蘋果炭疽葉枯菌毒素鈍化藥劑的篩選

于 鑫，劉志揚，劉煥星，張清明，練 森，李保華，李平亮*

（1.青島農業大學植物醫學學院，山東青島 266109；2.山東省高校植物病蟲害綠色防控工程研究中心，山東青島266109）

蘋果炭疽葉枯?。╝pple Glomerella leaf spot）是由炭疽葉枯病菌（Glomerella cingulata）侵染引起，可快速引起葉片大范圍發黃、干枯與非正常落葉，果實出現褐色壞死斑，嚴重降低了嘎啦、金冠等蘋果品種的產量和質量[1-2]。蘋果炭疽葉枯病的潛育期很短，果樹染病后，尚無真正的特效藥劑阻止病害的蔓延，目前防治手段主要是發病前（雨季前）連續進行保護性施藥，藥劑主要有吡唑醚菌酯、戊唑醇、甲基硫菌靈、代森錳鋅、波爾多液等[3-4]。然而，為持續防控蘋果炭疽葉枯病，每個生育周期需要噴施藥劑最多達15次，由此帶來的蘋果膳食風險和環境污染問題難以忽視。鑒于此，目前對其防控新技術的需求較為迫切。

在病原真菌入侵寄主植物的過程中，可產生細胞壁降解酶、毒素、激素等物質，破壞植物的組織結構，干擾植物的代謝過程，降低植物的免疫能力。其中，毒素被認為是與病程關系密切、誘發植物病害的重要致病因子[5-6]。因此，對蘋果炭疽葉枯病的防治，應充分重視致病毒素這一重要因子，推進以病菌毒素為靶標的藥劑的相關研究。鈍化、抑制或中和植物病原真菌毒素，干擾植物病原菌與寄主之間的聯系，可為病害的高質量防控提供新的思路和途徑，但目前尚未有采用毒素鈍化方式防治蘋果炭疽葉枯病的相關研究報道。

對于毒素鈍化藥劑的研究目前已取得一些進展：①代森錳鋅、硫酸鋅、麥芽糖等可鈍化玉米大斑病菌毒素[7]；②鉬酸鈉、檸檬酸、L-脯氨酸、L-色氨酸等化合物可以鈍化煙草赤星病菌毒素[8-9]；③硫酸銅、硫酸錳、煙酸等可鈍化瓜類枯萎病菌毒素[10]；④高錳酸鉀、碳酸鈉可鈍化番茄灰霉病菌毒素[11]。蒲麗冰[12]采用毒素鈍化劑（Fe2SO4·7H2O+EDTA·Na2）處理栽種香蕉苗的土壤，結果顯示土壤中香蕉枯萎病菌毒素含量明顯降低，病情指數也顯著低于對照。史祥鵬等[13]以嘎啦葉片為材料，采用針刺接種法對蘋果炭疽葉枯病菌產生毒素條件進行了研究，結果表明：①改良的Richard液體培養基中產生的毒素活性最高。②粗毒素多數成分易溶于水相，極性較強。③乙醇或甲醇沉淀處理后，上清液對葉片具有毒害作用，而接種沉淀未產生明顯癥狀，表明毒素屬于小分子化合物。④添加外源物質可改變蘋果炭疽葉枯病的發病進程。因蘋果炭疽葉枯病菌侵染引起的快速落葉與葉片中乙烯的過量產生有關，乙烯生物合成抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸的特定劑量處理可明顯減少病菌侵染引起的葉片脫落[14]。

基于已有的研究成果，本文以炭疽葉枯病菌粗毒素和嘎啦蘋果葉片為生測材料，選取9種植物生長調節劑（或植物激素）和19種鹽作為候選毒素鈍化藥劑，通過毒素單獨處理、毒素-鈍化劑混合處理葉片的方式，篩選出可用于鈍化炭疽葉枯病菌毒素的藥劑，并探討了鈍化劑的病害防治效果，研究成果可為病菌毒素靶標藥劑的開發提供參考。

