吸棄培養基，PBS沖洗2次后，參照試劑盒說明書，加入100 μL含有DCFH-DA(10 μmol/L)的無血清培養液，避光37 ℃孵育1 h，使用全波長多功能酶標儀上機檢測，其中激發波長488 nm，發射波長525 nm。

2.3.4 BDPs對H2O2誘導的RIN-m5F細胞氧化損傷的保護作用

2.3.4.1 BDPs濃度選擇

以1×105cells/mL的密度將細胞接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后至細胞貼壁。加入不同質量濃度BDPs(0.0625、0.125、0.25、0.50、1、2 mg/mL)分別培養24、48、72 h，CCK-8法進行細胞存活率檢測確定BDPs的最佳濃度范圍。

2.3.4.2 細胞分組及處理

正常對照組(NC)：含10%(體積分數)FBS的RPMI-1640培養基；陽性對照組(PC)：300 μmol/L α-LA；模型組(MC)：250 μmol/L H2O2；BDPs組：BDPs低劑量組(0.062 5 mg/mL)，BDPs中劑量組(0.125 mg/mL)，BDPs高劑量組(0.25 mg/mL)。

按照細胞分組，經前期實驗選擇250 μmol/L H2O2誘導3 h后，加入不同濃度BDPs(0.062 5、0.125、0.25 mg/mL)進行干預，同時空白組和模型組加入新的完全培養基同條件培養，每組6個復孔，培養24 h后進行后續實驗。

2.3.5 細胞形態學觀察

通過倒置顯微鏡觀察細胞數量及生長狀態。將生長于對數期的細胞按照密度為1×105cells/孔接種于六孔板，待細胞貼壁后用于實驗。按照2.3.4.2實驗分組處理細胞，鏡下觀察并留取圖像。

2.3.6 SOD、CAT的活性及MDA含量的檢測

參考文獻[26]的方法，細胞分組及處理方式同2.3.4.2，處理結束后，收集細胞，用PBS洗滌后離心，加入提取液勻漿后電動研磨破碎細胞，每次10 s，間隔10 s，共8次。參照SOD、CAT、MDA試劑盒說明書進行操作。

2.4 數據分析

實驗數據均表示為平均值±標準偏差。利用SPSS 20.0軟件統計數據，進行單因素方差分析，利用Origin Pro 2019軟件作圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

3 結果與分析

3.1 單因素實驗

由圖1-a可知，黃刺果實多糖得率隨著加酶量增加先升高后降低，加酶量1.25%時黃刺多糖提取得率最高。當加酶量超過1.25%后，多糖得率開始降低。這可能是由于隨著酶量的增加，促使了黃刺果實細胞壁的破裂，使多糖易于溶出；當加酶量過多時，造成黃刺果實被過量纖維素酶包裹，阻止多糖的溶出，從而降低多糖提取率[27]。因此，最佳用酶量確定為1.25%。

由圖1-b可知，隨著提取時間延長提取率迅速上升，當酶解時間60 min時，黃刺多糖的提取率達到最高，提取時間超過60 min后，可能是時間過度延長使多糖結構會受到破壞，使得多糖提取率下降[28]。因此，最佳酶解時間確定為60 min。

由圖1-c可知，在酶解溫度為35～45 ℃時，多糖提取率逐漸升高，但45 ℃之后提取率開始下降，酶解溫度為45 ℃時，多糖提取率最高。這可能是隨著酶解溫度的提高反應物能量增加，纖維素酶的活性增強加速多糖的溶出；但是當溫度超過45 ℃后纖維素酶活性降低，酶促反應受到明顯抑制而影響多糖的溶出[29]。因此，最佳酶解溫度確定為45 ℃。

a-加酶量：b-酶解時間；c-酶解溫度；d-超聲波功率圖1 提取條件對黃刺多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction conditions on the yield of Berberis dasystachya polysaccharides

由圖1-d可知，黃刺多糖提取率隨著超聲波功率的增加呈先上升后下降的趨勢，當超聲波功率為160 W時，多糖提取率最高。這可能是當超聲波功率較低時產生的機械作用較弱，對多糖提取效果不明顯；而隨著超聲波功率的增大，超聲波的空化作用增強，破壞細胞壁結構，促進了多糖的溶出；當超聲波功率過大時，溶出的多糖糖苷鍵被打破，致使多糖結構破壞，從而影響多糖提取率[30]。因此，最佳超聲波功率確定為160 W。

