基于PCA-熵權TOPSIS法的漢中天麻外觀性狀與成分含量綜合評價研究*

張遠帆,王尚濤,莫 可,秦夢圓,趙生波,李菊艷,張 偉,張子龍,孫志蓉**

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488;2.寧強天麻研究所有限責任公司,陜西漢中 724400;3.寧強縣發展和改革局科技開發中心,陜西漢中 724400;4.寧強縣中藥材產業發展中心,陜西漢中 724400)

天麻為蘭科(Orchidaceae)植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖,具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功效,對頭暈頭痛、鎮靜催眠、癲癇抽搐等有顯著療效。天麻的主要產地分布在云南、湖北、貴州、陜西、安徽、四川等地[1,2],其中陜西省漢中市為西天麻的道地產區,所產天麻大多為紅天麻(G.elataBl.f.elata)[3]。漢中天麻主要產自寧強縣、勉縣和略陽縣,不同產地天麻的產量和質量有所不同,故本研究采集了以上3個地區的紅天麻作為研究材料進行測定與分析。

藥材的外觀性狀,如形狀、顏色、氣味等,往往與其內在質量密切相關,但主觀評判的標準難以統一。如今,借助電子感官儀器可以將藥材外觀特征量化,使評判更加客觀與直觀,為藥材質量與視覺、嗅覺等信息的聯系提供了可行性[4,5]。在市場中,人們普遍依據天麻外觀性狀對其質量進行評判,但是人為評判的主觀性過強,缺乏準確性[6-8]。電子鼻與分光測色儀可以準確、客觀地量化藥材氣味與顏色,常用于中藥材的鑒別與質量評價[9-12]?！吨腥A人民共和國藥典(一部)》(2020年版)(以下簡稱2020年版《中國藥典》)對天麻藥材中水分、浸出物、天麻素(Gastrodin)和對羥基苯甲醇(P-hydroxybenzylalcohol)的含量做了明確要求[2],另外巴利森苷(Parishins)在天麻中具有顯著藥理活性且含量豐富[13],所以本研究選擇以上指標進行化學成分含量測定。

主成分分析(PCA)法是一種降維數據的多元統計分析方法,在中藥研究中應用廣泛[14-16]。趙夢利等[17]利用PCA法對雞血藤(SpatholobiCaulis)飲片數據降維以觀察差異。巫曉霞等[18]利用PCA法對不同產地茯苓進行質量評價。熵權TOPSIS(Technique for Order Preperence by Similarity to an Ideal Solution)法可充分利用原始數據,且可以排除主觀因素的干擾,更客觀地篩選出綜合功能特性優良的樣本,適用于中藥質量綜合評價[19-21]。高偉城等[22]利用熵權TOPSIS法對不同產地枇杷葉質量進行綜合評價,李雨昕等[23]、史叢晶等[24]利用熵權法的灰色關聯法-TOPSIS法分別對不同產地生品、蒸品三七,知母及鹽知母進行質量評價。本研究將PCA法和熵權TOPSIS法相結合,先利用PCA法提取主成分,再通過熵權TOPSIS法計算權重并排名,能有效減少冗余的評價指標,提高多指標評價的直觀性與科學性[25,26]。

綜上,本研究對在陜西省漢中市寧強縣、勉縣和略陽縣采集到的天麻樣品進行外觀性狀、氣味、顏色、含水量、浸出物和主要有效成分含量測定,在傳統形狀指標與生物量的基礎上,結合感官量化指標與有效成分含量,利用PCA法結合熵權TOPSIS法對天麻質量進行綜合評價,探討各指標在天麻質量評價中的貢獻,為漢中天麻質量標準建立及天麻資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年10-11月在陜西省漢中市寧強縣、勉縣、略陽縣采集27份紅天麻,經北京中醫藥大學孫志蓉教授鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的塊莖。清洗后統一加工、粉碎,過65目篩,備用。樣品信息見表1。

