腫瘤患者個體化治療藥物篩選技術研究進展

伍曉曉 劉美佑 彭莉 程梁華 王番 王婧雯 賈艷艷

(中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科,陜西 西安 710000)

2021年1月《臨床醫師癌癥雜志》發表的最新全球癌癥統計報告中指出,2020年中國癌癥新發病例4 568 754例,死亡病例3 002 899例,約占該年全球癌癥發病和死亡總數的23.7%和30.2%[1]。目前癌癥治療方案包括傳統的手術治療、放射治療、化學治療和近年來發展迅速的靶向治療、免疫治療等新型治療方式[2]。由于不同腫瘤組織生物學特征不同,對化療藥物敏感性也存在巨大個體化差異,僅憑經驗式化療而忽略個體差異往往使得總體療效不佳。近年來,隨著腫瘤精準醫療概念提出,各種腫瘤精準治療技術應運而生[3]。發展能夠及時、直接、準確反映腫瘤患者藥物敏感性的輔助檢測技術,是腫瘤精準醫療的研究熱點之一。

目前被國內外研究最多的腫瘤患者個體化用藥篩選方法有:①患者基因組信息分析技術;②類器官培養;③患者源性腫瘤樣細胞簇(PTC)模型;④膠滴腫瘤藥敏檢測技術(CD-DST);⑤人源性腫瘤異種移植模型(PDX);⑥迷你人源性腫瘤異種移植模型(MiniPDX)。本文對這些方法進行分析,以闡明各項技術的優缺點及其應用范圍和最新進展,并比較它們作為癌癥研究中的臨床前模型的前景和挑戰,該綜述對于腫瘤患者個體化用藥的研究及應用都具有較強的前瞻性和指導性作用。

1 患者基因組信息分析技術

患者基因組信息分析技術是通過檢測患者生物樣本中的基因突變、基因單核苷酸多態性分型及其蛋白表達狀態來預測藥物療效和評價預后,指導臨床個體化用藥,以減輕患者不良反應,改善療效,促進醫療資源的合理利用。該方法的流程為通過解讀基因大數據,獲取與疾病相關的變異,找到致病基因,制定個體化用藥方案。優勢是檢測范圍廣、準確性高;樣本不僅僅局限于細胞或者組織,還可以通過提取血液或體液中DNA的方式進行檢測;且使用基因芯片法通量高、花費時間短。該技術不足之處是成本較高,有些基因檢測技術需要特殊設備;腫瘤不斷產生基因變異,難以找到真正的驅動突變,即使找到明確的突變,單藥靶向治療可能也只是短暫起效;且發現的生物標志物很難轉化為有效的個體化用藥方案[4]。

目前基因測序數據分析時間正在逐漸縮短,WHEELER等[5]首次通過新一代高速測序技術在2個月內完成了單人二倍體基因組DNA序列測序,而30X人類全基因組胚系變異分析技術僅用7 min即可完成一份可供參考的人類全基因測序報告。由于藥敏預測是基于基因檢測得出的結果,且大部分結論僅由相對大樣本的關聯分析得出,并未考慮腫瘤除基因驅動外,還有表觀遺傳改變、細胞系特異性及非癌因素等復雜性,故對于存在相同生物標記物或基因突變位點的腫瘤,使用同種藥物也會出現不同治療反應。JAMA上最新報道的研究結果表明,僅約30%的患者對于依照基因組信息分析選擇的藥物治療存在反應[6]。因此,根據腫瘤患者的基因組信息篩選最有效的藥物并不能很好地實現腫瘤個體化精準治療,但患者基因組信息分析仍可為腫瘤患者的藥物治療選擇提供重要參考依據。

2 類器官培養

類器官是一種由干細胞直接誘導形成的三維組織模型,屬于近年來新出現的臨床前模型[7]。類器官與對應真器官擁有高度相似的組織學特征,具有自我更新和自我組織能力,可在一定程度上模擬器官的功能,因此成為從基礎發育、干細胞研究到個體化醫學研究等領域應用的優秀模型[8]。類器官藥敏試驗的流程為獲取腫瘤組織,體外類器官培養并且進行給藥,利用生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(ATP-TCA)進行藥敏檢測,獲得其檢測結果,試驗周期14～28 d。類器官培養具有傳統腫瘤細胞系及轉基因小鼠等模型無法比擬的優勢,具有穩定的表型和遺傳學特性[9];可以大規模培養和高通量藥物篩選;可以培養各種組織和器官,包括腸道(小腸/結腸)、胃、肝臟、心臟、肺、前列腺、胰腺、腎臟、乳腺、腦類、視網膜以及內耳等[10-12];腫瘤基因表達譜可以在長期培養中保持穩定,并能更好地模擬腫瘤缺氧微環境[13-14]。腫瘤類器官在模擬人體腫瘤方面的保真性,使得其在腫瘤個體化治療、新藥研發方面具有廣泛的應用前景[15]。但類器官的不足之處在于傳代次數有限,成熟度低,缺乏基質、免疫細胞以及血管等結構[16];還有某些腫瘤亞型培養技術復雜,成功率低[17]。

