纖維蛋白原通過激活EGFR 信號通路抑制體外低糖低氧損傷神經元軸突再生

曾雯，譚玲娟,，周勝強，劉芳

（1 湖南中醫藥大學，長沙 410000；2 湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006）

缺血性腦卒中是目前常見的疾病之一，該病具有高致死率、高致殘率的特點[1]。缺血性腦卒中的首選治療方法是溶栓治療，即使目前的醫療水平較過去有大幅度提升，但囿于時間窗的限制，大部分患者不能得到及時的治療[2]。大腦正常功能運行依賴于神經元之間的交互作用，軸突的損傷可能中斷神經元與其下游靶標的連接，導致神經功能缺損[3]。因此，軸突再生對于腦缺血損傷后受損神經元以及神經功能的恢復至關重要，但成人中樞神經系統的神經元軸突再生和突觸新生能力有限，腦缺血會引起中樞神經系統的神經元軸突損傷，最終引起功能永久性缺損[2,4]，增加了社會、經濟與護理的負擔，降低了患者的生活質量。因此，如何促進卒中后神經元軸突再生、重建神經回路是目前亟待解決的科學問題。

神經元軸突再生是一個復雜的多因素調節過程，受到胞內環磷酸腺苷、胞外神經營養因子、軸突再生抑制因子以及膠質瘢痕等諸多內外環境因素的精確調控[5]。既往研究證實，即使改善神經元內在再生能力，神經元的軸突再生水平依然十分有限，而少突膠質細胞所分泌的髓鞘相關抑制因子、膠質瘢痕分泌的蛋白聚糖等神經系統合成的蛋白質被一直認為是影響腦梗死后軸突再生的決定因素[6‐8]，但令人遺憾地是，臨床上即使這些蛋白質被去除或者相關信號分子被抑制，大多數神經元仍然表現出很弱的軸突再生能力[9]。近年來，血液中一種重要凝血蛋白纖維蛋白原（fibrinogen，Fg）在中樞神經系統損傷與修復過程中的作用越來越受到科研工作者的廣泛關注[10‐12]?？茖W家驚奇地發現Fg 竟然是抑制神經元軸突再生的一個“背后黑手”，由于其復雜的纖維結構且容易形成不溶性的纖維蛋白網而難以清除，可能在介導神經元軸突再生障礙過程中扮演著關鍵角色。既往研究證實，Fg 可作為配體與正常脊髓神經元整合素受體αvβ3 結合進而反式激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），調控軸突生長[13]。但Fg 對體外低糖低氧損傷皮層神經元軸突再生水平有何影響及其效應機制，目前尚不清楚。EGFR 信號通路與中樞神經軸突再生調控密切相關。EGFR 信號可以抑制軸突再生，阻礙神經功能恢復[14]。EGFR 信號通路激活后，p‐EGFR 的表達會隨之升高[15]，研究多采用觀察p‐EGFR 的表達量以判定EGFR 通路是否被激活。軸突骨架蛋白CRMP‐2 和MAP‐1B 同屬EGFR 信號通路下游調控蛋白，CRMP‐2、MAP‐1B 的mRNA 表達與軸突再生成正相關[16‐19]。

因此，本研究采用低糖低氧（low glucose and oxygen，LGO）損傷神經元模型模擬體內腦梗死周邊神經元低灌注微環境，同時予以Fg 處理，通過免疫熒光、qPCR、WB 等生物學技術，結合EGFR 信號通路特異性阻斷劑，評估神經元細胞軸突再生及EGFR 信號通路激活情況。旨在闡明Fg 對體外LGO損傷神經元軸突再生的影響及機制，為腦卒中后神經功能修復提供新的靶點與防治策略。

材料與方法

1 動物

出生24 h 內乳鼠（合格證號：No.4307272211017 53915），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，SPF 級，均為雄性。實驗過程中均按實驗動物倫理學標準處置實驗動物。

