不同禽類蛋清蛋白質的嬰幼兒體外消化特性差異研究

張 宇,劉安鳳,黎海婧,陳 燁,周業飛,宋尚新,2*

(1. 南京曉莊學院 食品科學學院,江蘇 南京 211171;2. 南京曉莊學院 兒童食品研究所,江蘇 南京 211171;3. 北京工商大學 食品與健康學院,北京 100048)

對于滿6月齡的嬰幼兒來說,由于單一喂養母乳或配方奶粉已無法滿足其營養需要,需要為其添加輔食[1]。其中,蛋白質類輔食的添加量和種類尤為重要。蛋白質是機體細胞和組織的重要組成成分。嬰幼兒正處于快速生長發育階段,其單位體質量的蛋白質需求量高于成人[2]。嬰幼兒攝入蛋白質不足易導致低體重、生長發育遲緩、抵抗力下降、貧血等不良后果[3]。此外,由于嬰幼兒的胃腸功能較弱,若添加的蛋白質輔食種類不當,極易造成嬰幼兒食物過敏、腹瀉等不良反應[4]。除了乳類蛋白質之外,肉類和蛋類也屬于優質的動物性蛋白質,能夠為嬰幼兒提供生長發育所需的所有必需氨基酸。我國《7～24月齡嬰幼兒喂養指南》建議將肉類和蛋類作為嬰幼兒補充蛋白質營養的優選食物種類[5]。

蛋白質的消化率決定了其生物利用率。與成人相比,嬰幼兒的胃腸功能發育還很不成熟,尤其對蛋白質的消化能力較弱。研究發現嬰幼兒胃液的pH值較高,同時胃中的胃蛋白酶和小腸中的胰蛋白酶的分泌量和活性均較低,導致嬰幼兒消化蛋白質的能力遠低于成人[6]。不能被完全消化的蛋白質大分子和多肽片段本身會進入后腸經微生物發酵產生的苯酚、硫化物、氨等有害物質,是導致腸絞痛、過敏、脹氣、腹瀉、便秘等胃腸不適的主要因素[6]。因此,為嬰幼兒添加蛋白質類輔食時,需要著重考慮蛋白質的可消化性。

目前已有研究通過體外消化模型比較了嬰幼兒對不同乳類蛋白質[7]、肉類蛋白質[8]、豆類等植物蛋白質[2]的消化差異性。Hodgkinson等[7]通過體外方法比較了嬰幼兒對牛乳和山羊乳的蛋白質消化差異性,發現兩者的消化產物不同。Roux等[2]通過體外方法研究發現,嬰幼兒對豌豆和蠶豆蛋白質的消化率與牛乳清蛋白質相似,而對大米和馬鈴薯蛋白質的消化率則低于牛乳清蛋白質。羅明洋等[8]研究發現,以豬肉、牛肉和雞肉為原料加工而成的嬰幼兒肉泥在理化性質和體外消化特性方面存在較大差異,其中,嬰幼兒對豬肉蛋白質的消化率顯著高于牛肉和雞肉蛋白質。然而,目前有關嬰幼兒對不同禽蛋類蛋白質的消化性研究還較少。TORCELLO-GOMEZ等(2020年)通過體外方法比較了嬰幼兒和成人對雞蛋卵清蛋白的消化程度,結果發現與成人相比,嬰幼兒對雞蛋卵清蛋白的消化很不完全,仍然有一些完整的卵清蛋白分子和大于9個氨基酸的多肽分子沒有消化[9]。

