基于蛋白質結構及相互作用的羊乳熱凝聚物形成分析

薛海燕，李晶瑩，趙嫻慧，賀寶元，伊美霞，宋宏新

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)2(陜西科技大學 輕工科學與工程學院，陜西 西安，710021)

羊乳與牛乳相比，營養價值高，脂肪球小，更易于人體吸收，且蛋白質組成更接近于人乳，是1種健康、安全、營養的重要代替乳源[1]。乳中酪蛋白占總蛋白含量的80%左右，主要以酪蛋白膠束形式存在，清蛋白主要由β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-La)、免疫球蛋白(immunoglobulins，Ig)、血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)等組成。山羊乳的酪蛋白膠束較小，直徑在160 nm左右，等電點約在4.1。相比于牛乳，山羊乳酪蛋白膠束結構較疏松，穩定性較低。乳清中含量最高的清蛋白是α-La和β-Lg，約占清蛋白含量的70%以上。α-La分子為球狀單體蛋白，由123個氨基酸殘基構成，其中包含8個半胱氨酸，形成4個分子內的二硫鍵，相對分子質量僅為14 kDa。其二級結構及三級結構有序緊密。山羊乳相較于牛乳，α-La缺乏蛋氨酸。山羊乳的β-Lg單體由162個氨基酸殘基組成，含5個半胱氨酸殘基，兩兩形成二硫鍵后，剩余1個游離的巰基基團[2]，相對分子質量為18.3 kDa，易被氧化與其他蛋白質結合。熱處理是乳品加工中最常用的方法，其目的主要是殺死乳中存在及滋生的致病菌及大部分微生物，使乳品達到衛生安全標準。但經熱處理可能導致乳清蛋白的變性與流失。DEETH等[3]研究發現，牛乳經超高溫瞬時滅菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)處理后，乳清蛋白與酪蛋白發生相互作用，特別是位于膠束表面的κ-酪蛋白。羊乳與牛乳在蛋白組成、含量及結構等方面都存在一定差異，在pH 5～9，山羊乳的β-Lg比牛乳少3個負電荷，多1個正電荷殘基，在堿性下電泳遷移率不同[4]。因此羊乳使用牛乳常用殺菌方式并不適合，有研究發現，羊乳熱穩定性低于牛乳，尤其是在UHT處理時，羊乳極易發生凝聚、沉淀，甚至發生變性[5]。針對羊乳熱穩定性低，在選擇熱殺菌溫度時，羊乳應相應降低處理溫度。目前對于羊乳蛋白質結構及熱加工穩定性的研究較為薄弱，故研究羊乳的熱凝聚行為，為大規模液態羊乳生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊乳，陜西金牛乳業有限公司；N’N-亞甲基雙丙烯酰胺，美國Sigma公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸、Tris-base，美國Amresco公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BP-Power電泳儀，北京百晶生物技術有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；GIS400凝膠成像分析系統，南京馳順科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司；納米粒度及Zeta電位儀，奧地利安東帕公司；環境掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理羊乳樣品制備

將新鮮羊乳采取常用商業殺菌方式進行熱處理，處理方式設定如下：63 ℃/30 min、75 ℃/15～20 s、85 ℃/15～20 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s，不進行熱處理的乳樣作為對照組。

1.3.2 不同溫度熱處理羊乳組分膠束粒徑及電位分析

蛋白質的聚集程度可以用粒徑來表示。不同熱處理后的羊乳樣品加入超純水稀釋20倍后用納米粒度儀進行粒徑測量。

Zeta電位的大小可以用來表征蛋白質在體系中的穩定程度。不同熱處理后羊乳加入超純水稀釋10倍后進行Zeta電位的測量。

1.3.3 不同溫度熱處理羊乳微觀結構分析

利用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察熱處理后羊乳蛋白微觀結構[6]。熱處理后羊乳樣品冷凍干燥，將干燥后粉末均勻置于導電膠上，樣品臺噴金處理。放入樣品臺后，調節到最佳視野后掃描圖像。

