高效液相色譜法測定果蔬中松脂酸銅殘留

王美然，張瓊尹，陳博鈺，吳瓊，張新春，韓丙軍*

1(海南大學 植物保護學院，海南 ?？?，570228)2(中國熱帶農業科學院分析測試中心 國家市場監管重點實驗室(熱帶果蔬質量與安全)，農業農村部亞熱帶果品蔬菜質量安全控制重點實驗室，海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南 ?？?，571101)3(中國熱帶農業科學院 環境與植物保護研究所，海南 ?？?，571101)

松脂酸銅(copper abietate)是以松香為原料，添加無機銅、有機酸及催化劑等多種試劑制備的一種具廣譜殺菌性的含銅類農藥，作為新型銅制劑殺菌劑，具有高效低毒、兼顧預防保護和治療等特性，可用于防治檳榔葉斑病[1]、杧果蒂腐病菌[2]、柑橘潰瘍病[3]、瓜類霜霉病、細菌性角斑病、火龍果炭疽病、潰瘍病等多種細菌和真菌引起的蔬菜病害，同時對蔬菜也有明顯的刺激生長的作用，近年來在我國主要的蔬菜水果產區被廣泛應用[4]。

松脂酸銅作為含銅類化合物，長期過量攝入可引發系列疾病，食用蔬菜水果中含銅農藥超標而中毒的事件也有發生[5]，因此，迫切需要開展松脂酸銅的殘留以及相關檢測方法的研究。目前關于松脂酸銅測定的方法主要有液相色譜法，其中楊德毅等[6]使用高效液相色譜法測定了柑橘中松脂酸銅殘留量，并開展了不確定度分析，但是其對于松脂酸銅鹽酸衍生物的轉化過程未進行分析。此外，有文獻報道使用高效液相色譜法[7-8]測定松脂酸銅農藥[9]，使用高效液相色譜-質譜聯用對食品[10]和跌打片[11]中松香酸進行測定，但目前有關于松脂酸銅在作物中殘留檢測的相關研究仍未見報道。

本研究以果蔬中火龍果、豇豆和杧果為主要研究對象，建立高效液相色譜法檢測果蔬中松脂酸銅農藥殘留的方法，為在果蔬中準確快速的農藥殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

松脂酸銅標準品(純度95.0%)，山東禾宜生物科技有限公司；石油醚、甲醇、乙腈(色譜純)，美國Thermo Scientific公司；36.0%～38.0%鹽酸(優級純)，廣州化學試劑廠；丙酮(優級純)，美國Thermo Scientific公司；冰醋酸(純度99.5%)為分析純，西隴科學股份有限公司。本實驗中所用試劑未經說明者均為分析純，所用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀-紫外檢測器，美國Waters 公司；Q-Exactive QE四極桿靜電軌道阱高分辨質譜儀，美國Thermo Scientific 公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；水浴恒溫振蕩器，上海江星儀器有限公司；超聲清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司；低速離心機，上海安亭科學儀器廠；旋轉蒸發儀，德國海道夫公司；超純水儀，美國Milli-pore公司；渦旋振蕩器，美國Thermo公司；移液器，德國艾本德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣品

田間采摘火龍果、豇豆和杧果樣品，根據GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》標準要求，分別取火龍果全果(去除葉冠部分)、豇豆全豆(帶莢)和杧果全果(去核)樣品，經勻漿機制備后，按照四分法進行縮分，在-20 ℃保存，供實驗使用。

火龍果、豇豆和杧果樣品，均購自?？诒镜厥袌龌虿勺灾袊r業科學院分析測試中心試驗基地。

1.2.2 標準溶液配制

用天平精確稱量松脂酸銅標準品10 mg至10 mL容量瓶中，選擇有機溶劑甲醇定容，得到質量濃度為1 000 μg/mL松脂酸銅單標儲備液，避光冷藏保存，有效期為6個月；取適量儲備液，利用逐級稀釋法，將經過前處理得到的空白基質提取液進行逐級稀釋，得到松脂酸銅質量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL的基質標準溶液。

1.2.3 樣品前處理

用天平分別稱取火龍果、豇豆和杧果樣品置于50 mL離心管中，樣品質量為(2.0±0.01) g，分別加入10 mL 4 mol/L HCl溶液和20 mL石油醚進行提取，振蕩均勻后超聲反應提取10 min，4 000 r/min的條件下離心5 min，吸取全部上清液于50 mL圓底燒瓶中，45 ℃旋轉蒸干，蒸干后取2 mL乙腈定容，用0.22 μm針式濾膜過濾，待測備用。