目前在各類禽蛋中,雞蛋仍然是家庭消費的主要品種。除此之外,其它禽蛋類如鴨蛋、鴿蛋、鵪鶉蛋等也常出現在人們的日常飲食中,并越來越多地進入嬰幼兒的輔食食譜。由于種屬不同,不同禽類經過長期進化和人類馴化后,使其禽蛋的蛋白質圖譜各具特異性[10]。目前,已有研究者對不同禽蛋的品質特性[10]、物理特性[10]、營養組成[10-12]、蛋白質組學差異[13, 14]進行了對比研究。然而,有關不同禽蛋的蛋白質消化特性的研究還未見報道。為了更好地了解嬰幼兒對不同禽蛋蛋清的蛋白質消化差異性,本研究通過體外模擬嬰幼兒胃腸消化過程,比較不同禽蛋類(包括雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鴿蛋和鵪鶉蛋)蛋清的蛋白質體外消化率和消化產物的差異,為人們科學合理安排嬰幼兒蛋白質輔食提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:新鮮的雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鴿蛋、鵪鶉蛋均購于當地超市。

試劑:總氨基酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);胃蛋白酶(取自豬胃粘膜,酶活力≥400 units/mg,P7125,Sigma);胰蛋白酶(取自豬胰臟,酶活力1000 units/mg,T7409, Sigma);糜蛋白酶(取自牛胰腺,酶活力40 U/mg,C7762,Sigma);甘氨脫氧膽酸鈉(純度97%,Sigma);牛黃膽酸鈉(純度97%,Sigma)。

儀器:DZF-6050真空干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司);SH220N石墨消解儀(海能電子有限公司);BR4i高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司);K9860全自動凱氏定氮儀(海能電子有限公司); PHS-3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司);S10手提式高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司);DKZ電熱恒溫震蕩水槽(上海一恒科技有限公司);FA2204N分析天平(常州市幸運電子設備有限公司);IMS-100全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司);UV2400紫外可見分光光度計(舜宇恒平科學儀器有限公司);ZSP-90馬爾文粒度分析儀(德芮克國際股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

將完整的禽蛋置于沸水中煮熟,除去蛋殼,取蛋清備測。熟制蛋清的水分含量采用《GB/T 5009.3—2016食品中水分的測定》中的直接干燥法進行測定,其粗蛋白含量采用《GB 5009.5-2016食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行測定。將熟制蛋清與蒸餾水以1∶1比例混合后,進行勻漿,制成蛋清泥以模擬嬰幼兒輔食的狀態。

1.2.2 體外模擬嬰幼兒胃腸消化蛋白質過程

每種禽蛋設置兩組待測樣品,每組4個平行。其中一組樣品用于模擬胃消化過程,另一組樣品用于模擬胃和小腸兩步消化過程。每個消化步驟均設置兩個空白對照樣品。嬰幼兒體外消化模型參考LEE等(2019年)[15]的方法并稍作改進。

胃消化過程:配制嬰幼兒模擬胃液:取4.39 g NaCl和1.460 g胃蛋白酶溶解后,用0.1 mol/L HCl溶液調節pH值至3.8,定容到500 mL。取6.0 g蛋清泥加入50 mL離心管中,加入10 mL模擬胃液,用0.1 mol/L的HCl溶液調節pH值至3.8。將離心管插入水浴搖床上,在37 ℃下震蕩反應2 h。胃消化反應結束后取出離心管,用1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0,以終止胃消化反應。其中一組樣品經胃消化后低溫凍存備測,另一組樣品繼續進行小腸消化反應。

小腸消化過程:配制嬰幼兒模擬小腸液:取1.46 g NaCl、0.0443 g胰蛋白酶和0.0129 g糜蛋白酶溶解后,用1.0 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.5,定容到250 mL。配制嬰幼兒模擬膽汁:取0.430 g牛黃膽酸鈉和0.3772 g甘氨脫氧膽酸鈉溶解,用1.0 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.5,定容到200 mL。在完成胃消化反應的離心管中繼續加入10 mL模擬小腸液和5 mL模擬膽汁,用1 mol/L NaOH溶液將pH值調至7.5。將離心管插入水浴搖床中,在37 ℃條件下震蕩反應2 h。反應結束后,將離心管置于95 ℃水浴中加熱5 min以終止小腸消化反應。