1.3.4 傅里葉紅外光譜二級結構分析

樣品處理：將1.3.1中不同熱處理后羊乳樣品，分別進行真空冷凍干燥，于-20 ℃保存。傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析蛋白二級結構方法參照文獻[7]。

1.3.5 羊乳清蛋白的分離

分離方法如圖1所示。

圖1 羊乳清蛋白的分離及化學沉淀法分離β-乳球蛋白組分Fig.1 Separation of goat whey protein and separation of β-lactoglobulin by chemical precipitation

1.3.6 β-乳球蛋白與羊乳中其他蛋白組分相互作用

經1.3.5中分離得到的羊乳β-Lg分別與標準品羊乳α-La、α-CN、β-CN和κ-CN按相應組分在羊乳中含量(α-CN，20.6%；β-CN，47.3%；κ-CN，17.7%；α-La，4%；β-Lg，10.3%)溶解混勻，分別對其進行熱處理，取樣后置于-20 ℃冰箱待測。

1.3.7 乳樣中蛋白質SDS-PAGE分子質量分析

取β-乳球蛋白樣品質量濃度為1 mg/mL，選擇濃度15%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，分別加入還原性(含β-巰基乙醇，+β)與非還原性(無β-巰基乙醇，-β)的2倍蛋白樣品緩沖液，分析蛋白在巰基乙醇是否還原二硫鍵的情況下蛋白的電泳遷移行為變化。點樣量10 μL/孔。電泳結束后剝膠，放置搖床染色大約2～6 h。待染色完成后，更換脫色液至背景為無色。使用凝膠成像儀采集圖像，并采用Image J對蛋白質條帶灰度值進行分析，根據各條帶的百分含量計算蛋白質純度。

2 結果與分析

2.1 羊乳β-Lg的分離純化結果

圖2為不同NaCl濃度條件下對乳清蛋白的分離結果，當NaCl質量分數為9%時，即泳道3，能夠得到較純的β-Lg，采用Image J對蛋白質條帶灰度值進行分析，根據各條帶的百分含量計算β-Lg純度為95%以上，純度達到后續研究要求。

M-Marker；1～3為質量分數是5%，7%，9%NaCl溶液分離β-Lg上清；4～6為沉淀圖2 β-Lg分離的電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of separation of β-Lg

2.2 不同溫度熱處理后脫脂山羊乳膠束粒徑分析

未經熱處理羊乳的粒徑主要分布在100～1 000 nm，平均粒徑為209.6 nm(圖3-a)，由圖3-b可見，熱處理顯著改變乳的粒徑，經低溫巴氏殺菌，平均粒徑增大為217.7 nm，75 ℃處理后，粒徑為219.7 nm，85 ℃的高溫巴氏殺菌使得粒徑增加到228.6 nm，當121 ℃處理時，平均粒徑增加到289.2 nm，粒徑增加顯著。RAYNAL等[8]研究表明，在75 ℃/30 s加熱后，羊奶中的膠束平均粒徑增加不明顯，在85 ℃/30 s加熱后，膠束平均粒徑增加。熱處理使得乳清蛋白發生變性，且乳清蛋白與酪蛋白膠束也發生凝聚，故隨著處理溫度的增加，粒徑分布峰寬擴大，平均粒徑也在不斷增大。

a-粒徑分布圖；b-平均粒徑分布圖圖3 不同熱處理羊乳粒徑圖Fig.3 The particle size of different heat-treated goat milk注：1～6分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳，字母不同表示與對照組比具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 不同溫度熱處理羊乳Zeta電位分析

Zeta電位可以用來表征膠體分散系的穩定性，膠體粒子之間相互排斥或吸引，Zeta電位的絕對值越高，斥力越大，體系越穩定。由圖4可知，鮮羊乳的電位為(-22.5±0.6) mV，經100 ℃處理，羊乳電位為(-15.7±0.2) mV，經121 ℃處理羊乳，平均電位為(-16.2±0.2) mV，較100 ℃的電位有所降低，隨熱處理強度增加，羊乳電位絕對值普遍降低，膠束穩定性越弱。張雪喜[9]對熱處理后羊乳進行電位測定，與生鮮羊乳相比，不同熱加工羊乳組的Zeta電位值均有不同程度地減小，85 ℃/15 s和125 ℃/4 s處理組間具有顯著性差異。熱處理使得乳清蛋白發生變性，并聚集在酪蛋白膠束表面，膠束表面的電荷下降，乳體系穩定性降低。