3.2 響應面分析及黃刺果實多糖提取工藝的優化

以加酶量、酶解時間、酶解溫度、超聲波功率4個因素為自變量，多糖的提取得率為響應值，進行響應面試驗設計，結果見表2。對黃刺果實多糖得率結果進行回歸擬合，并用二階多項式方程如公式(3)表示：

(3)

由回歸方程的方差分析及顯著性分析(表3)可知，回歸模型P<0.000 1，說明黃刺多糖得率得回歸模型極顯著，能夠比較好地反映考察的因素與響應值之間的關系；同時該模型R2為0.999 0，調整R2為0.997 9，表明該模型誤差較小，與實際結果有較高的擬合度。由F值可知各因素對黃刺多糖得率的影響大小為：酶解時間(X2)>超聲波功率(X4)>加酶量(X1)>酶解溫度(X3)，且模型中X1X2、X1X3、X1X4和X2X4的交互作用均為極顯著(P<0.01)，X3X4交互作用不顯著。

經預測分析得到黃刺果實多糖提取的最佳提取條件：加酶量1.25%、酶解時間56.95 min、酶解溫度44.96 ℃、超聲波功率163.82 W，在此條件下，黃刺果實多糖的最大得率預測值為3.451%。結合實際操作將最佳工藝調整為：加酶量1.25%、酶解時間57 min、酶解溫度45 ℃、超聲波功率164 W。根據上述試驗條件進行3次水平實驗，所得平均提取得率為(3.478±0.075)%，與理論值的相對誤差為0.782%，說明回歸模型可以真實地反映各因素對黃刺多糖提取得率的影響。前期研究超聲波輔助水提的多糖得率為1.3%[3]，而本研究中多糖得率為(3.478±0.075)%，多糖提取效率顯著提高，經苯酚-硫酸法測得多糖含量為(75.26±0.70)%。因此超聲波輔助酶解法可作為黃刺多糖提取的有效方法。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and corresponding results for respond surface analysis

表3 回歸模型中回歸系數方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

續表3

3.3 BDPs理化性質分析

3.3.1 分子質量測定

凝膠色譜可以將溶劑中的分子按照重量或尺寸大小依次洗脫從而達到分離的目的，進而利用示差檢測器根據其折光強度可檢測樣品的濃度信息，通過多角度激光散射儀檢測大分子的光散射信息，再根據馬克·霍溫克方程計算出每個組分對應的分子質量[31]。利用軟件ASTRA 6.1處理色譜數據，以檢測的保留時間為橫坐標，以摩爾質量為縱坐標繪制樣品的絕對分子質量HPSEC圖譜，如圖2所示。

圖2 BDPs的HPGPC圖譜Fig.2 HPSEC chromatogram of BDPs

示差信號圖譜分布對稱，說明分子質量分布相對均一，在80.8 min時出現信號尖峰，光散射信號在75.9 min處出現信號尖峰?；诠馍⑸湫盘柡褪静钚盘栍嬎闼梅肿淤|量在72～79 min之間呈直線關系，說明該段的多糖分子構型特征一致，80～85 min內呈不規則波動現象，可能是信號變弱引起的分子質量波動。BDPs的重均分子質量為10.2 kDa，均方根半徑為15.3 nm，多分散系數為1.279，接近于1，說明分子質量分布均一且均在可接受范圍。

3.3.2 單糖組成

BDPs及單糖標準品的離子色譜圖如圖3所示，與標準品對比，BDPs中含有巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸，摩爾比為1∶42.2∶32.6∶ 11.8∶4.4∶56.1∶5.1∶1.8，表明BDPs是一種雜多糖，甘露糖是其主要單糖組分。

a-巖藻糖；b-阿拉伯糖；c-鼠李糖；d-半乳糖；e-葡萄糖；f-木糖；g-甘露糖；h-果糖；i-核糖；j-半乳糖醛酸；k-古羅糖醛酸；l-葡萄糖醛酸：m-甘露糖醛酸圖3 標準品及BDPs的離子色譜圖Fig.3 Chromatogram profiles of monosaccharide composition of BDPs and standards

3.3.3 剛果紅實驗

具有三螺旋構象的多糖在NaOH溶液中與剛果紅形成絡合物，最大波長會出現紅移現象，隨著NaOH溶液濃度逐漸增高，多糖螺旋結構發生解體，變成無規則的線團形式，最大吸收波長又會發生藍移[32]。由圖4可以看出，與單一剛果紅溶液相比，BDPs的最大吸收波長發生了紅移，說明BDPs存在三螺旋結構。隨著NaOH濃度的增大，黃刺多糖與剛果紅試劑作用產生絡合物的最大吸收波長均呈現連續下降的趨勢，造成這種結果的原因可能是黃刺多糖結構復雜，分子質量大，在水溶液中呈現無規則卷曲構象，堿性溶液使多糖的氫鍵不斷斷裂[22]。

