牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的活性抑制及作用機制

吳文慧，田雨純，牛吉祥，何 瑞

（晉中信息學院食品與環境學院，山西晉中 030805）

黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）為尖孢鐮孢菌黃瓜?；筒≡?，通過土壤傳播，侵染植物維管組織，是黃瓜在生產過程中具有毀滅性的病原之一[1]。該菌為白色氣生菌絲，色澤呈淡青紫色或淡褐色。小型分生孢子長橢圓形，無色，單孢或偶爾雙孢；大型分生孢子紡錘形，無色，多為3個隔膜，頂端細胞較長[2]。

黃瓜枯萎病發生在黃瓜的整個生長期，開花期與結果期發病最為嚴重，導致黃瓜植株部分或全部枯萎[3]。我國共有100多個黃瓜品種受害，每年損失高達100億元。生產上防治黃瓜枯萎病的方法主要有輪作倒茬、種植抗性品種、與抗性品種鉆木嫁接及施用化學藥劑等，雖然取得了一定的防治效果，但也存在著優質抗性品種資源缺乏、嫁接育苗成本較高、化學藥劑污染環境及防治效果差等諸多弊端[4-6]。使用農藥雖然可以有效地防控作物病蟲草害，提升作物的產量和品質，但同時也可能造成嚴重的有害生物抗藥性發生、化學農藥殘留超標和病蟲草害再猖獗等“3R”問題。近年來，隨著對食品與環境安全領域的重視，植物源殺菌劑的研究引起了相關學者的高度重視。植物源殺菌劑的成分主要來源于植物，具有高效、無毒或低毒、無抗藥性、殺菌譜廣、與環境相容等優點[7]。Meena等[8]發現紫莖澤蘭葉提取物對番茄早疫病菌具有抑制作用；孟雅君[9]發現蒲公英甲醇萃取物對黃瓜枯萎病菌具有較好的抑制效果，這些研究都為植物源殺菌劑的開發提供了良好的理論基礎。

牡丹皮又稱為牡丹根皮、丹皮、丹根，是毛茛科植物（Paeonia suffruticosa Andr.）牡丹的干燥根皮，主要產自湖南、湖北、安徽、四川、甘肅、陜西等地，其中以湖南、安徽產量最大。牡丹皮呈圓筒狀或半筒狀，外表為灰褐色或黃褐色，有較多的橫長皮孔和細根痕，質硬而脆[10]。牡丹皮中含有單萜類、酚及酚苷類、三萜及甾體類和有機酸及有機酸酯類等化合物[11]，主要成分包括丹皮酚、丹皮酚苷、芍藥苷、丹皮酚原苷等，其藥理作用表現在抗腫瘤、增強免疫力、抗菌作用、抗心律失常與改善機體微循環等方面[12]。朱立成等[13]以5種植物病原菌為供試對象，測定了牡丹皮等16種中草藥的抑菌作用，發現牡丹皮丙酮提取物對所有供試的植物病原菌菌絲生長都有抑制效果，且抑菌率最高為100%，表明牡丹皮對植物病原菌的抑制作用具有廣譜性。

本文以牡丹皮為材料，利用乙醇提取抑菌活性成分，并對黃瓜枯萎病菌的活性抑制和機理進行初步探討，以為開發新型農藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用牡丹皮購自陜西省商洛市千草行農副產品有限公司；黃瓜枯萎病菌（尖孢鐮孢菌黃瓜?；虵usarium oxysporum f.sp.Cucumerinum）由山西農業大學植物保護學院植物病理實驗室提供。