圖4 不同熱處理羊乳平均Zeta電位圖Fig.4 The average Zeta potential diagram of different heat-treated goat milk

2.4 不同溫度熱處理羊乳掃描電鏡分析

圖5為不同溫度熱處理脫脂山羊乳冷凍干燥后的SEM圖，由圖5-a可知，未處理羊乳的結構比較疏松，孔隙大小較均一，而經63和100 ℃處理的顆粒較大且大小不一，表面多孔網狀結構消失，開始產生聚集，75 ℃處理組的表觀來看呈片層結構且無明顯網狀結構，85 ℃處理后的乳蛋白相比于原料乳蛋白，明顯有部分凝集，可能是由于乳蛋白部分形成熱變性蛋白聚合物，表明蛋白質分子間的結合更緊密。121 ℃熱處理的山羊乳乳粒表面平整孔隙明顯。ZHANG等[10]對奶牛及牦牛酪蛋白膠束微觀結構進行觀察，奶牛酪蛋白膠束結構更為松散，孔隙較大。孫佳悅[11]對不同熱處理牛乳蛋白質膠束結構進行觀測，63及80 ℃處理牛乳后，相比于鮮牛乳，顆粒增大，且有部分凝集，形成蛋白聚合物。本實驗中山羊乳在75和100 ℃熱處理的蛋白質微觀結構與上述牛乳有相似的結果。

a-未處理羊乳；b-63 ℃/30 min；c-75 ℃/15 s；d-85 ℃/15 s；e-100 ℃/300 s；f-121 ℃/4 s圖5 不同溫度熱處理羊乳掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope images of goat milk treated at different temperatures

2.5 不同溫度熱處理羊乳紅外光譜分析

為分析經不同熱處理后羊乳中蛋白二級結構的變化，對羊乳樣品進行傅里葉紅外光譜分析，結果如圖6所示，經不同程度熱處理羊乳與未經熱處理羊乳的譜圖差異較小。不同熱處理條件下羊乳的透光度發生變化，特征吸收峰產生了不同程度的紅移或藍移，變化最明顯的波段為3 600～3 100 cm-1和1 700～1 600 cm-1。

圖6 不同熱處理條件下羊乳蛋白FT-IR光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of goat milk protein under different heat treatment conditions

研究表明，游離羥基的吸收峰位于3 600～3 500 cm-1，當其由游離態向結合態轉化形成分子內或分子間氫鍵時，它的吸收峰也會隨之紅移并與N—H(譜帶范圍3 500～3 200 cm-1)的吸收峰重疊，從而會在3 400 cm-1左右形成吸收峰。在乳蛋白分子多聚體中存在大量分子內或分子間氫鍵時，在紅外光譜圖中表示為在3 400 cm-1左右波段吸收峰寬而強[12]。

由圖6可知，未處理原料羊乳的紅外譜帶在3 321 cm-1處存在明顯的特征吸收峰，說明氫鍵在分子內和分子間大量存在。經熱處理后羊乳的吸收峰均發生一定程度的紅移，說明蛋白分子間氫鍵斷裂與重新締合，羊乳蛋白的空間結構發生變化。在121 ℃的超高溫處理下，羊乳吸收峰紅移至3 416 cm-1，移動幅度最大，表明氫鍵破壞最為嚴重。

圖7為羊乳經不同熱處理后的酰胺Ⅰ帶紅外光譜圖，經熱處理后均有不同程度紅移。對該圖做二階導數并進行高斯擬合，根據各子峰位置確定其與二級結構的對應關系，計算各峰的積分面積，得到各二級結構含量。

圖7 羊乳蛋白經不同熱處理酰胺Ⅰ帶FT-IR光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of goat milk protein amide Ⅰ with different heat treatment conditions