圖4 BDPs與剛果紅混合堿溶液的最大吸收波長變化Fig.4 Changes in absorption wavelength maximum of mixture of Congo red and BDPs

3.3.4 微觀結構觀察

如圖5所示，BDPs呈顆粒狀，表面呈不規則褶皺，比較粗糙且孔洞多。而這與纖維素酶協同超聲波提取北沙參多糖的形態結果一致，可能是由于酶解和超聲波的協同作用下使多糖降解成小分子碎片堆疊[27]。

a-500×；b-2 500×；c-5 000×圖5 BDPs掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of BDPs

3.4 不同濃度BDPs對細胞存活率的影響

如圖6所示，BDPs質量濃度在0.062 5～0.25 mg/mL作用24～72 h對細胞存活率無顯著影響。BDPs作用細胞24 h后，質量濃度在0.062 5～0.25 mg/mL范圍內時，細胞存活率是逐漸升高的，0.5 mg/mL之后開始下降；BDPs作用48 h后，在BDPs質量濃度0.062 5～0.25 mg/mL范圍內時，細胞存活率是逐漸升高的，高于0.25 mg/mL時開始逐漸下降；BDPs作用72 h后，在BDPs濃度0.062 5～0.125 mg/mL范圍內時，細胞存活率逐漸升高，高于0.125 mg/mL時開始下降，并且和對照組相比，在濃度為2 mg/mL時顯著降低(P<0.05)。因此，0.062 5～0.5 mg/mL為細胞的安全質量濃度范圍，所以最終選擇24 h作為后續BDPs的作用時間，質量濃度范圍選取在0.062 5～0.5 mg/mL。

a-24 h；b-48 h；c-72 h圖6 不同質量濃度BDPs對細胞存活率的影響Fig.6 Effects of different concentrations of BDPs on the survival rate of RIN-m5F cells注：*P<0.05表示與正常對照組比較差異顯著

3.5 BDPs對H2O2誘導的RIN-m5F細胞的保護作用

胰島β細胞易受ROS損傷而凋亡，引發糖尿病[33]。大量研究采用H2O2建立細胞氧化損傷模型，誘導β細胞產生氧化損傷。如圖7所示，經預實驗選擇250 μmol/L H2O2誘導細胞，誘導3 h后細胞存活率與正常對照組相比顯著降低(P<0.05)；使用質量濃度為0.062 5～0.5 mg/mL的BDPs干預細胞后，細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，但與模型組相比細胞存活率呈現顯著升高(P<0.05)，故0.062 5～0.5 mg/mL的BDPs能夠提高H2O2氧化損傷的細胞存活率，對氧化損傷的細胞有一定保護作用。

圖7 BDPs對H2O2誘導的RIN-m5F細胞的保護作用Fig.7 Protective effect of BDPs on H2O2-induced of RIN-m5F cells注：*表示與模型組作相比差異顯著(P<0.05)；#表示與正常對照組相比差異顯著(P<0.05)，圖9同

3.6 BDPs對細胞形態的影響

如圖8所示，對照組為正常培養的RIN-m5F細胞，呈聚集圓球狀或梭狀，經250 μmol/L H2O2刺激后細胞發生皺縮、細胞密度降低，且邊緣模糊；再經過BDPs干預后細胞形態慢慢恢復，并且密度增加，BDPs低劑量組(0.0625 mg/mL)干預H2O2刺激的細胞后細胞數量明顯增加，細胞邊界逐漸變圓滑。

a-正常對照組；b-陽性對照組；c-模型組；d-BDPS-低劑量組；e-BDPS-中劑量組；f-BDPS-高劑量組圖8 不同濃度BDPs對RIN-m5F細胞形態的影響Fig.8 Effect of different concentrations of BDPs on RIN-m5F cells morphology

3.7 ROS水平測定

如圖9所示，250 μmol/L H2O2誘導細胞后，增加了細胞內ROS積累，ROS水平顯著高于對照組(P<0.01)；經過0.062 5～0.25 mg/mL的BDPs干預24 h后，細胞ROS水平與模型組相比有顯著下降的趨勢(P<0.05)，說明H2O2誘導RIN-m5F細胞ROS水平升高，不同劑量的BDPs可以降低H2O2損傷后RIN-m5F細胞內的ROS水平，抑制H2O2誘導的細胞氧化應激。