1.2.3 蛋白質體外消化率及消化產物的測定

體外消化率的測定和計算:將消化后的乳濁液在4 ℃條件下6400 r/min離心30 min,取沉淀物進行干燥,采用凱氏定氮法測定干燥沉淀中的蛋白質含量,通過與消化前的蛋白質含量進行比較,參照以下公式計算蛋白質消化率。

(1)

式中:P0為消化前樣品的蛋白質含量,g;P1為消化后樣品的蛋白質含量,g。

消化產物氨基酸得率的測定和計算:將消化前和消化后的乳濁液在4 ℃條件下6400 r/min離心30 min,取上清液進行定容,采用氨基酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定上清液的氨基酸濃度,并按照以下公式計算氨基酸得率。

(2)

式中:A0為消化前上清液的氨基酸濃度,μmol/mL;V0為消化前上清液的定容體積,mL;A1為消化后上清液的氨基酸濃度,μmol/mL;V1為消化后上清液的定容體積,mL;m為消化前樣品的干基質量,g。

1.2.4 可溶性蛋白質粒徑的測定

將消化前和消化后的乳濁液在4 ℃下6400 r/min離心30 min后,取上清液直接注入Zeta電位皿,使用馬爾文Nano ZS90粒度分析儀在25 ℃下測定上清液中可溶性蛋白質的粒徑大小,測量速度為1800 r/min。折射率和吸收參數分別為1.450和0.001。

1.2.5 數據處理

數據分析和統計采用SPSS16.0軟件,采用單因素方差分析和Duncan多重比較方法比較各組平均值的差異(P<0.05)。各顯著變化指標間的相關性分析采用R語言調用“corrplot”軟件包進行分析和作圖。

2 結果與分析

圖1 煮制后五種禽蛋蛋清的水分和蛋白質含量注:數據表示為平均值±標準差,n=4。各組平均值比較采用單因素方差分析與鄧肯多重比較,柱子上方字母不同表示差異顯著(P<0.05),字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。(下同)

2.1 煮制后不同禽蛋蛋清的水分和蛋白質含量

由圖1可知,煮制后5種禽蛋蛋清含水量在72%～80%之間。其中,鴿蛋清的含水量最高,為79.5%,顯著高于其余4種禽蛋(P<0.05)。雞蛋清含水量為73.3%,顯著高于鵪鶉蛋清(72.8%)、鴨蛋清(72.6%)和鵝蛋清(72.5%)(P<0.05)。鵪鶉蛋清、鴨蛋清和鵝蛋清含水量之間無顯著差異(P>0.05)。

煮制后的5種禽蛋蛋清含蛋白質濕基量在10%～15%之間,蛋白質干基含量在44%～56%之間。其中,雞蛋清含蛋白質濕基量為14.7%、含蛋白質干基量為55.2%,均為5種禽蛋中含量最高。鴿蛋清含蛋白質濕基量為10.8%,為5種禽蛋中含量最低(P<0.05),其含蛋白質干基量為52.8%,與雞蛋清和鴨蛋清之間差異不顯著(P>0.05),但顯著高于鵪鶉蛋清和鵝蛋清(P<0.05)。鴨蛋清和鵪鶉蛋清含蛋白質量之間差異不顯著(P>0.05)。鵝蛋清含蛋白質干基量為45.0%,為5種禽蛋中最低(P<0.05)。