表1 天麻樣品信息

1.2 儀器與試劑

小型粉碎機(CK-20,北京金洋利科技發展有限公司),電磁爐(21FS37-20110632,九陽股份有限公司),數顯游標卡尺(DL91150,得力集團有限公司),鼓風干燥箱(DHG-9123A,上海一恒科技有限公司),分光測色儀(CM-5,日本柯尼達美能達公司),超快速氣相電子鼻(HeraclesⅡ,法國Alpha Mos公司),自動進樣器(HS-100,法國Alpha Mos公司),高效液相色譜儀(2498,美國Waters科技有限公司),C18色譜柱(X Bridge,美國Waters科技有限公司),十萬分之一電子天平(XS205,梅特勒-托利多儀器上海有限公司),電熱恒溫水浴鍋(HH-4A,國華儀器制造有限公司),數控超聲波清洗器(KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司)。

天麻素對照品(B21243,純度≥98%),對羥基苯甲醇對照品(B20326,純度≥98%),巴利森苷A、B、C、E對照品(B20923、B20912、B2091、B20914,純度≥98%),以上6種對照品均為上海源葉生物科技有限公司生產;乙腈、無水乙醇、磷酸(色譜級,Thermo Fisher Scientific公司);純水(娃哈哈飲用純凈水,杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 外觀形狀與生物量測定

采集的鮮天麻除去腐壞、蟲蛀、不完整的塊莖,洗去外部泥土,待表面水分晾干后,觀察記錄天麻的螺環紋數,測量天麻塊莖的長度、寬度,稱量鮮重,再將其蒸至內無白心,冷卻至室溫后放入烘箱,55 ℃烘干后稱量干重。

1.3.2 顏色色度值測定

用分光測色儀進行顏色測定。測定波長為350-750 nm;測定口徑為8 mm;光源為脈沖氙燈;標準偏差ΔE*ab≤0.4;數據處理軟件為Spectra Magic NX。稱取天麻粉末適量,置于分光測定儀的培養皿中,平行測定3次,查看并記錄色度空間的明亮度(L*)、紅綠色(a*)、黃藍色(b*),由公式(1)求得總色度值E*:

(1)

1.3.3 氣味響應值測定

天麻樣品用高速粉碎機粉碎后,過24目篩,取上部較粗顆粒,按表2的條件進行檢測。

表2 電子鼻測定參數

1.3.4 水分和浸出物含量測定

水分含量參照2020年版《中國藥典》通則中的水分測定法(通則8302第二法 烘干法)測定。浸出物含量參照2020年版《中國藥典》通則中醇溶性浸出物測定下的熱浸法(通則2201)測定。

1.3.5 天麻素和對羥基苯甲醇含量測定

①色譜條件。色譜柱:Waters X Bridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈為流動相A,0.05%磷酸溶液為流動相B,A:B(3:97)等度洗脫;檢測波長:220 nm;理論塔板數不低于5 000。

②對照品溶液的制備。取天麻素和對羥基苯甲醇對照品適量,精密稱定,加乙腈-水(3∶97)混合,制成天麻素53 μg/mL、對羥基苯甲醇28 μg/mL的混合溶液,超聲使其充分溶解,即得。

③供試品溶液的制備。精密稱定過65目篩的天麻粉末2 g,置具塞錐形瓶中,精密加入50%稀乙醇50 mL,稱重,超聲處理(功率120 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,稱重,用50%稀乙醇補足減失的重量,濾過,精密量取續濾液10 mL,放置水浴鍋中濃縮近無醇味,加入乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解,轉移至25 mL容量瓶中,用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀釋至刻度,搖勻濾過,取續濾液,備用。

④標準曲線的建立。分別取5、10、15、20、25 μL的標準品溶液,按照天麻素和對羥基苯甲醇含量測定的色譜條件測定分析,以峰面積為縱坐標(y),濃度為橫坐標(x),得到線性回歸方程,標準曲線見表3。

表3 天麻素和對羥基苯甲醇的標準曲線

⑤樣品含量測定。精密吸取對照品和供試品各10 μL,按照1.3.5節①的色譜條件測定,得到天麻素和對羥基苯甲醇的峰面積并計算二者含量。

1.3.6 巴利森苷類成分含量測定

①色譜條件。色譜柱:Waters X Bridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈為流動相A,0.1%磷酸溶液為流動相B,梯度洗脫,具體見表4;流速:0.8 mL/min,柱溫:30 ℃;檢測波長:220 nm;理論板數不低于5 000。