1 試驗材料

（1）供試菌株：病菌菌株分離自青島農業大學膠州基地自建蘋果園發病的嘎啦蘋果葉片，經單孢分離、純化后，鑒定為炭疽葉枯病菌，菌株編號為WT 030206。

（2）生測材料：健康嘎啦葉片取自青島農業大學自建蘋果園，葉片摘取后立即進行生測試驗。

（3）候選的鈍化藥劑：9種植物生長調節劑（吲哚丁酸、吲哚乙酸、噻苯隆、α萘乙酸、蕓苔素內酯、2，4-D、6-BA、赤霉素、復硝酚鈉），19種鹽（碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、丙酸鈉、氯化鐵、硫酸亞鐵、鉬酸鈉、檸檬酸、硝酸鈉、硫酸鋅、高錳酸鉀、碘化鉀、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸錳、氯化鎂、碳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鐵、苯甲酸鈉），均為分析純試劑或農藥原藥，分別購自國藥集團化學試劑有限公司、上海麥克林生化科技股份有限公司、上海源葉生物科技有限公司、北京索萊寶科技有限公司等。將28種物質分別配制成質量濃度為5 000 mg/L的水溶液，水溶性差的植物生長調節劑先用少量甲醇溶解再溶于水，必要時滴加表面活性劑吐溫80，但甲醇和吐溫80體積占比需小于0.5%。

2 試驗方法及討論

2.1 粗毒素的制備方法

粗毒素的制備是鈍化劑篩選試驗的前提。本文以Richard病菌培養液作為粗毒素的來源，經紗布過濾、高速離心、液液萃?。ㄒ宜嵋阴?、正丁醇溶劑）與濃縮后，對葉片的致病活性進行測定。結果發現兩種溶劑濃縮后的溶液活性遠低于發酵濾液本身，猜測是提取過程中未能將一些致病物質提取完全，失去了部分重要的致病物質，或改變了關鍵成分的化學性質，因而難以采用該方法提取粗毒素。

理論上病菌培養液直接使用活性最高，但培養液含有病菌菌絲與孢子，無法分辨癥狀是病菌侵染導致還是毒素物質誘發。進一步地，經高速離心（4℃，12 000 r/min，20 min）、微生物過濾器（0.22 μm微孔濾膜）過濾兩步處理后進行顯微觀察，結果顯示濾液中不含病菌的菌絲、孢子；將濾液涂抹于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養基，培養5 d后未發現生長的病菌，因此認為該處理手段可以排除病菌對粗毒素活性的干擾?？紤]制備過程的簡易性、濾液的活性及其干擾因素，最終采用培養10 d的Richard病菌培養液濾液作為粗毒素。

制備濾液需經過3個步驟：紗布過濾、高速離心和0.22 μm微孔濾膜過濾。即將炭疽葉枯病菌接種于PDA培養基后，在25℃和黑暗條件下培養至菌落直徑達培養皿直徑的3/4（約3 d）。借助打孔器（直徑5 mm）在菌落邊緣取菌餅10個，接種于含有改良Richard液體培養基的三角瓶，以空白培養液加入空白PDA培養基菌塊作為對照。將接入菌餅的三角瓶放置于搖床，在溫度為25℃、轉速150 r/min、無光照的條件下培養10 d。用4層紗布過濾培養液中的菌絲球，濾液在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min。取上清液分別采用微生物過濾器（0.22 μm微孔濾膜）過濾，以濾液作為病菌的粗毒素，裝入玻璃容器，置于4℃冰箱保存。

2.2 鈍化劑的篩選方法及結果

2.2.1 篩選方法

采用離體葉片-針刺處理法篩選病菌毒素的鈍化劑。選取無傷痕的健康嘎啦蘋果葉片，先用酒精擦拭消毒，之后在葉脈兩側用大頭針造傷形成針眼。造傷后迅速將2片濾紙片（直徑3 mm）貼至造傷口處，使針眼處于中心位置。接著使用移液槍在濾紙片上緩慢滴加20 μL的粗毒素溶液。葉片轉移至含水保濕的培養盒，并放置于溫度為25℃的培養箱，進行黑暗培養。等待毒素處理12 h 后，同樣借助移液槍將候選鈍化藥劑溶液20 μL緩慢滴加至濾紙片。待毒素顯癥后（3 d）觀察并拍照，用刻度尺量取病斑直徑（cm），每個處理設置3個重復。根據文獻報道[10-12]以及植物激素的作用特點，鈍化藥劑質量濃度設置為：植物激素類物質為10和100 mg/L，鹽類物質為200和1 000 mg/L。采用添加鈍化劑前后毒素處理病斑直徑的抑制率來表示鈍化藥劑的效果：