1.2 試劑和儀器

（1）試劑：95%乙醇、葡萄糖、瓊脂粉。

（2）其他耗材：馬鈴薯、濾紙、紗布。

（3）儀器：酒精燈、MC-CLC2202電磁爐，廣東美的生活電器電磁爐制造有限公司；打孔器、鑷子、BSA224S電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；RE-52AA真空旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；DI-離子交換機純水系統，上海和泰儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺、BGZ-146電熱鼓風干燥箱、BGZ-250光照培養箱、YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；100～1 000 μL移液槍，濟南鑫貝西生物技術有限公司；CX31-32C02光學顯微鏡，奧林巴斯；DDS-11A電導率儀，成都世紀方舟科技有限公司；752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SC-3610低速臺式離心機，安徽中科中佳科學儀器；HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；SXT-02索氏提取器，上海洪紀儀器設備有限公司；XA-1固體樣品粉碎機，金壇區億通電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備牡丹皮乙醇提取物濃縮液

將牡丹皮經粉碎機磨碎過150目篩，稱取14 g牡丹皮粉末與210 mL 75%乙醇溶液按體積比1∶15分別裝入索氏提取器內，開啟電熱套，加熱燒瓶至乙醇沸騰，提取2 h，得到初提液，置于旋轉蒸發儀中60℃進行濃縮，濃縮液置于蒸發皿中用酒精燈加熱，待出現黏稠膏狀物即得到乙醇提取物，對提取物進行標記后放于冰箱內保存備用。

1.3.2 菌種活化

黃瓜枯萎病菌在4℃冰箱中保存。抑菌效果測定前，在無菌操作條件下，使用接種環從保存在試管中馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）斜面上挑取菌種的菌絲，接種于PDA平板上進行28℃黑暗培養，活化菌種。

1.3.3 培養基的制備

馬鈴薯葡萄糖水培養基（PDB）：稱取200 g馬鈴薯去皮洗凈，切成小塊，放入燒杯中加水1 000 mL，在電磁爐上加熱20～30 min煮爛（至薯塊能被玻璃棒戳破即可），用4層紗布過濾，稍冷卻后補足水分至1 000 mL，加入20 g葡萄糖并溶解。

PDA：在含20 g葡萄糖的PDB培養基中加入15 g瓊脂。

全部混勻后分裝至250 mL的三角瓶內，包扎封口。121℃、0.1 MPa下高壓滅菌20 min。

1.3.4 加藥培養基的制備

取等量的牡丹皮乙醇提取物濃縮液，加水稀釋至100、125、150、200、250 mg/mL得到藥液并裝入試管保存。用移液槍吸取1 mL不同質量濃度的藥液轉移至滅菌的培養皿中，再向培養皿中加入9 mL融化的PDA培養基，得到質量濃度為10、12.5、15、20、25 mg/mL的加藥PDA培養基，每組設置3次重復，對照組為1 mL無菌水和9 mL融化的PDA培養基。

1.3.5 牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法，利用打孔器從長勢良好的病原菌菌落邊緣取直徑為5 mm菌餅，放置在加藥PDA培養基平板中央，以無菌水等量添加的PDA培養基平板作為對照，每個質量濃度重復3次，對應3皿PDA培養基平板，在恒溫培養箱中28℃分別黑暗培養48 h和72 h后，用游標卡尺十字交叉法測量PDA培養基平板上菌落直徑，計算牡丹皮乙醇提取物每個質量濃度處理對菌絲生長的抑制率：

1.3.6 黃瓜枯萎病菌菌絲體細胞膜完整性

1.3.6.1 電導率的測定

改進孟雅君[9]的方法，測定黃瓜枯萎病菌菌絲體的胞外電導率。使用打孔器取直徑為5 mm的菌餅接種于50 mL PDB培養基中，在26℃轉速120 r/min下培養5 d，使用鑷子將濕菌絲取出，用蒸餾水沖洗2～3次后放于培養皿中，80℃干燥箱烘干。取等量的牡丹皮乙醇提取物濃縮液，加無菌水稀釋至10、12.5、15、20、25 mg/mL，將1.5 g烘干的菌絲和10 mL稀釋液共同置于20 mL離心管內，對照添加等量的無菌水，每個質量濃度設3次重復，置于恒溫培養箱中26℃下黑暗培養0、1、2、3、12、24、48 h，用電導率儀測定培養0、1、2、3、12、24、48 h各處理組液體的胞外電導率。