表4 梯度洗脫程序

②對照品溶液制備。取巴利森苷A、B、C、E對照品適量,精密稱定,加50%甲醇混合溶液制成巴利森苷A 97 μg/mL、巴利森苷B 65 μg/mL、巴利森苷C 30 μg/mL、巴利森苷E 50 μg/mL的混合溶液,適當超聲溶解后,得到對照品溶液。

③供試品溶液的制備。取天麻藥材粉末約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30 min,放冷,搖勻,濾過,量取續濾液,備用。

④標準曲線的建立。分別取5、10、15、20、25 μL的標準品溶液,按照色譜條件測定分析,以峰面積為縱坐標(y),濃度為橫坐標(x),得到線性回歸方程,標準曲線見表5。

表5 巴利森苷A、B、C、E的標準曲線

⑤樣品含量測定。吸取對照品和供試品各10 μL,按照1.3.6節①的色譜條件測定,得到巴利森苷A、B、C、E的峰面積并計算各巴利森苷的含量。

2 結果與分析

2.1 不同產地天麻的外觀形狀與生物量

27份漢中天麻的塊莖長、塊莖粗、螺環紋數、鮮重與干重分別為77.6-160.0 mm、26.3-60.8 mm、11-19條、50.0-235.0 g、8.2-37.1 g,略陽縣天麻的各項指標均值最高,分別為135.5 mm、51.4 mm、16.6條、176.0 g、27.3 g,運用SPSS 20.0以及Excel 2020進行數據分析以及圖表制作,其中各地區天麻塊莖長均值無顯著差異,略陽縣天麻在塊莖粗、鮮重、干重均值上與寧強縣天麻有顯著差異,與勉縣天麻差異不顯著,勉縣天麻與寧強縣天麻差異不顯著,見圖1。由圖2,勉縣天麻的螺紋環數與寧強縣天麻、略陽縣天麻差異顯著,寧強縣天麻的螺紋環數與略陽縣天麻差異不顯著。

圖1 不同地區天麻形狀指標

圖2 不同地區天麻螺環紋數

2.2 不同產地天麻的顏色色度值

27份漢中天麻的L*和E*值變化明顯,如表6所示,二者均為勉縣>略陽縣>寧強縣,說明勉縣天麻在外觀上比寧強縣、略陽縣天麻明亮,總色度值較高;勉縣天麻的L*值較大,平均值為86.68,外觀明亮度較高。a*值以寧強縣較高,b*值以略陽縣較高,說明通過色度值大小可以區分漢中市不同地區的天麻。結合圖3,可以發現不同地區天麻色度值變化趨勢不同,其中L*和E*值變化最為明顯,說明不同地區紅天麻的外觀顏色明亮度和總色度值存在差異。

圖3 不同地區天麻色度值熱點圖

表6 不同地區天麻色度值

2.3 不同產地天麻的氣味響應值

27份漢中天麻的電子鼻氣味分析如圖4所示,不同地區天麻的氣味響應值根據產區的不同,在峰形一致的基礎上,峰強度有一定差異。

圖4 不同地區天麻電子鼻氣相色譜圖

可根據氣味響應值將漢中市不同地區天麻大致區分為4類(圖5),寧強縣大部分天麻樣品主要聚為一類,分布在黃色和綠色區域;勉縣、略陽縣天麻則在各個分類中均有分布,大部分聚集在藍色區域。3個地區天麻樣品的分布未見明顯規律,聚類分析中代表點相對分散,氣味響應值特征點較為相似。

圖5 不同地區天麻氣味響應值的聚類分析

2.4 不同產地天麻的成分含量

2.4.1 水分和浸出物含量

漢中天麻的水分、浸出物含量均達到了2020年版《中國藥典》標準(圖6)。各地區天麻的水分含量為5.6%-9.4%,浸出物含量為15.4%-28.3%,其中,略陽縣天麻水分、浸出物含量均值最高,分別為8.0%和22.0%。