2 試劑與藥物

神經元培養基（iCell‐0013）購自icell 公司；B27 添加劑（12587010）購自賽默飛公司；青鏈霉素（SV30010）購自碧云天公司；EGFR 抑制劑PD168393（HY‐13896‐10mg） 購 自MCE 公 司；Fg（NPA193Ra01）購自優爾生公司；重組水蛭素（H922245‐100U）購自麥克林公司；小鼠抗EGFR（66455‐1‐Ig）、β‐actin（66009‐1‐Ig）、MAP‐2（67015‐1‐Ig）一抗、CoraLite594 標記的羊抗小鼠IgG（SA00013‐3）均購自proteintech 公司；兔抗p‐EGFR（3777S）一抗購自CST 公司；小鼠抗Tuj‐1（ab78078）一抗購自Abcam；HRP 標記的山羊抗鼠IgG（AWS0001）、HRP 標記的山羊抗兔IgG（AWS0002）均購自Abiowell 公司；mRNA 逆轉錄試劑盒（CW2569）、UltraSYBR Mixture（CW2601）、DM2000 Plus DNA Marker（CW0632）均購自中國北京康為世紀公司。

3 主要儀器

YT‐CJ‐2NB 型超凈工作臺（北京亞泰?。?；DH‐160I 型直熱式二氧化碳培養箱（上海三藤儀器）；DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器）；SL02 型低速離心機（知信儀器）； PIKOREAL96 型熒光定量RCP 儀（美國Thermo）；DYY‐2C 型電泳儀、DYY‐6C 型恒溫箱、DYCZ‐24DN 型電泳槽（中國北京六一）；ChemiScope6100 型化學發光成像系統（中國勤翔）。

4 皮層神經元原代培養與鑒定

將脫頸處死后的SD 乳鼠（出生24 h 以內）全身浸泡于75 %酒精中，消毒3 min 后，移入無菌操作臺。超凈工作臺無菌分離胎鼠皮層組織，剪刀剪碎，將組織碎片裝入15 mL 離心管中。加入5 mL 0.25 %胰酶消化液中，混勻，37 °C 消化15 min，每5 min顛倒離心管一次。加入等體積含10 % FBS的DMEM培養基終止消化，1000 r/min 離心5 min，棄上清。加入10 % FBS 的DMEM 培養基重懸，用巴士吸管輕輕吹打20 次制成細胞懸液，過70 μm 濾網，收集濾液。300 g 離心5 min，棄上清，沉淀用10 %FBS的DMEM 培養基重懸，接種于預先用多聚賴氨酸包被的6 孔板中。第2 d 全部換成神經元完全培養基（含有2 % B27），每2 d 半量換液，神經元細胞培養于專用培養基中，37 °C、5 % CO2飽和濕度培養箱中培養，至第7 d 細胞成熟。

細胞成熟后采用MAP‐2 免疫熒光法進行鑒定：將爬片用PBS 清洗3 次，4 %多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗。加入0.3 % Triton X‐100，在37 °C 下通透30 min，PBS 沖洗。在37 °C 下，使用5 % BSA封閉60 min。滴加50 μL MAP‐2 一抗（1 ∶100），4 °C 過夜，PBS 沖洗。滴加50 μL 二抗CoraLite594標記的羊抗小鼠IgG（1 ∶100），在37 °C 下孵育90 min，PBS 沖洗。37 °C 下DAPI 核染10 min，PBS沖洗，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

5 細胞分組與給藥

將提取的原代皮層神經元直接鋪板在六孔板里面，待細胞貼壁后隨機分為LGO 組、LGO+Fg 組及LGO+Fg+PD168393 組。3 組均予以2 % 氧氣+5 mmol/L 葡萄糖低糖低氧處理，將放有細胞的缺氧小室放于培養箱孵育48 h，48 h 后對LGO+Fg 組及LGO+Fg+PD168393 組予以加藥處理。LGO+Fg 組加入1 mg/mL Fg 和0.5 U/mL 水蛭素處理細胞24 h；LGO+Fg+PD168393 組加入1 mg/mL Fg、0.5 U/mL水蛭素和50 nmol/L PD168393 處理細胞24 h。