2.2 嬰幼兒體外消化不同禽蛋蛋清的蛋白質消化特性

圖2 嬰幼兒體外消化不同禽蛋蛋清的蛋白質消化率

2.2.1 蛋白質消化率

由圖2可知,經胃消化后,5種禽蛋蛋清的蛋白質消化率為39%～50%。其中,鵪鶉蛋清(49.8%)和雞蛋清(48.7%)的蛋白質消化率差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其余3種蛋清(P<0.05)。其余3種蛋清的蛋白質消化率從高到低依次為鵝蛋清(45.1%)、鴨蛋清(41.2%)、鴿蛋清(39.2%),且任意兩者之間差異顯著(P<0.05)。經胃腸兩步消化后,5種禽蛋蛋清的蛋白質消化率比單獨進行胃消化時有較大提高,達到70%～85%之間。其中,雞蛋清的蛋白質消化率最高(84.1%),顯著高于其余4種蛋清(P<0.05)。其次是鵝蛋清(81.4%)和鵪鶉蛋清(80.2%),兩者的差異不顯著(P>0.05)。鴨蛋清的蛋白質消化率(76.4%)顯著低于雞蛋清、鵝蛋清和鵪鶉蛋清(P<0.05),但顯著高于鴿蛋清(P<0.05)。鴿蛋清經嬰幼兒體外胃腸兩步消化的蛋白質消化率最低,為70.5%。

圖3 嬰幼兒體外消化不同禽蛋蛋清的消化產物氨基酸得率

2.2.2 消化產物氨基酸得率

由圖3可知,經胃消化后,5種禽蛋蛋清的氨基酸得率由高到低依次為鵪鶉蛋清、雞蛋清、鵝蛋清、鴿蛋清和鴨蛋清,且任意兩組間的差異顯著(P<0.05)。經胃和小腸兩步消化后,雞蛋清的氨基酸得率最高,且顯著高于其余4種蛋清(P<0.05)。其次是鵝蛋清,其氨基酸得率顯著高于鴨蛋清、鵪鶉蛋清和鴿蛋清(P<0.05)。鴨蛋清與鵪鶉蛋清的氨基酸得率差異不顯著(P>0.05),鴿蛋清的氨基酸得率最低,且顯著低于其余4種蛋清(P<0.05)。

圖4 不同禽蛋蛋清消化前、后的可溶性蛋白質粒徑大小

2.3 消化前、后的可溶性蛋白質粒徑

由圖4可知,消化前,5種禽蛋蛋清的可溶性蛋白質粒徑由大到小依次為鴿蛋清、鴨蛋清、雞蛋清、鵪鶉蛋清、鵝蛋清,且任意兩組之間的差異顯著(P<0.05)。經胃消化后,五種禽蛋蛋清的可溶性蛋白質粒徑由大到小依次為鴿蛋清、鴨蛋清、鵝蛋清、雞蛋清、鵪鶉蛋清,且任意各組之間的差異顯著(P<0.05)。經胃腸兩步消化后,鴿蛋清的可溶性蛋白質粒徑仍然是5種蛋清中最大的,且顯著大于其余4種蛋清(P<0.05)。其次是鴨蛋清,其可溶性蛋白質粒徑顯著大于鵪鶉蛋清(P<0.05)?？扇苄缘鞍踪|粒徑最小的是雞蛋清和鵝蛋清,且兩者差異不顯著(P>0.05)。

2.4 指標間的相關性分析

圖5 指標之間的相關性

對蛋白質消化率、氨基酸得率和可溶性蛋白質粒徑進行相關性分析(圖5)可知,蛋白質的胃消化率與胃腸兩步消化率、胃消化后的氨基酸得率和胃腸兩步消化后的氨基酸得率之間具有極顯著正相關性(Pearson相關系數>0.60,P<0.01)。蛋白質的胃腸兩步消化率與胃腸兩步消化后的氨基酸得率之間具有極顯著的正相關性(Pearson相關系數=0.85,P<0.01),但與胃消化后的氨基酸得率之間無顯著相關性(Pearson相關系數=0.42,P>0.05)。胃消化后的氨基酸得率和胃腸兩步消化后的氨基酸得率之間無顯著相關性(Pearson相關系數=0.19,P>0.05)。此外,消化前、胃消化后和胃腸兩步消化后的可溶性蛋白質粒徑之間具有極顯著的正相關性(Pearson相關系數>0.85,P<0.01)?？扇苄缘鞍踪|粒徑、蛋白質消化率和氨基酸得率之間具有顯著負相關性(圖5,黑色圓圈部分),其Pearson相關系數在-0.47至-0.93(P<0.05)。