圖6 不同地區天麻水分、浸出物含量

2.4.2 天麻素和對羥基苯甲醇含量

由圖7可知,不同地區天麻的天麻素含量為0.13%-0.65%,其中寧強縣天麻的天麻素平均含量最高,為0.35%。不同地區天麻的對羥基苯甲醇含量為0.02%-0.38%,其中勉縣天麻的對羥基苯甲醇平均含量較高,為0.20%。不同地區天麻的天麻素和對羥基苯甲醇的總含量為0.26%-0.68%,均達到了2020年版《中國藥典》規定標準,寧強縣天麻的2種主要有效成分平均總含量最高,達到了0.44%。此外,勉縣天麻的對羥基苯甲醇和天麻素的含量接近,2種成分含量比例和其他地區差異顯著。

圖7 不同地區天麻2種主要化學成分含量

2.4.3 巴利森苷類成分含量

不同地區間天麻中巴利森苷E、B、C、A含量測定結果如圖8所示,不同地區天麻巴利森苷E、B、C、A均值含量均為寧強縣天麻最高,分別為7.65、5.87、2.10和10.67 mg/g,總含量為26.30 mg/g。

圖8 不同地區天麻巴利森苷E、B、C、A成分

2.5 PCA-熵權TOPSIS綜合評價體系建立

利用PCA選取質量評價主成分,結合熵權法算得權重后,通過DPS數據統計軟件采用TOPSIS法對天麻樣品整體質量進行綜合評價排名。

2.5.1 PCA提取主要指標

選擇外觀性狀指標:塊莖長、塊莖寬、鮮重、干重、螺環紋數、色度值(L*、a*、b*、E*);氣味響應值指標:15、17、18、24 s峰值;化學指標:水分、浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇,巴利森苷E、B、C、A含量共21個指標。根據各指標差異系數以及相關性最終選出16個指標建立評價體系,數據標準化后進行主成分分析,如表7、表8所示。

表7 天麻外觀性狀及氣味響應值標準化數據

表8 天麻化學指標標準化數據

對各項指標數據進行KMO和Bartlett檢驗,KMO值為0.586>0.5,P<0.05,說明數據適宜進行主成分分析。如表9所示,提取出6個主成分,累計方差貢獻率達到82.415%,代表了絕大部分原始指標信息。由表10可知,第1個主成分中,塊莖長、塊莖粗、鮮重、干重載荷值較大,因此第1主成分可作為形狀與生物量的綜合體現,定性為形狀與生物量因子;同理,第2個主成分中巴利森苷E、B、C、A載荷值較大,定性為巴利森苷類因子;第3個主成分中氣味響應值載荷值較大,定性為氣味因子;第4個主成分中天麻素載荷值較大,定性為天麻素因子;第5個主成分中水分載荷值較大,定性為水分因子;第6個主成分中顏色值載荷值較大,定性為顏色因子[27]。

表9 天麻質量評價指標的特征值和累積方差貢獻率

表10 主成分在各評價指標上的因子載荷矩陣

如表11所示,將載荷系數除以對應特征根的平方根,得到主成分特征向量,構建主成分函數[以形狀與生物量因子為例,式(2)],并求得主成分矩陣[28]。

表11 主成分特征向量

Fshape &biomass=0.268×C1+0.391×C2+0.399×C3+0.370×C4-0.193×C5-0.180×C6-0.030×C7+0.200×C8+0.088×C9+0.252×C10-0.234×C11+0.081×C12-0.033×C13-0.272×C14-0.312×C15-0.253×C16。

(2)

2.5.2 熵權TOPSIS法

運用熵權法[29]計算主成分矩陣權重(表12),結合DPS統計軟件進行TOPSIS分析。其中,顏色因子、巴利森苷類因子和氣味因子所占權重較大,說明上述指標對評價結果影響較大。表13為評價結果,從中可以看出寧強縣、略陽縣天麻綜合質量較優。

表12 熵權法主成分矩陣權重

表13 綜合得分排名

3 討論

本研究在天麻傳統性狀指標的基礎上,結合有效成分含量以及顏色、氣味的定量數據對漢中不同地區天麻進行了比較分析與質量評價。在綜合評價中為了有效消除主觀影響,本研究運用PCA-熵權TOPSIS法構建了天麻質量綜合評價體系[30],且篩選出了3個重要評價指標,但由于在略陽縣、勉縣采集的樣品較少,天麻樣品范圍存在局限性,還需進一步完善與驗證。