6 免疫熒光染色檢測Tuj-1

取出爬片，PBS 清洗3 次，將爬片用4 % 多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗，加入0.3 %Triton X‐100，37 °C 30 min 通透。PBS 沖洗，5 % BSA 37 °C 封閉60 min。滴加50 μL Tuj‐1 一抗（1 ∶100），4 °C 過夜。PBS 沖洗，滴加50 μL 二抗CoraLite594 標記的羊抗小鼠IgG（1 ∶100），37 °C 孵育90 min，PBS沖洗；PBS 沖洗，DAPI 工作液37 °C 下染核10 min，PBS 沖洗，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡下觀察Tuj‐1 染色后的神經元，每個爬片隨機觀察5 個視野（20 倍物鏡），使用Image‐Pro Plus 6.0 軟件計算每個視野中Tuj‐1 陽性突起的長度與數量，取平均值。

7 Western blot 檢測EGFR、p-EGFR 在細胞中的表達

用冰預冷PBS 洗滌細胞1 次，加入200 μL RIPA裂解液，刮取細胞，超聲破碎1.5 min，冰上裂解10 min。4 °C，12 000 r/min 離心15 min，將離心后的上清轉移倒 1.5 mL 的離心管中，BCA 法測定蛋白濃度。取120 μL 蛋白上清，加入30 μL 5×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。第一孔加入蛋白分子量標準品 2 μL，其它每孔上樣20 μL已變性樣品蛋白。凝膠電泳、轉膜、封閉后，滴加一抗EGFR（1 ∶10000）、p‐EGFR（1 ∶1000）和β‐actin（1 ∶5000）孵育，室溫放置90 min ，滴加二抗HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1 ∶5000）、HRP山羊抗兔IgG（1 ∶5000），室溫孵育90 min。ECL顯色曝光，在凝膠成像系統成像，計算蛋白相對表達量。

8 實 時 熒 光 定 量PCR 檢 測MAP-1B、CRMP-2 mRNA 表達

引物和內參設計在NCBI 上搜索目的基因的序列，運用primer5 軟件設計引物，由北京擎科合成引物。內參β‐actin 上游引物序列為ACATCCGTA‐AAGACCTCTATGCC，下游引物序列為TACTCCT‐GCTTGCTGATCCAC，擴增產物為223 bp；MAP‐1B上游引物序列為GGTCTGCCTCTGTGTATGGT，下游引物序列為ATGTCTCAACACACAAGTGAAC，擴增產物為244 bp； CRMP‐2 上游引物序列為CCCTAGCTGGATCTGTGTTGG，下游引物引物序列為GGTACAATCCCTTAGCTGGTCT，擴增產物為106 bp。PCR 反應步驟：Trizol 提取細胞總RNA，并計算其濃度跟純度，以細胞總mRNA 為模板，逆轉錄cDNA；SYBR 法定量PCR 擴增反應條件：95 °C預變性10 min，95 °C 變性15 s，60 °C 退火30 s，共40 個循環；2‐ΔΔCt反映各樣品相對于正常組樣品目的基因表達水平的比值。

9 統計分析方法

采用SPSS.26 統計分析處理數據，計量資料以均數±標準差表示，組間比較，使用單因素方差分析，如方差齊則用LSD 檢測，如方差不齊，則應用Tamhane T2 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 原代皮層神經元生長良好

培育1 d 后顯微鏡下觀察到細胞貼壁，呈橢圓形（圖1A），培養3 d 時顯微鏡下觀察到細胞明顯增大，突起有延伸（圖1B）。培養至第5 d 細胞可見光暈，呈橢圓形，形態欠規則，神經元之間纖維較前豐富（圖1C）。培養至第7 d，細胞光暈明顯，胞體豐滿，呈三角形及多邊形，可見清晰細胞核，神經元之間聯系形成網絡（圖1D）。免疫熒光染色顯示，原代培養皮層神經元正常表達MAP‐2（圖2）。

圖1 原代皮層神經元生長狀況。A，培養1 d；B，培養3 d；C，培養5 d；D，培養7 d。白箭頭示神經元胞體，黑箭頭示神經元突起。比例尺，100 μm。Fig. 1 Primary cortical neurons growth status. A, cultured for 1 day; B, cultured for 3 days; C, cultured for 5 days; D, cultured for 7 days. White arrows indicate neuronal cell bodies, and black arrows indicate neuronal processes. Scale bars, 100 μm.