1.2.4 色譜檢測條件

設置紫外檢測器波長為241 nm。選擇SunFire C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm，美國Waters公司)，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min，設置流動相A為體積分數0.1%冰醋酸，流動相B為乙腈，V(冰醋酸)∶V(乙腈)=20∶80，等度洗脫。

1.2.5 松脂酸銅殘留量的計算

根據公式(1)計算松脂酸銅的殘留量，以每克農藥所殘留的質量表示殘留量，單位為μg/g。

(1)

式中：xi，樣品中待測組分殘留量，μg/g；ρi，待測組分工作液質量濃度，μg/mL；V0，樣品溶液最終定容體積，mL；m，樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 測定對象的確認

液相色譜法測定松脂酸銅需要加入鹽酸，將松脂酸銅衍生轉化為松脂酸(abietic acid)。因此本研究首先對松脂酸銅衍生轉化為松脂酸的過程進行確證，使用Q Exactive-Orbitrap高分辨質譜對加入鹽酸前后的松脂酸銅標準溶液進行分析[12-14]。首先，查詢松脂酸和松脂酸銅在高分辨質譜的準確分子碎片為303.231 8和666.370 4。實驗結果發現，加入鹽酸前，松脂酸銅和松脂酸在高分辨質譜中均不能檢測到；加入鹽酸后，能夠測得溶液中存在松脂酸，其離子碎片為303.231 8(圖1-a)，但是松脂酸銅仍未能檢測到(圖1-b)。因此，松脂酸銅在加入鹽酸后，衍生轉換成為松脂酸，圖2列出了其可能的轉化途徑，確定松脂酸銅實際測定對象為松脂酸。

a-松脂酸；b-松脂酸銅圖1 松脂酸銅溶液的離子碎片Fig.1 Fragment ion of copper abietate of turpentine

圖2 松脂酸與松脂酸銅間的轉化Fig.2 Conversion between abietic acid and copper abietate

2.2 條件優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究選用甲醇、乙腈、丙酮3種常規萃取試劑對松脂酸銅進行直接提取，并設計對比實驗，對比這3種不同的提取劑對松脂酸銅的提取效果，得出回收率均未達到70%，未達到要求。故在火龍果、豇豆和杧果樣品中加入4 mol/L鹽酸和石油醚作為提取劑，旋轉蒸發后再用乙腈定容，如圖3所示，對比前3種提取方法，該方法得到回收率最高。因此，采取添加4 mol/L鹽酸和石油醚對上述3種基質中的松脂酸銅進行提取是可行的。

圖3 松脂酸銅提取劑效果對比Fig.3 Comparison of the effect of copper abietate extractant

2.2.2 提取時間的選擇

超聲時間不同，對農藥的提取效率也不同，時間過短會造成農藥提取不完全，時間過長可能會造成農藥的降解。將超聲波時間設置為5、10、15、20、25、30 min，分別上機檢測，觀察超聲時間對回收率的影響。由圖4可以看出，在10 min時松脂酸銅的提取效率最高。但在10 min之后，回收率逐漸降低，可能是由于隨著時間的增加，超聲使目標物分子碰撞速度不斷加快，直至分子鏈斷裂，分解為其他的物質。試驗進一步使用電噴霧質譜法直接進樣進行驗證，分別測試超聲10 min和超聲30 min的松脂酸溶液的一級母離子，發現在m/z為275.2的中間物信號強度增加，該中間物在超聲10 min時信號強度為7.90×104每秒計數(counts per second,cps)，在超聲20 min后信號強度為1.05×105cps。經過計算，該中間物可能為松脂酸結構發生斷裂，母體丟失2個甲基。因此，為避免超聲時間過長導致松脂酸降解，引起信號降低，本試驗選擇最佳超聲時間為10 min。

圖4 超聲時間對松脂酸銅回收率的影響Fig.4 The effect of ultrasound time on recovery rate of copper abietate

2.2.3 流動相的選擇

本研究采用0.1%冰醋酸和乙腈作為檢測松脂酸銅的流動相，分別設置流動相比例為10/90、20/80進行對比，觀察不同比例的流動相對峰形的影響以及各基質雜質峰與目標峰分離情況。從圖5和圖6可以看出，在V∶V=10 ∶90的流動相條件下，目標物出峰較快，保留時間為5.674 min；在V∶V=20 ∶80的流動相條件下，目標物出峰較慢，保留時間為6.297 min。

圖5 流動相比例V ∶V=10 ∶90時松脂酸銅色譜圖Fig.5 Chromatogram of copper abietate at 10 ∶90 mobile phase ratio