圖8為不同熱處理后羊乳蛋白酰胺Ⅰ帶經高斯擬合處理得到的擬合圖譜，擬合后的二級結構含量變化見表1，未處理羊乳蛋白α-螺旋結構占37.14%，羊乳蛋白經熱處理后α-螺旋結構均有不同程度的減少，其中經121 ℃熱處理的α-螺旋結構減少最為顯著，達到14.47%。α-螺旋是蛋白質中常見且最為穩定的二級結構，靠鏈內氫鍵維持。熱處理程度增大，使α-螺旋中的氫鍵逐漸斷裂，發生解螺旋，乳蛋白發生熱變性。故蛋白的結構穩定性與蛋白α-螺旋結構呈正比例關系。

a～f分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s熱處理羊乳圖8 經不同熱處理后羊乳蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖Fig.8 Gaussian curve fitting diagram of goat milk protein amide Ⅰ under different heat treatment conditions

β-轉角含量表現為先增加后降低，但總體呈現為增加趨勢，未處理羊乳β-轉角結構占30.66%，經85 ℃熱處理后增加到45.35%，經100 ℃以上處理又減少到30%以上。β-折疊結構在原乳中為16.38%，經63及100 ℃處理的β-折疊結構含量增加，高溫短時處理的羊乳β-折疊結構含量減少，含量處于波動狀態。β-折疊結構常見于蛋白質內部折疊區域，經熱處理后羊乳蛋白形成熱聚集體，分子間的β-折疊結構易轉變為β-轉角結構，且部分β-轉角結構轉變為無規則卷曲結構[13]。

無規則卷曲結構在未處理羊乳中為15.83%；隨著熱處理溫度升高，無規則卷曲含量逐漸升高，其中100 ℃熱處理的乳蛋白中無規則卷曲含量顯著增加到30.73%，這是由于熱處理破壞了部分蛋白的二級結構。且隨著熱處理程度的增強，部分有序的乳蛋白結構逐漸向無序轉化，無規則卷曲結構含量也就不斷增加。孫佳悅等[14]對牛乳蛋白二級結構的研究結果與本研究中山羊乳的變化趨勢一致。

表1 不同熱處理條件下羊乳蛋白質二級結構含量變化Table 1 The secondary structure content of goat milk protein under different heat treatment conditions

2.6 不同溫度熱處理羊乳SDS-PAGE結果

用SDS-PAGE對不同溫度熱處理的羊乳樣品的分子質量進行分析，羊乳蛋白經不同溫度的熱處理，蛋白發生變性、聚集、凝結的程度也不同。

不同熱處理脫脂羊乳電泳結果見圖9，對非還原性樣品與還原性樣品電泳結果作對比。

M-Marker；1-未處理羊乳；2～6分別為63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳a圖(-β)表示非還原性樣品，不含有β-巰基乙醇；b圖(+β)為還原性樣品，含有β-巰基乙醇圖9 不同熱處理羊乳SDS-PAGE(-β) (+β)結果Fig.9 SDS-PAGE (-β) (+β) results of different heat-treated goat milk

與鮮羊乳相比，脫脂羊乳經63 ℃低溫長時巴氏殺菌與75和85 ℃的高溫瞬時巴氏殺菌，蛋白電泳條帶未發生明顯變化，當熱處理溫度為100 ℃時，電泳條帶發生明顯變化，清蛋白變淺，且β-Lg較α-La蛋白條帶更淺，且非還原性電泳κ-CN條帶可明顯觀察到消失，比較還原和非還原電泳圖可以發現，三者可能通過二硫鍵結合，當羊乳經121 ℃處理時，清蛋白與κ-CN變性，條帶變淺。羊乳經85 ℃以上溫度處理時，蛋白即聚集形成大分子物質無法通過濃縮膠，在加樣口形成條帶。