3 討論

本研究通過體外方法比較了嬰幼兒消化五種禽蛋蛋清的蛋白質消化特性。研究發現,五種禽蛋蛋清經胃消化后的蛋白質消化率為39%～50%,經胃腸兩步消化后的蛋白質消化率比單獨胃消化時有較大提高,達到70%～85%之間。羅明洋等[8]通過嬰幼兒體外消化模型,比較了不同肉類蛋白質的消化率差異,結果發現在胃蛋白酶作用階段,豬肉泥的蛋白質消化率為28.4%,牛肉泥為19.7%和雞肉泥為22.9%。經過胃蛋白酶和胰酶兩步消化后,豬肉泥的蛋白質消化率為60.73%,牛肉泥為56.82%和雞肉泥為55.16%。通過對比羅明洋等對肉類蛋白質消化率的研究可知,嬰幼兒對禽蛋蛋清的蛋白質消化率總體上高于對肉類蛋白質的消化率。因此,在給較小月齡的嬰幼兒添加蛋白質輔食時,建議選擇禽蛋類優先于肉類。

分析煮制后的5種禽蛋蛋清的水分含量發現,5種禽蛋蛋清含水量在72%～80%之間。其中,鴿蛋清的水分含量最高,為79.5%,而其余4種禽蛋蛋清的水分含量都接近73%。比較5種禽蛋蛋清的蛋白質含量可知,煮制后的五種禽蛋蛋清含蛋白質濕基量在10%～15%之間,含蛋白質干基量在44%～56%之間。其中,雞蛋清含蛋白質濕基量(14.7%)和干基量(55.2%)均為5種禽蛋中最高。而鴿蛋清含蛋白質濕基量(10.8%)為5種禽蛋中最低(P<0.05)。鵝蛋清含蛋白質干基量(45.0%)為5種禽蛋中最低(P<0.05)。因此,從單位質量可提供的蛋白質數量上來看,單位質量雞蛋清可為嬰幼兒提供的蛋白質要高于鴨蛋、鵝蛋清和鴿蛋清。

此外,蛋白質消化率也是衡量蛋白質營養價值的重要因素。本研究發現嬰幼兒消化5種禽蛋蛋清的蛋白質消化率存在明顯差異。其中嬰幼兒對雞蛋清的蛋白質消化率無論在胃消化(48.7%)還是在胃腸兩步消化和(84.1%)均是5種禽蛋中最高的,而鴿蛋清的蛋白質消化率無論在胃消化(39.2%)還是在胃腸兩步消化后(70.5%)均是5種禽蛋中最低的。經胃腸兩步消化后的鵝蛋清(81.4%)、鵪鶉蛋清(80.2%)和鴨蛋清(76.4%)的蛋白質消化率介于雞蛋清和鴿蛋清之間。蛋白質消化率決定了其為人體提供的可被吸收的氨基酸的量,即生物利用率。本研究通過分析消化產物氨基酸的得率發現,5種禽蛋蛋清經嬰幼兒體外胃消化以及胃腸兩步消化后的蛋白質消化率與其消化產物氨基酸的得率之間具有極顯著的正相關關系(Pearson相關系數>0.80,P<0.01),說明消化率越高的禽蛋蛋清,其為嬰幼兒提供的可被吸收的氨基酸的量也越高。其中,經胃腸兩步消化后的雞蛋清的氨基酸得率最高,鴿蛋清的氨基酸得率最低。因此,從蛋白質消化特性角度出發,建議為嬰幼兒添加禽蛋蛋清時,應優先選擇較易消化的雞蛋清,其次可選擇鵪鶉蛋清,對于不太易于消化的鴿蛋清,則應推遲添加。