圖6 流動相比例V ∶V=20 ∶80時松脂酸銅色譜圖Fig.6 Chromatogram of copper abietate at 20 ∶80 mobile phase ratio

如圖7所示，在杧果樣品分析時，保留時間為5.875 min存在雜質干擾，導致加標回收率偏高。因此，本實驗選擇流動相比例V∶V=20 ∶80進行松脂酸銅的分析，選擇保留時間較長的色譜條件，保證目標物與雜質峰實現良好分離。

圖7 流動相比例V ∶V=20 ∶80時松脂酸銅的杧果樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of copper abietate in mango sample at 20 ∶80 mobile phase ratio

2.3 標準曲線及方法檢出限

用甲醇配制1 000 μg/mL松脂酸銅標準樣品溶液，用甲醇采用逐級稀釋法配制0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL系列標準工作液。取系列標準溶液，參照樣品處理加入鹽酸衍生和石油醚進行提取，并將石油醚濃縮干后分別用乙腈定容，得到0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL松脂酸銅標準液，利用HPLC測定各濃度下松脂酸銅的標準工作液，如圖8所示。并以工作溶液濃度(X)為橫坐標、以監測定量響應峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。松脂酸銅在0.1～2 μg/mL線性關系良好，線性回歸方程為Y=15 919X-209.22，相關系數R2為0.999 6，以定量離子響應的3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限，松脂酸銅的檢出限為0.03 mg/kg，以定量離子響應的10倍信噪比(S/N=10)確定定量限為0.1 mg/kg。

圖8 松脂酸銅各質量濃度色譜圖Fig.8 Typical chromatogram of each mass concentration of copper abietate turpentine

2.4 回收率及方法精密度

以不添加農藥的火龍果、豇豆和杧果分別作為空白樣品，進行回收率檢測。加入松脂酸銅標準品，進行添加濃度為0.4、1.0、4.0 mg/kg的3個添加回收實驗，重復處理5次，測得回收率如表1所示?？瞻讟悠返钠骄厥章蕿?7%～108%，相對標準偏差在0.8%～3.3%，這一結果滿足果蔬中農藥殘留檢測的要求。

表1 松脂酸銅加標回收率和相對標準偏差(n=5)Table 1 The recovery rate and relative standard deviation of copper abietate

2.5 實際樣品檢測

以本分析方法進行火龍果、豇豆和杧果樣品中的松脂酸銅殘留量檢測，從而驗證方法的實際應用效果。檢測結果表明，當地所出售的火龍果、豇豆和杧果樣品中均未檢出松脂酸銅殘留。

市場采購松脂酸銅農藥，按照推薦劑量稀釋300倍進行噴施，分別在施藥后2 h和安全間隔期7 d采集樣品進行分析，得到松脂酸銅在3種樣品上的初始沉積量(施藥后2 h)分別為0.129、0.181、0.158 mg/kg，在規定安全間隔期3種樣品上的松脂酸銅殘留量均小于0.1 mg/kg。使用本分析方法能有效檢測3種果蔬實際樣品中的松脂酸銅殘留，滿足3種樣品中松脂酸銅殘留分析的需求。

3 結論

松脂酸銅是松脂酸和銅的絡合物，加入鹽酸后變為松脂酸，利用高分辨質譜法測定經鹽酸衍生后的松脂酸銅，經驗證確定測定對象為松脂酸。結合相關文獻，已有研究得出合成松脂酸銅[15]以Cu(OH)2為銅源，添加甲酸，可以制得松脂酸銅。同時，也有利用HPLC檢測松脂酸[16-18]，以及松脂酸銅轉化成為松脂酸后進行測定[9]的研究，進一步證明實驗測定對象為松脂酸。

對松脂酸銅前處理實驗條件進行優化，利用高效液相色譜儀進行檢測，設置0.1%冰醋酸-乙腈為流動相，體積比為20∶80，建立了松脂酸銅的分析方法。樣品經4 mol/L鹽酸和石油醚提取，超聲10 min，蒸干后用乙腈定容，方可上機進行檢測，運用外標法計算松酯酸銅殘留量，該方法的準確度、精確度和靈敏度均符合殘留檢測要求。實驗結果表明，松脂酸在0.1～2.0 mg/L的線性范圍內，相關系數R2>0.996；根據回收率實驗，在火龍果、豇豆和杧果基質中，添加質量濃度為0.4、1.0、4.0 mg/kg時，上述果蔬基質的添加回收率均在77%～108%，說明待測物松脂酸銅在果蔬中分析方法的準確度滿足檢測分析的需求。