目前,類器官被大量應用于臨床研究,如對類器官進行基因分析,研究基因表達譜的變化,有助于發現疾病病因以確定治療方案。應用類器官進行藥物篩選,首先是靶向藥物的應用,然后是免疫治療的應用[18]。作為一種新興的臨床前模型,改進后的類器官能夠進一步用于腫瘤發生以及藥物耐藥機制的研究和藥物篩選,有助于實現精準的個體化醫療目標[19]。

3 PTC模型

PTC模型由腫瘤干細胞、上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞等多種細胞組成。PTC模型在結構和功能上類似于原始腫瘤,能夠很好地呈現腫瘤組織本身的多細胞微環境與腫瘤上皮細胞的相互作用。該方法的工作流程為獲取腫瘤組織標本,將組織切碎并使用消化液消化,加入培養基和基質膠進行微腫瘤PTC模型構建,然后用高通量測試芯片檢測模型的藥物敏感度。微腫瘤PTC模型在培養時間和細胞組成等方面具有明顯優勢,可以非?？斓卦隗w外形成用于實驗的微腫瘤PTC結構,該結構可以很大程度地保留原始腫瘤的病理特征、細胞組成特征及遺傳背景特征。PTC模型采用自聚增殖的培養方式,包含巨噬細胞和成纖維細胞等基質細胞,能夠很好地模擬體內微環境,能夠在2周之內檢測100～2 000種藥物,完成個性化藥物測試[20]。YIN等[21]實施PTC模型來指導1例常規治療后復發并轉移的直腸黏液腺癌患者的化療選擇,經過3個周期的非常規治療(由PTC模型確定)后,患者治療效果良好,淋巴結轉移幾乎消失,腹水體積和部分腫瘤標志物明顯減少,該微腫瘤模型預測患者藥效的準確性超過93%。但PTC模型也存在缺點,例如由于基質細胞的損失,PTC的藥物反應模式可能在培養4周后發生變化,導致長期培養和傳代困難;PTC模型的另一個缺點是,由于缺乏T細胞和內皮細胞成分,其無法檢測免疫治療藥物或抗血管生成靶向藥物的藥效。因此PTC模型的效果還需要更大規模的臨床試驗進行驗證。

4 CD-DST

CD-DST是1997年KOBAYASHI等[22]結合其他體外藥敏檢測技術優點提出的檢測技術。CD-DST具有結果準確、所需細胞數少、靈敏度高、可排除成纖維細胞干擾(通過圖像分析軟件)、臨床相關性好等特點,其缺點是體外培養無法模擬腫瘤微環境[23]。CD-DST主要過程包括制備原代腫瘤細胞懸液、膠滴內培養腫瘤細胞、藥物處理、無血清培養和圖像分析5部分[24]。CD-DST目前能夠檢測6種腫瘤,分別為非小細胞肺癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌以及宮頸癌。CD-DST方法預測的藥物敏感性結果具有很高的臨床相關性,對化療反應預測的準確率高達84.1%[25]。大量研究證實,CD-DST為提前選擇敏感性較高的臨床抗腫瘤藥物提供了重要技術手段[26]。CD-DST目前已被開發為一種有效的抗癌藥物評價系統,該培養系統模擬癌細胞所處的微環境,在體外對癌細胞進行不同化療藥物的藥敏試驗,可幫助患者選擇最適宜藥物。CD-DST被證明對抗癌藥物的臨床反應具有較高的預測準確性[27]。

5 PDX

PDX是目前最能代表人類腫瘤遺傳信息特征的小鼠異種移植瘤模型[28],與傳統細胞系異種移植模型及基因工程鼠模型不同,PDX將患者的腫瘤組織通過皮下、腎包膜下或原位種植移植到免疫缺陷小鼠體內,繼而對小鼠模型進行體內系統給藥,通過測量模型瘤體大小變化評價藥物敏感性,獲得藥敏測試結果,整個過程需要90～150 d[29-30]。PDX模型不僅可以保留腫瘤的異質性,還能保留原代腫瘤的組織形態學特征、基因表達特征、轉移能力、標志物、激素反應能力和藥物敏感性等多種特性,為腫瘤患者的藥物篩選及療效提供更精準的預測[31]。研究表明,PDX對傳統化療藥物有效率和耐藥率的預測準確度可達90%和97%[32]。