2.2.2 篩選結果

28種候選藥劑進行鈍化劑篩選后，各藥劑對毒素病斑的抑制率如表1所示。由表1可見：①各植物生長調節劑具有一定的毒素鈍化活性，除吲哚丁酸、吲哚乙酸外，一般均為較高質量濃度（100 mg/L）鈍化劑的病斑抑制率較高；②多數鹽也具有一定的毒素鈍化活性，能夠抑制毒素造成的病斑，僅苯甲酸鈉可增加病斑直徑；③相比較而言，復硝酚鈉和丙酸鈉在植物生長調節劑、鹽兩個類別中的表現較為優異，低質量濃度（10 mg/L）和高質量濃度（100 mg/L）處理均可顯著鈍化毒素活性，較高質量濃度時的抑制率分別為77.6%和88.7%。因此，復硝酚鈉、丙酸鈉可作為最優鈍化劑的候選。兩種藥劑對對粗毒素鈍化效果的代表性照片見圖1。

圖1 復硝酚鈉和丙酸鈉對炭疽葉枯病菌粗毒素的鈍化效果

表1 28 種候選藥劑對炭疽葉枯菌粗毒素病斑的抑制率

根據趙光耀等[7]的研究，藥劑對植物病原菌毒素鈍化的主要機理是通過中和、抵消病菌毒素造成的毒性效應，而起到對植物的解毒、恢復作用，但對復硝酚鈉和丙酸鈉鈍化作用的研究還缺乏相應的報道，只能根據其特點進行推測：①兩種藥劑從化學結構上看均無較強的氧化、還原和絡合等作用，因而直接作用于毒素分子結構的可能性不大；②作為5-硝基愈創木酚鈉、鄰硝基苯酚鈉、對硝基苯酚鈉混合而成的植物生長調節劑，復硝酚鈉具有很強的植物滲透和細胞賦活作用[15]，因而其鈍化作用可能來自其對毒素-植物互作過程的干擾，使毒素無法產生正常的致病效應；③丙酸鈉是一種可用作食品防腐劑、分子結構簡單的鹽，目前還未有其與植物互作的相關報道，鈍化的機理尚無法推測。

由于蘋果炭疽葉枯病在6—9月均可能流行，而該期間溫度變化較大，可能影響鈍化藥劑的適用性。采用離體葉片-針刺處理法測定質量濃度分別為100和1 000 mg/L時，不同溫度（15、25、30和35℃）復硝酚鈉、丙酸鈉的鈍化效果，見圖2。由圖2可知：①15℃條件下兩種物質的鈍化效果無明顯區別，葉片均沒有產生壞死斑；②在25、30和35℃條件下，復硝酚鈉對粗毒素的鈍化作用強于丙酸鈉，猜測可能是毒素活性隨著溫度的升高而增強，造成兩種物質的鈍化效果變弱。由此可見，復硝酚鈉的鈍化效果相對穩定。此外，復硝酚鈉是常見的植物生長調節劑，已在農業上廣泛使用，且價格便宜，更適于田間實際應用。因此，最終以復硝酚鈉作為最優的炭疽葉枯病菌毒素鈍化藥劑。

圖2 不同溫度條件下復硝酚鈉和丙酸鈉對炭疽葉枯病菌粗毒素的鈍化作用

2.3 鈍化藥劑的病害防效測定

選取健康無病的嘎啦蘋果果樹，將之移到果園溫室隔離并單獨接菌，防止病菌傳染至其他果樹。選取長有6～10片健康無病斑葉片的枝條若干，分成兩部分，一部分進行保護作用的藥效試驗，一部分進行治療作用的藥效試驗，掛牌標記。用作混配的殺菌劑選用山東康喬生物科技有限公司提供的25%吡唑醚菌酯懸浮劑，用蒸餾水配制成溶液。

保護性施藥：先用小型噴壺噴灑10 mg/L的復硝酚鈉水溶液、100 mg/L的復硝酚鈉水溶液、100 mg/L復硝酚鈉和100 mg/L的吡唑醚菌酯混合水溶液，至葉片液體成滴流下為止；12 h后，噴灑濃度為1.0×105CFU/mL的炭疽葉枯病菌孢子懸浮液，至葉片液體成滴流下為止。用塑料袋包裹枝條，保濕培養以利發病，3 d后觀察。隨機選擇6個葉片進行病斑數的統計和拍照。