圖2 原代皮層神經元MAP‐2 表達的免疫熒光檢測。比例尺，50 μmFig. 2 Immunofluorescence examination of MAP‐2 expression in the cultured primary cortical neurons. Scale bar, 50 μm

2 EGFR 抑制劑減輕纖維蛋白原沉積對低糖低氧神經元軸突再生的抑制

對神經元軸突特異性標志物Tuj‐1 進行免疫熒光染色檢測顯示：與LGO 組比較，LGO+Fg 組神經元軸突長度較短，數量更少；與LGO+Fg 組相比，LGO+Fg+PD168393 組神經元軸突長度較長，數量更多（圖3，表1）。由此表明，Fg 沉積抑制低糖低氧神經元軸突再生，該作用主要通過EGFR 實現。

表1 神經元軸突長度與數量定量分析（n=6，± s）Tab. 1 Comparison of neuron axon length and number in each group (n=6,± s)

表1 神經元軸突長度與數量定量分析（n=6，± s）Tab. 1 Comparison of neuron axon length and number in each group (n=6,± s)

與LGO 組相比，aP ＜0.05；與LGO+Fg 組相比，bP ＜0.05；n=6 aP＜0.05, compared with the LGO group; bP＜0.05, compared with LGO+Fg group; n=6

組別 軸突長度（μm） 軸突數量（個/視野）LGO 組 186.67±3.56 745.17±13.47 LGO+Fg 組 167.00±14.31 a 662.00±45.81 a LGO+Fg+PD168393 組 182.00±14.20 b 743.67±24.20 b

圖3 Tuj‐1 免疫熒光染色檢測原代培養皮層神經元的軸突長度和數量。DAPI 復染細胞核；比例尺，50 μmFig. 3 Tuj‐1 immunofluorescence staining to detect the axonal length and number of primary cultured cortical neurons. Counterstaining of nuclei with DAPI; scale bar, 50 μm

3 纖維蛋白原沉積反式激活EGFR 信號通路

Western blot 檢測各組神經元EGFR、p‐EGFR蛋白表達水平顯示：與LGO 組相比，LGO+Fg 組的p‐EGFR 表達上調；與LGO+Fg 組相比，LGO+F‐g+PD168393 組的p‐EGFR 表達下調（圖4，表2）。此結果表明，Fg 沉積可反式激活EGFR。

表2 神經元EGFR 信號通路關鍵分子EGFR 和p-EGFR 蛋白表達水平統計學分析Tab. 2 Statistical analysis of the expression levels of key molecules in the neuronal EGFR signaling pathway, including EGFR and p-EGFR proteins

圖4 纖維蛋白原沉積對低糖低氧神經元EGFR 信號通路活性影響的代表性Western blot 檢測結果Fig. 4 Representative Western blotting results of the effect of fibrinogen deposition on the activity of the EGFR signaling pathway in low glucose and low oxygen neurons

4 纖維蛋白原沉積抑制低糖低氧神經元MAP-1B和CRMP-2 mRNA 表達

qPCR 法檢測各組神經元細胞骨架蛋白MAP‐1B 和CRMP‐2 mRNA 表達水平顯示：與LGO 組相比，LGO+Fg 組MAP‐1B 和CRMP‐2 mRNA 表達下調；與LGO+Fg 組相比，LGO+Fg+PD168393 組MAP‐1B 和CRMP‐2 mRNA 表達上調（表3）。結果提示，Fg 的沉積可以抑制細胞骨架相關蛋白MAP‐1B、CRMP‐2 mRNA 表達。