在外觀性狀上,3個地區所產天麻的塊莖粗、螺環紋數、鮮重和干重均有一定的差異;顏色明亮度和總色度值有一定差別,通過色度值大小可以區分漢中市不同地區的天麻;不同地區天麻樣品的氣味響應值特征點較為相似。與李巧玲等[30]研究的不同產區天麻相比,漢中3縣紅天麻與湖北宜昌、安徽岳西、重慶南川紅天麻塊莖長度相近。略陽縣紅天麻鮮重及干重、勉縣紅天麻鮮重較安徽岳西紅天麻低,較湖北宜昌、重慶南川高。寧強縣紅天麻鮮重較安徽岳西、重慶南川低,較湖北宜昌高。勉縣紅天麻干重較安徽岳西低,較湖北宜昌、重慶南川高。寧強縣紅天麻干重較安徽岳西低,較湖北宜昌高,與重慶南川相近[31]。

在化學成分上,漢中天麻中水分、浸出物含量均符合2020年版《中國藥典》標準,寧強縣天麻的天麻素和對羥基苯甲醇的總含量在3縣天麻中最高,平均總含量達到了0.44%,勉縣、略陽縣總含量為0.40%左右,與其他文獻研究結果基本一致[32,33]。勉縣天麻中天麻素和對羥基苯甲醇含量接近,2種成分含量比例和其他地區差異顯著。3縣天麻中寧強縣天麻的巴利森苷E、B、C、A及總含量均為最高。與張衛等[33]研究的貴州天麻相比,漢中3縣紅天麻水分含量與貴州紅天麻相近,浸出物含量更低。與薛華麗等[34]研究的雪峰山區域不同產地天麻相比,漢中3縣紅天麻浸出物含量與湖南洪江、溆浦以及湖北羅田等地紅天麻相近,天麻素及對羥基苯甲醇總含量與湖南紅天麻相似,較湖北紅天麻含量高。此外,與周媛等[35]研究的安徽金寨紅天麻相比,漢中3縣紅天麻的天麻素含量較低,對羥基苯甲醇、巴利森苷E含量較高;寧強縣紅天麻的巴利森苷B含量較高,勉縣、略陽縣紅天麻較低;巴利森苷C含量方面,寧強縣紅天麻與安徽金寨天麻相近,勉縣、略陽縣較低。與王慶等[36]研究的西南不同產區紅天麻相比,寧強縣紅天麻的天麻素含量較云南昭通、四川廣元紅天麻低,較貴州大方紅天麻高,與貴州德江紅天麻相近,勉縣、略陽縣較低;對羥基苯甲醇含量方面,勉縣紅天麻較高,寧強縣、略陽縣紅天麻較四川廣元紅天麻低,較貴州德江紅天麻高,與云南昭通、貴州大方紅天麻相近。

田孟華等[37]表示可將巴利森苷A、巴利森苷E作為烏天麻(G.eletaBl.f.glaucaS.Chow)與其他天麻品種差異性分析的標志物。巴利森苷類化合物有生理活性和多種藥理作用,且與天麻素之間存在相互轉化的關系[4,13],間接提高天麻素含量。張琦[5]在分析引種前后天麻6種主要活性成分含量變化時,發現引種后天麻中天麻素、巴利森苷A、B、C含量有明顯的相關性。由此可見,在對天麻開展質量評價時,可將巴利森苷類成分含量納入評價指標。在本研究建立的評價體系中,顏色因子、氣味因子、巴利森苷類因子權重較大,說明在質量評價中應重視上述指標。

4 結論

本研究采用PCA結合熵權TOPSIS法對漢中天麻整體質量進行了綜合評價,探究了天麻外觀性狀與內在成分指標所占權重,發現顏色、氣味、巴利森苷類因子權重較大,應注重上述指標在質量評價中的重要性,在此評價體系下,寧強縣、略陽縣天麻排名靠前。本研究為天麻質量評價提供了參考,也為進一步的分析研究提供了理論基礎,從而使評估天麻質量的因素可以被更加科學地把握。