蛋清的水分含量與其物理特性密切相關[10]。研究表明,鴿蛋清與其余4種禽蛋蛋清的凝膠特性存在較大差異,鴿蛋清凝膠的透明度較高,同時保水性和硬度也較高,但總切削功(total cutting work)較低,使得鴿蛋清在外力作用下容易變形,但不容易被切斷。這種物理特性可能導致在為嬰幼兒制作鴿蛋清輔食泥時,因為鴿蛋清不易被破碎而易產生較大的蛋白質顆粒,從而影響嬰幼兒的吞咽和消化?；诖思僭O,本研究比較了消化前和消化后5種禽蛋蛋清的可溶性蛋白質的粒徑大小。結果發現,消化前、經胃消化后以及經胃腸兩步消化后的鴿蛋清的可溶性蛋白質粒徑均為5種蛋清中最大(P<0.05)。經胃腸兩步消化后,雞蛋清的可溶性蛋白質粒徑最小(P<0.05)。進一步通過相關性分析發現,5種禽蛋蛋清的可溶性蛋白質粒徑在消化前與消化后具有極顯著高度正相關,且與蛋白質消化率和消化產物氨基酸得率之間呈顯著負相關。這些結果表明,消化前鴿蛋清的可溶性蛋白質粒徑較大與其蛋白質消化率較低密切相關。因此,在為嬰幼兒制作蛋清泥輔食時,可以通過一定方法降低蛋白質顆粒的尺寸以達到提高消化率的目的。

從分子水平上來看,蛋白質的分子結構[16]、空間構象以及分子內和分子間的交聯等結構特征決定了蛋白質的加工特性和生物學功能[17,18],并進而影響蛋白質的消化特性[19]。由于種屬不同,經過長期進化和馴養,不同禽蛋蛋清的蛋白質圖譜不同。國內外學者運用蛋白質組學方法從雞蛋清中鑒定到202種蛋白質[20]。其中,含量較高的蛋白質為卵白蛋白占54%、卵轉鐵蛋白占12%、卵類粘蛋白占11%、卵粘蛋白占3.5%和溶菌酶占3.4%。HU等[13]運用差異蛋白質組學比較了雞蛋清、鵪鶉蛋清和鴨蛋清的蛋白質組成差異,結果發現三種蛋清中皆存在特異性的蛋白質分子。Sun和Hayakawa研究發現,鴨蛋卵白蛋白中的二硫鍵的數量多于雞蛋卵白蛋白,以致雞蛋清和鴨蛋清的熱凝膠透明度和粘彈性有明顯差異[21]。有關鴿蛋清的蛋白質組學研究還未見報道。未來有必要對不同禽蛋蛋清經消化后的產物肽段組成和分子結構進行研究,以揭示不同禽蛋蛋清消化特性差異的分子機制。

4 結 論

綜上所述,單位質量雞蛋清可為嬰幼兒提供的蛋白質多于鴨蛋清、鵝蛋清、鵪鶉蛋清和鴿蛋清;嬰幼兒對雞蛋清的胃消化率(48.7%)和胃腸兩步消化率(84.1%)為5種禽蛋中最高,鴿蛋清的胃消化率(39.2%)和胃腸兩步消化率(70.5%)為最低。經胃腸兩步消化后的鵝蛋清(81.4%)、鵪鶉蛋清(80.2%)和鴨蛋清(76.4%)的蛋白質消化率介于雞蛋清和鴿蛋清之間。五種蛋清的蛋白質消化率與其消化產物氨基酸得率呈顯著正相關,與消化前、后的可溶性蛋白質粒徑呈顯著負相關。建議為嬰幼兒優先添加雞蛋清,其次鵪鶉蛋清和鵝蛋清,最后鴨蛋清和鴿蛋清,該研究為給嬰幼兒合理添加蛋類輔食提供科學依據。