圖9 不同濃度BDPs對RIN-m5F細胞內ROS的影響Fig.9 Effect of different concentrations of BDPs on ROS level of RIN-m5F cells

3.8 SOD、CAT的活性及 MDA 含量的檢測

BDPs對RIN-m5F細胞中SOD、CAT的活性及MDA含量測定結果如圖10所示。由圖10-a和圖10-b可知，H2O2處理后細胞SOD、CAT的活性與對照組相比有顯著降低(P<0.05)，經過BDPs干預后，抗氧化酶活性逐漸升高且呈一定的劑量依賴性，在0.25 mg/mL時BDPs的SOD活性達到(69.67±3.26)U/mg，CAT活性達到(11.12±0.57)U/mg。

a-SOD；b-CAT；c-MDA圖10 BDPs對RIN-m5F細胞SOD、CAT和MDA含量的影響Fig.10 Effect of BDPs on SOD,CAT and MDA in H2O2-induced RIN-m5F cells

由圖10-c所示，H2O2誘導可以提升細胞中MDA含量(P<0.05)，BDPs干預后細胞中MDA含量均有所降低，BDPs高劑量組(0.25 mg/mL)MDA含量為(9.22±0.17)mmol/mg，可見BDPs能夠抑制MDA的釋放，保護氧化應激損傷的細胞。

4 結論與討論

前期研究發現黃刺果實中有大量活性多糖成分，但對于黃刺多糖的提取及生物活性研究較少。與傳統的水提法相比，超聲波輔助酶法提取多糖損失更小且得率更高[22]，因此本研究通過單因素實驗分析加酶量、酶解溫度、酶解時間、超聲波功率各因素對黃刺多糖提取率的影響，利用響應面優化黃刺果實多糖提取工藝，得到最佳提取工藝條件為：加酶量1.25%(質量分數)，酶解時間57 min，酶解溫度45 ℃，超聲波功率164 W，黃刺果實多糖平均提取得率為(3.478±0.075)%，與預測值3.451%相近。結構解析是多糖研究中的難點，本文通過測定分子質量、單糖組成、掃描電鏡及剛果紅實驗初步表征BDPs結構，表明BDPs重均分子質量平均為10.2 kDa，主要由巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，摩爾比為1∶42.2∶32.6∶11.8∶4.4∶56.1∶5.1∶1.8，說明BDPs是一種雜多糖，具有三螺旋結構，后續可進一步分離純化，結合特定降解方法獲得結構片段，采用甲基化、核磁共振等手段表征其精細多糖結構，可能存在的構效關系也值得進一步探討。

氧化損傷是引起糖尿病的危險因素之一，因此抗氧化治療是一個可以防治糖尿病的很重要的途徑[34]。長期暴露于高水平H2O2中的胰島β細胞會發生氧化損傷，H2O2誘導后氧化損傷的RIN-m5F細胞內ROS水平顯著升高，抗氧化酶活性降低[35]，這與本文研究結果一致。研究表明，天然產物多糖能有效對抗機體氧化應激狀態，具有良好的抗氧化作用[36]。樹莓多糖能夠降低Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺和血清中SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，一定程度改善鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)對胰島β細胞造成的損傷[37]。靈芝多糖能夠有效提高STZ誘導的糖尿病大鼠血清中胰島素水平，降低血糖和脂質過氧化物含量[38]。枸杞多糖能夠控制Ⅱ型糖尿病大鼠血糖水平，同時能顯著提高SOD活性，減少MDA含量[39]。這與本文得出的BDPs能夠提高H2O2損傷的胰島細胞抗氧化酶活性，降低ROS水平及MDA含量從而緩解氧化應激的結果一致。

研究發現，氧化應激在胰島β細胞的凋亡過程中發揮重要作用[40]，ROS過多積累可以調節凋亡相關基因表達(如Bcl-2蛋白家族)或者通過激活NF-κB誘導β細胞損傷[41]，本實驗研究結果表明BDPs對H2O2誘導胰島β細胞氧化損傷具有保護作用，但其具體抗凋亡機制還未明確，未來研究中可進一步討論BDPs是否通過調節凋亡蛋白表達及調控NF-κB通路等途徑保護胰島β細胞凋亡，以期為黃刺多糖在醫藥或功能性食品中的應用提供支持。綜上所述，BDPs可以提高氧化損傷細胞的抗氧化酶活性，從而減輕氧化應激對胰島β細胞的損傷，這為青藏高原特色資源活性成分治療糖尿病提供了新的思路。