PDX具有良好的應用前景,適用于癌癥異質性分析、藥物篩選、個體化治療和復發分析[33]。然而其也存在不足之處,如建模成功率低、耗時、昂貴;基質丟失;軟硬件要求及成本高;存在倫理問題;小鼠的免疫系統與人類差異較大,使得PDX不能反映人體免疫與腫瘤間的相互作用;宿主與原發灶環境不同導致腫瘤細胞進化方向和轉移特征發生改變;面對器官和部位來源繁多的惡性腫瘤,PDX的腫瘤接種部位(主要在皮下組織與腎包膜下)不能準確代表原發瘤的周圍環境等[34]。上述缺點阻礙了PDX的廣泛應用,因此有必要對PDX進行改進。

6 MiniPDX

MiniPDX藥敏檢測技術是目前專門針對腫瘤患者臨床一線治療需求特點研發的新技術[35]。該技術可體外分離腫瘤標本原代腫瘤細胞,體內進行藥敏試驗,即將新鮮的腫瘤組織細胞經特殊方法制備后,放入微膠囊(由中空纖維膜制成,經皮膚小切口植入皮下),然后以系統給藥的方式 (口服灌胃、靜脈注射、腹腔注射等)連續數次給藥后,取出微膠囊,進行ATP-TCA藥敏檢測[36]。MiniPDX藥敏檢測技術同時具有體外腫瘤藥敏試驗周期短和體內藥敏試驗與臨床療效一致性高的優點,可在7～10 d內獲得關于患者化療藥物敏感性的試驗結果[37]。MiniPDX能夠維持腫瘤的異質性,檢測周期短、準確性高、費用低,其適用腫瘤標本類型多(包括腹水標本)。該技術能夠滿足腫瘤患者一線精準治療藥物選擇的迫切需求,并具有廣闊的臨床應用前景。有研究顯示,對MiniPDX和PDX藥效相關驗證數據表明,MiniPDX與PDX的相關性為92%[38]。雖然MiniPDX有許多優點,但它不可避免地存在一些局限性[39]:①MiniPDX模型不可再生,需要持續采集新鮮的腫瘤組織樣本;②MiniPDX中的藥物僅使用5～7 d,在研究藥物的不同使用周期時,MiniPDX將無法模擬實際給藥和效果。③MiniPDX將腫瘤組織分離成單細胞懸液,可能破壞細胞間的結構,會對腫瘤微環境產生一定影響;④微膠囊從空間上限制了腫瘤細胞的遷移和侵襲,故不能用于腫瘤轉移和侵襲相關研究。盡管存在上述缺點,但MiniPDX耗時短、成本低,且能準確預測患者的藥物療效。因此在目前的腫瘤患者個體化用藥篩選模型中,MiniPDX仍具有突出優勢。

7 目前已開發的腫瘤患者個體化用藥篩選試劑盒

7.1 ATP-TCA試劑盒

ATP-TCA通過熒光酶與熒光素結合,催化ATP轉變為AMP,通過釋放出的熒光測定細胞內ATP含量來反映活細胞數量,比較不同藥物濃度對細胞的抑制率,從而評估該藥對腫瘤細胞的殺傷效果。ATP-TCA敏感性高,檢測速度快,完成ATP檢測僅需30 min,標本可評價率在90%以上;精密度好,變異系數小于10%;可高通量檢測,自動化程度高且穩定性好[40]。國內很多公司都已生產出ATP-TCA試劑盒并投入使用。

7.2 CD-DST試劑盒

CD-DST具有很多優點,如需要的腫瘤組織少、標本評價率高、實驗重復性好、體外實驗結果與臨床療效符合率較高等,在臨床及基礎研究,以及腫瘤患者化療方案制定中的應用已獲得肯定。目前該試劑盒在日本已得到廣泛應用。

8 結語與展望

隨著精準醫學的發展,腫瘤個體化治療是臨床亟需解決的瓶頸問題。2014年,國家藥品監督管理局等機構批準了高通量測序技術在基因測序產前篩查與診斷、胚胎植入前遺傳學診斷等生育健康領域的臨床應用試點。同年,高通量測序技術被批準在腫瘤的診斷和治療上進行臨床試點。隨著國家對精準醫學的大力扶持,腫瘤個體化用藥技術會不斷發展和改善,同時分子靶向藥物研發的速度也在加快。雖然上述技術在腫瘤患者個體化用藥中均有獨特潛力,但其應用也有一定局限性。因此,我們還需運用各類腫瘤預測模型來檢測腫瘤患者治療藥物間相互作用,以及疾病的分子靶點及其與免疫系統間相互作用,以求為腫瘤的精準用藥提供技術支持。同時可以將技術產業化,開發試劑盒,用于臨床腫瘤患者的個體化用藥篩選。

作者聲明：伍曉曉、賈艷艷和王婧雯參與了研究設計;伍曉曉、劉美佑、彭莉、程梁華和王番參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。