治療性施藥：先用小型噴壺噴灑濃度為1.0×105CFU/mL的炭疽葉枯病菌孢子懸浮液，至葉片液體成滴流下為止，用塑料袋包裹枝條；12 h后取下塑料袋，分別噴施10 mg/L的復硝酚鈉水溶、100 mg/L的復硝酚鈉水溶液、100 mg/L復硝酚鈉和100 mg/L吡唑醚菌酯混合水溶液，至葉片液體成滴流下為止。用塑料袋重新包裹枝條，3 d后觀察。隨機選擇6個葉片進行病斑數的統計和拍照。

以上藥效試驗，以僅噴灑蒸餾水的枝條作為空白對照，以僅噴灑炭疽葉枯病菌孢子懸浮液的枝條作為發病對照，每組處理均設置3個重復。藥劑的防效計算公式為

2.4 鈍化劑對病菌生長的影響測定

2.4.1 菌絲生長速率法

將供試的炭疽葉枯病菌菌株接種于PDA平板上，25℃恒溫培養5 d作為菌源。用無菌水將復硝酚鈉配制成系列濃度，混入融化的PDA培養基，使培養基中復硝酚鈉質量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L，快速搖勻，將其倒入直徑為6 cm的培養皿，每個質量濃度設置3個重復皿。待PDA凝固后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，并接種PDA培養基，以加無菌水的PDA培養基為對照組。將培養基置于無光照的25℃培養箱中培養5 d，采用十字交叉法測量各處理組菌落的直徑。

2.4.2 孢子萌發法

在超凈工作臺內，將復硝酚鈉溶液加入10 mL融化的水瓊脂培養基，使其質量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L，以不加藥劑的處理作為對照。將培養基倒于直徑為70 mm的培養皿，待其凝固后，用移液槍吸取70 μL炭疽葉枯病菌孢子懸浮液（濃度為3×106CFU/mL）在培養皿上均勻涂布，每組設置3個重復。25℃黑暗條件下培養4 h后，在顯微鏡下觀察，芽管長于孢子囊直徑則視為萌發。每個培養皿隨機選取顯微鏡下的5個視野，進行觀察、計數，并計算各處理組的孢子萌發率：

2.5 鈍化劑的安全性

為了驗證鈍化藥劑施用的安全性，配制5 L質量濃度為100 mg/L的復硝酚鈉水溶液，在無風的下午，借助小型電動噴霧器，對3棵長勢相近的健康嘎啦蘋果樹進行噴灑，至液體成滴流下時止。以噴灑純水的3棵鄰近果樹作為對照。用隔板和塑料袋隔離包括對照組在內的其他果樹。施藥后第3天、第7天和第14天分別觀察果樹的長勢以及枝條、葉片的狀態，以確定該濃度的藥劑噴施是否引起果樹藥害。

3 結果與討論

3.1 復硝酚鈉對病害防治效果

將復硝酚鈉應用于蘋果炭疽葉枯病的防治中，測定其保護、治療性施藥的防效。根據病斑統計結果：①保護性施藥3 d后，發病對照組病斑數分別為14.6±2.7，復硝酚鈉10 mg/L組、復硝酚鈉100 mg/L組、復硝酚鈉100 mg/L＋吡唑醚菌酯100 mg/L組的病斑數分別為5.2±1.8、0和0，三者的防效分別為（64.2±11.7）%、100%和100%；②治療性施藥3 d后，發病對照組病斑數分別為16.5±4.5，復硝酚鈉10 mg/L 組、復硝酚鈉100 mg/L 組、復硝酚鈉100 mg/L＋吡唑醚菌酯100 mg/L組的病斑數分別為4.0±2.4、0.3±0.5和0.2±0.4，三者的防效分別為（76.5±13.9）%、（98.0±3.0）%和（99.0±2.4）%。以上結果表明：①質量濃度為10 mg/L的復硝酚鈉水溶液具有一定的保護和治療效果，但不能完全抑制病害的發生；②質量濃度增加至100 mg/L時，保護和治療防效均接近100%，防效相對理想；③100 mg/L的復硝酚鈉水溶液加入質量濃度為100 mg/L的吡唑醚菌酯，防效保持在100%左右，顯示兩者可以混用。三者處理防效的照片見圖3。由于本文采用炭疽葉枯病菌孢子懸浮液噴灑，在理想環境條件下控制葉片發病，與田間病害發病過程可能有所區別，所以復硝酚鈉在果園中的實際防效需要進一步驗證。