表3 神經元細胞骨架蛋白MAP-1B 和CRMP-2 mRNA 表達水平統計學分析Tab. 3 Statistical analysis of mRNA expression levels of neuronal cytoskeletal proteins MAP-1B and CRMP-2

討 論

Fg 是由肝細胞合成的凝血因子，是血漿與組織中直接參與凝血的重要物質。Fg 通常以水溶性形式存在，可在凝血酶酶解作用下轉為不溶性纖維蛋白發揮凝血功能[20]。而神經元可以分泌凝血酶[21]，因此，在本次研究中我們使用水蛭素與凝血酶結合，以抑制Fg 向纖維蛋白轉化[22]。

Tuj‐1 常出現在未成熟神經元的軸突、軸突末端上，是評價軸突再生的標志物[23]。腦缺血后BBB 滲漏，Fg 在大腦內沉積，通過抑制髓鞘再生、介導神經毒性等途徑，破壞神經環路的完整性引起神經功能的缺損[24]。課題組前期研究中發現，腦梗死大鼠腦內有大量Fg 沉積，但Fg 如何影響腦缺血后梗死周邊神經元的軸突再生能力，仍未闡明。在本研究中，我們通過Tuj‐1 免疫熒光法檢測軸突的數量、長度以觀察軸突再生情況，發現加入Fg 抑制原代低糖低氧損傷神經元的軸突的生長以及軸突數量增加，表明Fg 沉積抑制軸突再生。

細胞骨架是細胞中由蛋白質構成的動態結構，主要分為微管、中間纖維、微絲3 種類型，幾乎參與細胞的一切生命活動[25]。神經微管與調節其功能的多種微管蛋白相互作用，通過微管動力學、軸突運輸等方式影響軸突再生，對神經元的軸突再生至關重要[26,27]。神經微絲在軸突中分布豐富，其與微絲凝集成神經原纖維，參與軸突的生長、軸漿運輸[28]。微管、微絲等細胞骨架成分的動態平衡狀態決定了軸突延伸和生長錐的形成，是軸突再生的先決條件之一[29]。EGFR 信號通路的激活與關閉對細胞骨架均有影響，激活該通路后可觀察到神經細胞骨架的應力纖維聚合力降低，引起軸突再生障礙[30]。Liu 等人[31]通過動物實驗發現，通過調節EGFR 信號通路可能修復受損中樞神經系統髓鞘，該通路可作為卒中后神經功能修復的新切入點。氯倍他所與吉非替尼均屬于EGFR 抑制劑，Nocita[32]等人通過研究發現將兩種藥物聯用應用于脫髓鞘疾病可能促進軸突再生。Li[33]等人發現可以通過抑制microRNA‐21 負調節EGFR 通路，促進軸突再生。而缺血性卒中后恢復神經功能的關鍵措施就是促進軸突的生長、芽生以期改善神經功能缺損癥狀[34]。EGFR 激活后引發信號通路豐富，ROCK 為EGFR 的下游信號，它對神經元軸突、髓鞘再生的細胞骨架蛋白CRMP‐2 與MAP‐1B 具有負向調節作用[16‐18]。本實驗在低糖低氧損傷神經元細胞模型內加入EGFR 抑制劑PD168393，發現加入EGFR 抑制劑的神經元細胞p‐EGFR 蛋白表達下調，并且逆轉Fg 對神經元軸突再生的抑制作用，表明Fg 通過激活EGFR 信號通路阻礙軸突再生。

綜上所述，Fg 沉積可影響體外低糖低氧損傷神經元軸突再生能力，其作用機制與激活EGFR 信號通路有關。提示，臨床或可通過靶向抑制Fg 沉積或EGFR 信號通路促進腦缺血后軸突再生與功能恢復防治腦梗死后遺癥的治療目的。但仍需進一步體內實驗驗證。