1.3.6.2 核酸與蛋白質泄漏水平測定

改進翁甜等[14]的方法，黃瓜枯菌病菌菌絲體在28℃的恒溫培養箱中黑暗培養6 h后，取10 mL液體放入離心管中，以6 000 r/min的速度離心5 min，取上清液采用紫外分光光度計分別測定260 nm、280 nm波長的吸光度（A260nm、A280nm），以表征菌絲體核酸與蛋白質的泄漏情況。

2 結果與分析

2.1 牡丹皮乙醇提取物濃縮液對黃瓜枯萎病菌的活性抑制

從表1可知，黃瓜枯萎病菌在加了牡丹皮乙醇提取物的PDA培養基平板上培養48 h后，牡丹皮的乙醇提取物對供試病原菌表現出一定的抑菌效果，隨著質量濃度的增加，病原菌菌落直徑逐漸減小，其抑菌效果逐漸增加，當質量濃度為10.0 mg/mL時病原菌菌落直徑為1.60 cm，抑菌率為54.17%，抑菌效果最差；當質量濃度為25.0 mg/mL時，病原菌菌落直徑為0.69 cm，抑菌率為92.08%，抑菌效果最好。當黃瓜枯萎病菌在加了牡丹皮乙醇提取物的PDA培養基平板上培養72 h后，牡丹皮乙醇提取物表現出的抑菌效果與培養48 h的抑菌效果一致，各處理組的病原菌菌落直徑均有增加，表明牡丹皮乙醇提取液質量濃度為25.0 mg/mL時對黃瓜枯萎病病原菌抑制效果最好。此外，不同質量濃度的牡丹皮乙醇提取液對黃瓜枯萎病菌均有抑制作用，隨著乙醇提取物濃縮液質量濃度的增加，抑制率越高，抑菌效果越好。

表1 牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的活性抑制

2.2 牡丹皮乙醇提物對黃瓜枯萎病菌菌絲細胞膜透性的影響

2.2.1 電導率變化

如表2所示，經不同質量濃度的牡丹皮乙醇提取物濃縮液處理后，黃瓜枯萎病菌菌絲的電導率隨處理時間的延長而呈上升趨勢。處理3 h后，對照組與處理組之間存在顯著差異（P＜0.05）。隨著處理時間的延長，牡丹皮乙醇提取物質量濃度越高，黃瓜枯萎病菌菌絲體電導率越高，表明牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌細胞膜的破壞作用越大。

表2 不同牡丹皮乙醇提取物濃縮液質量濃度對黃瓜枯萎病菌菌絲體電導率的影響

2.2.2 核酸和蛋白質泄露水平

（1）核酸。如圖1所示，牡丹皮乙醇提取物會導致黃瓜枯萎病菌菌絲體核酸的泄漏。處理6 h，對照組核酸無明顯泄漏，而經牡丹皮乙醇提取物處理的菌絲體核酸泄漏量明顯上升，始終高于對照組。牡丹皮乙醇提取物濃縮液質量濃度為25 mg/mL時泄漏量最高，表明牡丹皮乙醇提取物破壞了菌絲體細胞膜，促進了菌絲體內核酸的外泄，且隨著質量濃度的上升，泄露量逐漸升高。

圖1 牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲體核酸泄漏的影響

（2）蛋白質。如圖2所示，牡丹皮乙醇提取物會導致黃瓜枯萎病菌菌絲體蛋白質的泄漏。在牡丹皮乙醇提取物接觸黃瓜枯萎病菌菌絲體6 h時，對照組蛋白質無明顯泄漏，而經牡丹皮乙醇提取物處理的菌絲體蛋白質泄漏量明顯上升，始終高于對照組。牡丹皮乙醇提取物濃縮液質量濃度為25 mg/mL時蛋白質泄漏量最高，表明牡丹皮乙醇提取物破壞了菌絲體的細胞膜，促進了菌絲體內蛋白質的外泄，且隨著牡丹皮乙醇提取物濃縮液質量濃度的上升，泄露量逐漸升高。