將熱處理后的羊乳5 000 r/min離心分離出乳清，由上清液電泳可看出(圖10)，非還原性樣品85 ℃處理后κ-CN條帶就已消失，100 ℃以上處理β-Lg，κ-CN以及血清白蛋白條帶都消失，α-La條帶明顯變淺，而上方上樣孔存在不能遷移的大分子；故α-La的熱穩定性比β-Lg的要高，β-Lg在85 ℃左右發生蛋白變性，α-La在90 ℃左右發生較大程度變性。結合還原性樣品電泳圖(+β)，100 ℃處理后α-La和β-Lg條帶變淺但未消失，故清蛋白β-Lg與部分的α-La經較高溫度熱處理可能與部分酪蛋白如κ-CN等發生交聯聚集形成大分子蛋白。HOVJECKI等[15]研究熱處理羊乳的電泳結果顯示，經72 ℃/30 s以上處理后的樣品中乳清蛋白顯著聚集，85 ℃/5 min處理的樣品中存在高分子質量二硫鍵蛋白復合物，不能擴散到凝膠中。本研究顯示羊乳蛋白質對熱敏感，85 ℃處理較短時間即發生變性。

注：1～6分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳離心后的上清液a-非還原性樣品，不含有β-巰基乙醇；b-還原性樣品，含有β-巰基乙醇圖10 不同熱處理羊乳乳清部分SDS-PAGE(-β) (+β)結果Fig.10 SDS-PAGE (-β) (+β) results of different heat-treated goat milk whey parts

2.7 酪蛋白與羊β-Lg間相互作用分析

經熱處理后羊乳蛋白間存在聚集與交聯，但交聯方式與參與蛋白尚不清楚，故利用分離純化的單組分蛋白進行熱處理，探索蛋白間的聚集行為及相互作用。

熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分非還原性(-β)與還原性(+β)蛋白質電泳圖見圖11、圖12。羊β-Lg與ɑ-CN混合熱處理后，β-Lg條帶顏色淺，由于β-Lg 分子含有游離巰基和二硫鍵容易發生熱變性[16]，經121 ℃處理，β-Lg與ɑ-CN條帶都變淺，且有大分子蛋白生成，β-Lg與ɑ-CN可能發生二硫鍵的交聯與轉換而相互結合。羊β-Lg與β-CN混合熱處理后，β-Lg條帶未發生明顯變化，β-Lg與β-CN可能未發生蛋白間的交聯，且β-CN作為疏水性最強的蛋白，不能與β-Lg結合。羊β-Lg與κ-CN混合熱處理，可觀察到在121 ℃熱處理時κ-CN有拖尾現象(圖11-b)，上方加樣孔有條帶，說明有大分子蛋白生成，可能是β-Lg與κ-CN形成了大小不一的蛋白質聚集物，β-Lg與κ-CN發生二硫鍵的結合[17-20]。PARRIS等[21]的研究表明牛乳在溫度高于90 ℃，其中β-Lg也可通過二硫鍵與κ-CN形成大分子絡合物。

M-Marker；圖a中1～6為β-Lg與ɑ-CN混合物；圖a中7～9和圖b中1～3為β-Lg與β-CN混合物；圖b中4～9為β-Lg與κ-CN混合物；各組樣本按順序分別為：未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s圖11 熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分的電泳結果(-β)Fig.11 Electrophoresis results of heat-treated goat β-Lg and casein components (-β)

圖12 熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分的電泳結果(+β)Fig.12 Electrophoresis results of heat-treated goat β-Lg and casein components (+β)

3 結論

本研究對羊乳進行不同程度熱處理，研究羊乳在熱處理后蛋白變性，聚合及蛋白間相互作用關系，結果表明，經熱處理后羊乳蛋白粒徑增大，Zeta電位絕對值降低，乳體系穩定性下降；經紅外光譜分析，蛋白質分子氫鍵斷裂，二級結構中α-螺旋含量降低，無規則卷曲含量升高，乳蛋白質結構由有序向無序轉變。羊乳經85 ℃處理，乳清蛋白發生變性，100 ℃處理后乳清蛋白完全變性，并交聯產生蛋白聚合物；經單組分蛋白質間相互作用分析發現，山羊乳中β-Lg極易與膠束外圍的κ-CN發生二硫鍵的交聯與轉化，使蛋白間凝聚，而α-CN則表現出與β-Lg有較低程度的結合。因此，在乳制品生產過程中，應選用合適的加工方式，使乳蛋白質結構能保持較高的穩定性。