圖3 各質量濃度復硝酚鈉噴施對蘋果炭疽葉枯病的保護和治療效果

由于復硝酚鈉主要作用于病菌毒素，無法抑制病菌本身，故在實際病害防治中復硝酚鈉適宜于與殺菌劑混用，分別負責鈍化毒素和抑制病菌繁殖，協同保護蘋果葉片?？梢哉J為，預防或治療蘋果炭疽葉枯病可使用質量濃度為100 mg/L的復硝酚鈉，而加入質量濃度為100 mg/L的殺菌劑吡唑醚菌酯時防效更有保證。植物生長調節劑因其對作物的誘導抗逆能力，常用來輔助防控植物病害，如杧果采收前噴施復硝酚鈉可以有效降低炭疽病和蒂腐病的發生[16]。因此，本文篩選的復硝酚鈉在蘋果炭疽葉枯病的防治方面具有一定的理論基礎、實際應用潛力與可拓展價值。

3.2 復硝酚鈉對病菌生長發育的影響

鑒于復硝酚鈉有可能直接對炭疽葉枯病菌發生作用，故無法確定其是否通過鈍化毒素的方式防治蘋果炭疽葉枯病。對此，本文研究了復硝酚鈉對炭疽葉枯病菌菌絲生長和孢子萌發的影響，結果見表2。由表2可知，與對照組相比，復硝酚鈉各個質量濃度對炭疽葉枯病菌菌絲的生長和孢子萌發均無顯著抑制作用，甚至低質量濃度條件下還能輕微促進病菌的孢子萌發。由此可知，復硝酚鈉對病菌本身的生長并無抑制作用，對病害的防治可能主要因為藥劑對毒素的鈍化、解毒等作用，從而降低了病菌的侵染致病能力。

表2 復硝酚鈉對病菌菌落直徑、孢子萌發率的影響

3.3 復硝酚鈉的施用安全性

對施藥后第3天、第7天和第14天的蘋果樹進行了觀察，結果顯示：①藥劑施用組果樹的樹干、枝條、葉，與對照組第3天未見明顯差異；②第7天、第14天，藥劑施用組果樹的樹干、枝條與對照組無明顯差異，但葉片顏色更加翠綠、明亮，生長旺盛，可以認為，復硝酚鈉對蘋果樹的生長無明顯藥害，且可調節、改善蘋果葉片的生理狀態，因此，初步認為復硝酚鈉噴施對蘋果樹是安全的。然而，由于試驗未包括復硝酚鈉在蘋果果實中的殘留消解、膳食攝入風險等，還需進一步研究其使用的安全性。

4 結論

蘋果炭疽葉枯病潛育期短、病情發展快，能快速造成大量的早期落葉，嚴重威脅蘋果的產量和質量。蘋果樹染病前需要連續施用殺菌劑進行保護性施藥，染病后則難以防治，因此對其防控新技術的需求較為迫切。鈍化、抑制植物病原真菌毒素，干擾植物病原菌與寄主之間的聯系，可為蘋果炭疽葉枯病的防控提供新的途徑。本文以炭疽葉枯病菌產生的粗毒素以及嘎啦蘋果葉片為生測材料，測定了28種物質對其粗毒素的鈍化活性。篩選結果表明，復硝酚鈉對粗毒素的鈍化作用較為理想，且在不同溫度條件下其鈍化效果相對穩定。進一步研究表明，復硝酚鈉噴施對蘋果炭疽葉枯病具有一定的保護和治療防效，但藥劑本身對炭疽葉枯病菌菌絲生長和孢子萌發無顯著影響，對蘋果樹的生長無明顯藥害，且可調節、改善蘋果葉片的生理狀態。因此，推測復硝酚鈉是一種可以通過鈍化病菌毒素方式防治蘋果炭疽葉枯病的藥劑，可單獨使用或輔助殺菌劑使用。