圖2 牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲體蛋白質泄漏的影響

2.3 菌絲形態

質量濃度為10.0 mg/mL的牡丹皮乙醇提取物濃縮液培養4 d之后，在40倍顯微鏡下觀察菌絲形態（圖3），發現處理組中的菌絲生長出現了膨脹畸變等現象（圖3（a）），對照組的菌絲則生長正常，菌絲體細長且分枝較多，整體呈現光滑狀態（圖3（b）），說明處理組中藥物對菌絲生長抑制作用較為明顯。

圖3 10.0 mg/mL 的牡丹皮提取物濃縮液對黃瓜枯萎病菌菌絲形態的影響（40 倍顯微鏡）

3 結語

本文研究了牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的活性抑制和機制。牡丹皮乙醇提取物在質量濃度為10～25 mg/mL時，對黃瓜枯萎病菌具有不同程度的抑制作用，且隨著質量濃度的升高抑菌作用不斷增強，最小抑菌質量濃度為10.0 mg/mL。經質量濃度為25.0 mg/mL的牡丹皮乙醇提取物處理，黃瓜枯萎病菌菌落直徑顯著降低，48 h后其抑菌率為92.08%。通過光學顯微鏡觀察發現，牡丹皮乙醇提取物處理后的黃瓜枯萎病菌菌絲體的形態和結構發生了褶皺、腫大畸形、斷裂等現象，而空白對照組則是菌絲形態正常，生長旺盛，進一步證明了牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌的抑制作用。

細胞膜是真菌組織結構的一部分，是細胞與周圍環境進行物質交換和信息傳遞的通道和屏障，其通透性和完整性在細胞進行正常生理活動中具有重要的作用，細胞膜也是常見的抗真菌劑的重要作用靶標[15-16]。大量研究表明，真菌細胞膜是植物活性物質（活性物質不止包括抑菌活性物質，還可能包括其他）的重要作用靶位，植物抑菌活性物質能改變菌體細胞膜的穩定性，導致細胞膜結構受損，內含物外滲，從而達到殺菌或抑菌的效果[17-19]。

牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲體的細胞膜有破壞作用，不同濃度牡丹皮乙醇提取物對黃瓜枯萎病菌電導率的上升幅度處理組比空白組大，可以推斷牡丹皮乙醇提取物破壞了細胞膜結構的完整性，使得細胞膜通透性加大，且隨著濃度的升高，細胞質離子穩態遭到破壞，電解質泄漏，電導率上升，細胞質膜的屏障損壞，造成內部一些重要的離子流出，并導致一些重要的酶失去作用，從而影響菌體的物質代謝和繁殖[20-21]。

260 nm和280 nm分別是核酸和蛋白質的特征波長，在處理6 h后，隨著牡丹皮乙醇提取物濃縮液質量濃度的升高與作用時間的延長，A260nm、A280nm顯著升高，說明牡丹皮乙醇提取物與菌體細胞膜結合后，改變了細胞膜的結構，導致細胞質流失，引起細胞內核酸和蛋白質的泄露。

近年來，各種化學殺菌劑的大量使用，造成植物病原菌的抗藥性增強且土壤板結、土壤鹽堿化等諸多污染問題，綠色環保、安全高效的植物源性殺菌劑的開發逐漸成為植物保護領域研究的重點。

綜上所述，牡丹皮乙醇提取物具備成為植物源殺菌劑的潛力。而對于牡丹皮其他溶劑提取物的抑菌活性、牡丹皮乙醇提取物對于不同作物病原菌是否具有更高的抑菌活性、牡丹其他部位的乙醇提取物抗菌活性效果以及在田間應用性等方面均有待進一步研究。